本發(fā)明屬于高分子多糖制備
技術領域：
。具體涉及一種取代度適宜的羧甲基茯苓多糖（cmp）的制備方法，利用該方法制備的cmp可用于制藥、保健品、食品、化妝品和飼料等領域。
背景技術：
：茯苓是一種藥食兼用真菌，具有利水滲濕，健脾寧心等的功效，有著良好的藥用、食用及保健價值。茯苓含有多種化學成分，主要成分是占茯苓干重90%的茯苓多糖。其中只有1%茯苓多糖可以溶解于水中，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，水性茯苓多糖具有抗腫瘤、增強免疫的生物活性。其余的堿溶性茯苓多糖則不具有生物活性功能，大部分被當成藥渣棄去，造成嚴重浪費。通過化學改性的方法，引入合適的離子基團能夠顯著改善天然多糖的水溶性，改變其在水溶液中的鏈構(gòu)象，從而顯著提高天然多糖的生物活性。不同的取代基團、取代位置和取代度對多糖衍生物的活性有著重要影響。羧甲基茯苓多糖（cmp）是通過羧甲基化反應，在茯苓多糖分子中引入羧甲基，顯著增強了茯苓多糖水溶特性和生物學活性?，F(xiàn)代藥理學研究表明，cmp具有較強的抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)機體免疫功能，可廣泛用于惡性腫瘤放化療的輔助治療，顯著增強惡性腫瘤患者的免疫功能，能減輕癌癥患者放療、化療的毒副反應，并使患者的免疫功能得到改善，增強體質(zhì)。羧甲基茯苓多糖的制備技術已有許多文獻和專利報道，但現(xiàn)有制備技術仍然存在制備時間過長、制備產(chǎn)物活性不穩(wěn)定以及顏色不理想等一系列問題，無法充分發(fā)揮茯苓多糖的資源優(yōu)勢。許多研究者也試圖改善現(xiàn)有技術，如在申請?zhí)枮?01410603964.5的專利（一種羧甲基茯苓多糖的制備方法及其新用途）中提到，采用催化劑技術，通過向反應體系中添加用量為茯苓粉10~20%的催化劑，可以顯著提高茯苓多糖羧甲基化效率。但該方法不僅降低了制備產(chǎn)物的純度，而且大大增加了cmp食用安全隱患；在申請?zhí)枮?01210375000.0的專利（一種羧甲基茯苓多糖的制備方法）中提到，通過加入2~5%雙氧水溶液脫色2~24小時來改善反應產(chǎn)物的色澤。但該方法不僅增加了制備工序，延長制備時間，同時，使用雙氧水對cmp的活性造成損失；多糖衍生物活性高低于引入的離子基團、取代度、取代位置、水溶性和鏈的構(gòu)象有關，cmp取代度越高，在水中的溶解度越大。在申請?zhí)枮?00610163425.x專利（高取代度羧甲基茯苓多糖及其制備方法和其應用）中提到，提高cmp的羧甲基取代度（d·s）使其不低于1.0，明顯提高cmp的溶解度。在本發(fā)明研究中發(fā)現(xiàn)，取代度過大或過小都影響cmp的生物活性，而cmp在取代度（d·s）為0.7時，既有良好的水溶性，又有優(yōu)異和穩(wěn)定的生物活性。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的旨在針對現(xiàn)有制備技術的缺陷，提供一種制備取代度適宜的羧甲基茯苓多糖的方法，以實現(xiàn)提高茯苓多糖羧甲基化效率，縮短反應時間，所獲得的反應產(chǎn)物的取代度適宜，水溶解性好，活性穩(wěn)定，色澤更好等的目的。本發(fā)明提供的技術方案是：一種取代度適宜的羧甲基茯苓多糖制備新方法，先將干燥過的茯苓菌核進行粉碎過80或100目篩，得到粒度均勻的茯苓粉；以60co-γ為輻照源，對茯苓粉進行輻照；以輻照后的茯苓粉作為羧甲基化反應底物，加入乙醇溶液進行溶脹；溶脹后，加入氫氧化鈉，進行堿化反應，反應結(jié)束后，冷卻；然后，加入氯乙酸和過量的氫氧化鈉與茯苓全粉進行羧甲基化反應，得到取代度在0.7左右的羧甲基茯苓多糖。具有工藝流程如圖1所示。具體步驟是：輻照時，所述60co-γ為輻照源輻照劑量為9kgy~27kgy。所述乙醇溶液濃度為85%，溶脹料液比為酒精溶液∶茯苓粉=5∶1或6∶1或7∶1。堿化反應中所述的氫氧化鈉加入的量為茯苓粉質(zhì)量的0.3～0.4倍；加入氫氧化鈉之后進行攪拌，堿化反應0.5~1h，反應溫度為40～60℃。反應結(jié)束后，應進行冷卻，冷卻至溫度10～30℃。羧甲基化反應中所述氯乙酸的加入量為茯苓粉質(zhì)量的0.8～1.2倍，使茯苓粉和氯乙酸在過量的氫氧化鈉下進行醚化反應3～4h，反應溫度為50～70℃，反應完畢后，用冰乙酸調(diào)至ph至5.0～6.0，用體積分數(shù)80～90%的乙醇洗滌3～5次，除去多余氯離子，并洗至白色或淡黃色，在50℃溫度條件下干燥。本發(fā)明所述的取代度適宜的羧甲基茯苓多糖是通過上述生產(chǎn)工藝制備而成的。本發(fā)明所述的取代度適宜的羧甲基茯苓多糖粉經(jīng)小鼠急性毒性試驗證明是安全無毒性的。此外，針對原有技術工藝缺陷，本發(fā)明進行如下改進：我們研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖經(jīng)過以60co-γ為輻照源輻照后，由圖3的紅外光譜圖上可以看到，1750cm-1～1650cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，同時1165cm-1和1024cm-1處的c-o-c和c-o吸收峰強度有所變化。1750cm-1～1650cm-1為c=o在第三峰區(qū)的特征吸收峰，表明茯苓多糖輻照處理后有含羰基化合物生成，說明一定劑量輻照使茯苓多糖發(fā)生了降解，其分子量減小。本發(fā)明增加輻照工藝可以顯著提高羧甲基化效率和原輔料的利用率，縮短一半的反應時間（約3小時），節(jié)約成本。由于輻照后的茯苓多糖發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化，羧甲基化反應參數(shù)也需做相應調(diào)整。在制備cmp過程中，我們研究發(fā)現(xiàn)，cmp取代度大小于與乙醇溶液溶脹時的料液比有關，需要控制乙醇溶液和茯苓粉之間的料液比例5∶1或6∶1或7∶1范圍內(nèi)。在制備過程中的堿化反應，我們研究發(fā)現(xiàn)，氫氧化鈉加入的量、攪拌速度、反應時間對cmp取代度（d·s）有影響，應加以控制。在羧甲基化反應中，我們研究發(fā)現(xiàn)，氯乙酸和氫氧化鈉添加量、反應溫度和反應時間對cmp取代度（d·s）有影響，應加以控制。在羧甲基化反應中，我們研究發(fā)現(xiàn)，反應體系在30～70℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，反應速率增加，取代度增大，但溫度高于70℃時，反應產(chǎn)物顏色加深，白度低于60。因此，在堿化反應結(jié)束后，增加冷卻工藝，控制羧甲基化反應體系的溫度不超過70℃，所得反應產(chǎn)物白度大于80。附圖說明圖1：是羧甲基茯苓多糖粉的工藝流程圖。圖2：是未改性的茯苓粉的紅外光譜圖。圖3：是輻照后茯苓粉的紅外光譜圖。圖4：是羧甲基茯苓多糖粉的紅外光譜圖。具體實施方式實施例11.取代度0.7左右的羧甲基茯苓多糖制備取1kg過100目篩的茯苓粉，以60co-γ為輻照源輻照24h，加入5.0l85%乙醇在室溫下攪拌溶脹30min，再加入0.3～0.5kg的氫氧化鈉（用少量乙醇溶解）在50℃下攪拌堿化0.5～1.0h。堿化后，冷卻反應體系至30℃以下，然后再加入0.3～0.5kg氫氧化鈉（用少量乙醇溶解）和0.8～1.0kg氯乙酸，在50～70℃溫度條件下醚化3.0h。反應完畢后，用體積分數(shù)80%的乙醇洗滌4次，除去多余氯離子。在40～50℃下干燥7～10h，干燥，過40目篩，得到取代度為0.7左右的羧甲基茯苓多糖粉。所得白色粉末即為羧甲基茯苓多糖粉，經(jīng)檢驗后包裝出廠。2.測定羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度（d·s）d·s按照灰堿法測定，測定方法如下：將已充分干燥后的改性產(chǎn)品連同瓷堝鍋放進高溫爐，700±25℃灼燒30min，冷卻后先用少量水潤濕含有焦粒的灰白粉末，然后洗移至燒杯中(總量不超150ml)，加入甲基紅指示劑3滴，用0.05mol/lh2so4滴到顯紅色后，再從滴定管放入10ml，記下h2so4總用量a，將溶液放在電爐上加熱，使之輕輕沸騰10min，不必冷卻，即用0.1mol/l的naoh溶液滴定至變黃色為止，記下其用量b。計算公式:取代度（d·s）=0.162b/(l－0.08b)b=(a*nl－b*n2)/wa一硫酸標準溶液用量(ml)b一氫氧化鈉標準溶液用量(ml)nl一硫酸標準溶液當量濃度(0.05mol/l)n2一氫氧化鈉標準溶液當量濃度(0.lmol/l)w一樣品重量(g)本發(fā)明制備的cmp的取代度（d·s）=0.69023.羧甲基茯苓多糖的結(jié)構(gòu)確認茯苓多糖粉和羧甲基茯苓多糖粉的傅里葉紅外光譜圖分別如附圖2和圖4所示。由附圖3，羧甲基茯苓多糖粉紅外圖譜中出現(xiàn)了1601cm-1（強）和1425cm-1（中）兩個新的吸收峰，前者為c=o鍵伸縮振動峰，后者為與羧基相連的次甲基剪式振動，1074cm-1左右的吸收峰增強，為醚鍵c-o-c與c-oh鍵的疊加峰，此外，原茯苓多糖中表征β-吡喃糖環(huán)的889cm-1的吸收峰改性后消失，也進一步證實了茯苓多糖羧甲基化反應的發(fā)生。4.羧甲基茯苓多糖的質(zhì)量檢驗本發(fā)明制備的羧甲基茯苓多糖粉的理化指標如下：羧甲基茯苓多糖為白色或淡黃色粉末狀。羧甲基茯苓多糖≥80%；溶解度≥80%。白度≥80羧甲基茯苓多糖粉的衛(wèi)生指標如下：鉛（pb），mg/kg≤1；砷（as），mg/kg≤0.5；菌落總數(shù)，cfu/g≤1000；大腸菌群，mpn/100g≤90；霉菌，cfu/g≤50；致病菌不得檢出。5.羧甲基茯苓多糖對小鼠急性毒性試驗取40只小鼠（購自湖北省疾病預防控制中心），隨機分為4組，每組10只（雌雄各半），實驗前16h禁食不禁水。將本發(fā)明生產(chǎn)的羧甲基茯苓多糖粉配成溶液，按生理鹽水對照組、高劑量組（21g/kg·bw）、中劑量組（14.7g/kg·bw）和低劑量組（10.3g/kg·bw）經(jīng)口按0.2ml/10g.bw灌胃，連續(xù)觀察兩周后，計算小鼠存活率并頸椎脫臼致死，解剖并肉眼觀察臟器變化，測定臟器系數(shù)。結(jié)果見表2。表2本發(fā)明生產(chǎn)的羧甲基茯苓多糖對小鼠的急性毒性試驗結(jié)果組別劑量動物數(shù)死亡數(shù)肝（mg/g）腎（mg/g）胸腺（mg/g）脾（mg/g）對照組08047.14±4.2213.64±1.382.27±0.242.81±0.66高劑量21g/kg·bw8049.21±6.2614.58±2.642.30±0.292.80±0.26中劑量14.7g/kg·bw8047.99±5.2614.78±1.062.28±0.262.80±0.18低劑量10.3g/kg·bw8048.65±3.8515.07±1.352.31±0.242.78±0.74結(jié)果表明，受試小鼠均未出現(xiàn)死亡和其他中毒癥狀，高中低劑量組小鼠的肝、腎、脾及胸腺臟器系數(shù)的影響與對照組相比沒有顯著差異（p>0.05），這表明使用羧甲基茯苓多糖粉后不會造成小鼠內(nèi)臟造成損害，且ld50>21g/kg·bw，根據(jù)食品安全等級分級原則，確定本發(fā)明的羧甲基茯苓多糖粉是安全無毒性的。實施例2食品用改性茯苓粉在果凍中的應用舉例羧甲基茯苓多糖粉的制備:按照實施例1所述的方法制備。凝膠持水性的測定：將制備好的凝膠樣品倒入容器中密封，在常溫下儲存。將凝膠樣品析出的液體倒去并用濾紙吸干樣品表面水份，稱量樣品質(zhì)量，每天測定1次，連續(xù)測定1周。計算方法：持水率（%）=（1－析出的液體總量/凝膠樣品質(zhì)量）×100凝膠強度的測定：樣品凝膠強度采用tx.atplus型質(zhì)構(gòu)儀測定，測定條件為：探頭p/0.5，測定模式和選項為測定壓縮力，壓縮前探頭運行速度為3.0mm/s，壓縮過程中的運行速度為1.0mm/s，返回速度為為10.0mm/s，測定距離20mm，感應力5g，數(shù)據(jù)采集200pps。利用羧甲基茯苓多糖粉制備果凍的具體步驟：將1.5%卡拉膠緩慢加入80℃適量熱水中，卡拉膠粉加入時要邊溶解邊攪拌，直至形成組織均一的膠溶液。按表3所示的配方量要求分別稱取羧甲基茯苓多糖粉、氯化鉀、苯甲酸鈉等，在常溫下分別溶于少量的水中，待膠液溫度低于50℃時用4層紗布過濾上述配料，加入膠液中并攪拌均勻。將混合均勻的凝膠溶液倒入合適容器中，置于20℃溫度條件下冷卻成型。然后分別測定其凝膠強度和持水率。結(jié)果表明，添加0.8%羧甲基茯苓多糖粉的卡拉膠凝膠強度達到最佳，添加1%羧甲基茯苓多糖粉的卡拉膠的持水性達到最佳。分別將不加添加羧甲基茯苓多糖粉m（卡拉膠）：m（羧甲基茯苓多糖粉）=1.5∶0.8和1.5∶1.0、添加0.2%氯化鉀配置成果凍，在對其色澤、透明狀態(tài)和組織狀態(tài)等指標進行比較。結(jié)果見表3。表3不同配方的卡拉膠對果凍品質(zhì)的影響比較分析表明用單一卡拉膠制成的果凍在凝膠強度、持水性、彈性和口感方面都較差。在卡拉膠中添加氯化鉀可以使果凍凝膠強度大大提高，但脫液析水現(xiàn)象無法解決。而在卡拉膠中添加羧甲基茯苓多糖粉既可以提高果凍產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，同時多糖與蛋白質(zhì)分子間通過共價鍵結(jié)合形成復合物從而最終影響到凝膠體結(jié)構(gòu)類型，使得其凝膠強度和持水性得以提高，并且改善凝膠的組織性能和質(zhì)地，能有效的提高果凍產(chǎn)品的凝膠強度、彈性、持水性和口感。實施例3羧甲基茯苓多糖粉在桃酥中的應用舉例羧甲基茯苓多糖粉的制備:按照實施例1所述的方法制備。茯苓桃酥工藝配方為新鮮豬油、雞蛋、低筋面粉、奶粉、香甜泡打粉、蘇打粉、白砂糖經(jīng)磨細后過篩（200目）。取煉制好的豬油600g，低筋面粉1kg，白砂糖粉0.5kg、雞蛋200g、奶粉40g、香甜泡打粉30g、蘇打粉30g。色度的測定：采用色度計對樣品色度進行測定，型色度計對樣品進行色度測量。其中，l*值越大，桃酥越白（亮）；a*、b*值分別代表桃酥紅綠度和黃藍度，正a*表示紅色，a*值越大，桃酥越紅；正b*值表示黃色，b*值越大，桃酥越黃；每個樣品重復測十次，取平均值。硬度的測定：質(zhì)構(gòu)儀對茯苓桃酥硬度與破裂性進行測定。探頭型號為p6型；測前探頭下降速率為1.0mm/sec；測試速率為0.5mm/sec；測后探頭回程速率為10.0mm/sec；下壓程度為30％；數(shù)據(jù)采集速率為500pps；觸發(fā)力值為5.0g；每次重復10次；測定時，每次對不同添加量的茯苓桃酥隨機挑選3個樣品，放置在載物臺上進行測定，每個樣品測試一次，選取偏近平均值的一條最佳質(zhì)構(gòu)曲線進行數(shù)據(jù)分析。利用羧甲基茯苓多糖粉制備桃酥的具體步驟：取糖粉、雞蛋、豬油、泡打粉、蘇打粉混勻20min；加入低筋面粉混和成均勻面團；將混和好后的面團分揉成30g的小圓團后，分別加入羧甲基茯苓多糖粉和未改性的茯苓粉，各占面團質(zhì)量的質(zhì)量分數(shù)從3％～10％，混勻；將待烤面團壓制于烤盤上成型后放置于烤箱中烘烤約20min，面火170℃～180℃，底火150℃～160℃。通過感官評定添加不同量的改性茯苓粉對桃酥品質(zhì)的影響，結(jié)果見表4。表4添加不同量未改性茯苓粉和羧甲基茯苓多糖粉對桃酥品質(zhì)的影響比較分析表明相同添加量下的未改性茯苓粉和羧甲基茯苓多糖粉兩種桃酥，添加羧甲基茯苓多糖粉的桃酥外觀色澤、內(nèi)部質(zhì)地和口感均為最佳。同一添加成分，不同添加量下，茯苓桃酥的色澤逐漸偏白，質(zhì)地與口感隨著添加量的增加依次降低。添加羧甲基茯苓多糖粉的桃酥味感較為平和，茯苓味道也不像前兩類明顯，面團質(zhì)量的4％與5％添加量的桃酥產(chǎn)品在相同添加量下與添加未改性茯苓粉的樣品相比，截面灰色部分幾乎沒有，口感更佳。6％～7％之間時桃酥中間淺灰色部分開始有少量凸現(xiàn)。因此，小于面團質(zhì)量7％的添加量均可，4％～6％之間為最佳值。實施例4羧甲基茯苓多糖粉在固體飲料中的應用舉例羧甲基茯苓多糖粉的制備:按照實施例1所述的方法制備。固體飲料的配方：改性茯苓粉20g，乳清蛋白185g，大豆油180g，維生素混合物140g，礦物質(zhì)混合物230g，麥芽糊精595g。感官評價指標如表5所示。表5固體飲料的感官評價指標利用改性茯苓粉制備固體飲料的具體步驟：根據(jù)配方要求，各種原料按重量從大到小的順序加入到混和機中混和，其中礦物質(zhì)混合物和維生素混合物與配方中麥芽糊精預先混和，再加入混和機中第二次混和，混和后造粒，分包，最后進行外包裝，封箱、檢測，合格為成品。當前第1頁12