本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)酶解技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種藻藍(lán)蛋白降血糖肽的制備方法。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WTO)統(tǒng)計(jì)，全球約有3.5億多人飽受糖尿病痛苦的折磨，我國(guó)糖尿病人約占全世界糖尿病人口的三分之一。傳統(tǒng)的降血糖藥物包括，a-葡萄糖苷酶抑制劑、雙胍類(lèi)藥物、胰島素等治療存在副作用，長(zhǎng)期使用患者難以接受。近年來(lái)，通過(guò)食療達(dá)到控制血糖的方法越來(lái)越受到人們的青睞，其中開(kāi)發(fā)新的a-葡萄糖苷酶抑制劑是眾多學(xué)者的努力方向。

藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，又稱(chēng)PC)是一種存在于紅藻和藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的光合輔助色素，能高效捕獲光能。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性，對(duì)它的研究已經(jīng)成為研究天然海洋藥物的熱點(diǎn)。我國(guó)對(duì)藻藍(lán)蛋白的研究始于20世紀(jì)70年代，經(jīng)過(guò)了30多年來(lái)的研究開(kāi)發(fā)，雖然有了較大的進(jìn)展，但大都處于實(shí)驗(yàn)室水平。同時(shí)，以藻藍(lán)蛋白為主的功能性食品不多，在藥品的研究開(kāi)發(fā)方面還是空白。酶水解可以提高蛋白質(zhì)的功能特性，得到的肽具有一些蛋白質(zhì)無(wú)法比擬的物理化學(xué)特性。如果采用酶解的方法將藻藍(lán)蛋白降解為可溶性寡肽，則可大大提高其在食品中的理化性能，并可能獲得其前體沒(méi)有的生理活性。然而現(xiàn)有的藻藍(lán)蛋白酶解方法，通常是采用單一的酶解技術(shù)對(duì)藻藍(lán)蛋白進(jìn)行酶解，存在蛋白水解效率低下的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于此，有必要提供了一種蛋白水解效率較高的藻藍(lán)蛋白降血糖肽的制備方法。

一種藻藍(lán)蛋白降血糖肽的制備方法，包括如下步驟：

將水加入藻藍(lán)蛋白中，攪拌使其充分溶解，得到藻藍(lán)蛋白溶液；

將所述藻藍(lán)蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至8.0～10.0，接著加入堿性蛋白酶，攪拌均勻后，微波輔助酶解，得到酶解體系；

將所述酶解體系于恒溫振蕩器中繼續(xù)酶解，pH保持在8.0～10.0，得到酶解產(chǎn)物；

將所述酶解產(chǎn)物滅酶后冷卻，離心，取上清，即為酶解液；

將所述酶解液進(jìn)行超濾處理，得到超濾液；

將所述超濾液進(jìn)行真空濃縮，冷凍干燥處理得到所述藻藍(lán)蛋白降血糖肽。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述微波輔助酶解的溫度為50～60℃，微波處理時(shí)間為5～15min。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述酶解體系于恒溫振蕩器中繼續(xù)酶解的反應(yīng)溫度為50～60℃，酶解時(shí)間為1.5～3.0h。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，將水加入藻藍(lán)蛋白中，攪拌使其充分溶解，得到藻藍(lán)蛋白溶液的操作中，藻藍(lán)蛋白和水的料液比為1:10～1:50。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，將水加入藻藍(lán)蛋白中，攪拌使其充分溶解，得到藻藍(lán)蛋白溶液的操作中，采用恒溫磁力攪拌，溫度為50℃～55℃。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，堿性蛋白酶和藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量比為1:30～1:20。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，微波輔助酶解的操作中，微波功率為500～1000w。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述滅酶的操作為將所述酶解產(chǎn)物升溫至85℃～95℃并保溫5～15min。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，超濾處理中使用的超濾膜為截留分子質(zhì)量為3～5kD超濾膜。

上述藻藍(lán)蛋白降血糖肽的制備方法，采用微波和恒溫振蕩輔助酶解，能夠大大縮短酶解時(shí)間，提高藻藍(lán)蛋白的酶解效率，便于工業(yè)化生產(chǎn)，所得到的藻藍(lán)蛋白降血糖肽具有較強(qiáng)的降血糖活性，有助于藻藍(lán)蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。

附圖說(shuō)明

圖1為一實(shí)施方式的藻藍(lán)蛋白降血糖肽的制備方法的流程圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)例僅以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

請(qǐng)參考圖1，一實(shí)施方式的藻藍(lán)蛋白降血糖肽的制備方法，包括如下步驟：

S10、將水加入藻藍(lán)蛋白中，攪拌使其充分溶解，得到藻藍(lán)蛋白溶液。

其中，藻藍(lán)蛋白的純度A₆₂₀/A₂₈₀>2。藻藍(lán)蛋白和水的料液比可以為1:10～1:50。

S10的操作中，采用恒溫磁力攪拌使藻藍(lán)蛋白溶解，溫度可以為50℃～55℃。

S20、將藻藍(lán)蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至8.0～10.0，接著加入堿性蛋白酶，攪拌均勻后，微波輔助酶解，得到酶解體系。

其中，微波輔助酶解的溫度為50～60℃，微波處理時(shí)間為5～15min。

其中，堿性蛋白酶的酶活力可以為2×10⁵U/g～8×10⁵U/g。堿性蛋白酶和藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量比可以為1:30～1:20。微波功率可以為500～1000w。進(jìn)一步的，可以采用1M氫氧化鈉進(jìn)行藻藍(lán)蛋白溶液的pH調(diào)節(jié)。

S30、將酶解體系于恒溫振蕩器中繼續(xù)酶解，pH保持在8.0～10.0，得到酶解產(chǎn)物。

其中，將酶解體系于恒溫振蕩器中繼續(xù)酶解的反應(yīng)溫度為50～60℃，酶解時(shí)間為1.5～3.0h。

S40、將酶解產(chǎn)物滅酶后冷卻，離心，取上清，即為酶解液。

其中，滅酶的操作為將酶解產(chǎn)物升溫至85℃～95℃并保溫5～15min。升溫速率可以為20～30℃/min。

S50、將酶解液進(jìn)行超濾處理，得到超濾液。

超濾處理中使用的超濾膜可以為截留分子質(zhì)量為3～5kD超濾膜。

S60、將超濾液進(jìn)行真空濃縮，冷凍干燥處理得到藻藍(lán)蛋白降血糖肽。

上述藻藍(lán)蛋白降血糖肽的制備方法，采用微波和恒溫振蕩輔助酶解，能夠大大縮短酶解時(shí)間，提高藻藍(lán)蛋白的酶解效率，便于工業(yè)化生產(chǎn)，所得到的藻藍(lán)蛋白降血糖肽具有較強(qiáng)的降血糖活性，有助于藻藍(lán)蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。

下面為具體實(shí)施例部分。

實(shí)施例1

(1)稱(chēng)取10g藻藍(lán)蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入300mL蒸餾水，于恒溫磁力攪拌器上攪拌使其充分溶解，得到藻藍(lán)蛋白溶液；

(2)將步驟(1)所得的藻藍(lán)蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至9，然后按藻藍(lán)蛋白重量的3％加入堿性蛋白酶(酶活力4×10⁵U/g)，攪拌均勻后，微波輔助酶解，微波功率為600W，溫度控制為60℃，10min停止微波，然后所得酶解體系于恒溫振蕩器中繼續(xù)酶解，反應(yīng)溫度55℃，pH保持在9，酶解時(shí)間2h，接著將反應(yīng)產(chǎn)物迅速升溫至90℃并保溫5min，滅酶后冷卻至35℃，10000r/min離心10min，取上清，即為酶解液，測(cè)定此時(shí)酶解液水解度(DH)為26.1％；

(3)采用截留分子質(zhì)量為3kD超濾膜將步驟(2)所得酶解液進(jìn)行超濾處理，接著將所得超濾液進(jìn)行真空濃縮，冷凍干燥得到藻藍(lán)蛋白降血糖肽。對(duì)所得藻藍(lán)蛋白降血糖肽進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制分析，其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高為51.8±1.9％，IC₅₀值為0.62mg/mL，說(shuō)明所制備的藻藍(lán)蛋白降解肽具有顯著的降血糖作用。

藻藍(lán)蛋白水解度(DH)的測(cè)定

根據(jù)消耗的堿量進(jìn)行計(jì)算，即pH-stat法。水解度＝(水解的肽鍵數(shù)/總肽鍵數(shù))×100％，即：

DH＝V_NaOH·N_NaOH/(a·M_p·h_tot)

式中，V_NaOH：滴定消耗的堿體積(mL)；N_NaOH：滴定消耗的堿濃度(mol/L)，采用0.1mol/L的NaOH；M_p：蛋白總量(g)；h_tot：每克蛋白中肽鍵總數(shù)(mmol/g，藻藍(lán)蛋白取8.0)；a：a-氨基酸解離度，a＝10^pH-pK/(1+10^pH-pK)；pK：a-氨基酸的平均pK按7.0計(jì)算；pH：反應(yīng)起始pH。

α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定

以磷酸緩沖液作為對(duì)照，向不同濃度的待測(cè)樣品中加入50μLα-葡萄糖苷酶溶液(25mg/mL)、50μL的PNPG溶液(0.9133mg/mL)及120μL的磷酸緩沖溶液(0.5M、pH6.7)，混勻后于37℃下保溫60min，再加入0.67M的Na₂CO3溶液終止反應(yīng),并于405nm下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值，然后按照以下公式計(jì)算待測(cè)樣品的α-葡萄糖苷酶抑制率：

$I\left(\%\right)=\frac{A_0-A_1}{A_0}\×100\%$

式中：

I－α-葡萄糖苷酶抑制率

A₀—對(duì)照組吸光度值

A₁—樣品組吸光度值

以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以α-葡萄糖苷酶抑制率為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)，得出相關(guān)性方程，通過(guò)計(jì)算求出α-葡萄糖苷酶抑制率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度即為IC₅₀。

實(shí)施例2

(1)稱(chēng)取10g藻藍(lán)蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入500mL蒸餾水，于恒溫磁力攪拌器上攪拌使其充分溶解，得到藻藍(lán)蛋白溶液；

(2)將步驟(1)所得的藻藍(lán)蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至10，然后按藻藍(lán)蛋白重量的3％加入堿性蛋白酶(酶活力2×10⁵U/g)，攪拌均勻后，微波輔助酶解，微波功率為500W，溫度控制為60℃，15min停止微波，然后所得酶解體系于恒溫振蕩器中繼續(xù)酶解，反應(yīng)溫度50℃，pH保持在10，酶解時(shí)間1.5h，接著將反應(yīng)產(chǎn)物迅速升溫至95℃并保溫5min，滅酶后冷卻至30℃，10000r/min離心10min，取上清，即為酶解液，測(cè)定此時(shí)酶解液水解度(DH)為23.6％；

(3)采用截留分子質(zhì)量為3kD超濾膜將步驟(2)所得酶解液進(jìn)行超濾處理，接著將所得超濾液進(jìn)行真空濃縮，冷凍干燥得到藻藍(lán)蛋白降血糖肽，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制分析，其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高為50.3±1.7％，IC₅₀值為0.69mg/mL，說(shuō)明所制備的藻藍(lán)蛋白降解肽具有顯著的降血糖作用。

實(shí)施例3

(1)稱(chēng)取10g藻藍(lán)蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入500mL蒸餾水，于恒溫磁力攪拌器上攪拌使其充分溶解，得到藻藍(lán)蛋白溶液；

(2)將步驟(1)所得的藻藍(lán)蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至8，然后按藻藍(lán)蛋白重量的5％加入堿性蛋白酶(酶活力4×10⁵U/g)，攪拌均勻后，微波輔助酶解，微波功率為1000W，溫度控制為50℃，5min停止微波，然后所得酶解體系于恒溫振蕩器中繼續(xù)酶解，反應(yīng)溫度60℃，pH保持在8，酶解時(shí)間3h，接著將反應(yīng)產(chǎn)物迅速升溫至85℃并保溫10min，滅酶后冷卻至40℃，10000r/min離心10min，取上清，即為酶解液，測(cè)定此時(shí)酶解液水解度(DH)為25.5％；

(3)采用截留分子質(zhì)量為5kD超濾膜將步驟(2)所得酶解液進(jìn)行超濾處理，接著將所得超濾液進(jìn)行真空濃縮，冷凍干燥得到藻藍(lán)蛋白降血糖肽，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制分析，其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高為52.3±1.8％，IC₅₀值為0.65mg/mL，說(shuō)明所制備的藻藍(lán)蛋白降解肽具有顯著的降血糖作用。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。