新型澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原的制作方法
本發(fā)明涉及一種多肽，其包括選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅(jiān)果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其抗原變體，優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)或其抗原變體。
對(duì)樹(shù)堅(jiān)果的過(guò)敏反應(yīng)可以是嚴(yán)重的和危及生命的。這適用于常見(jiàn)的品種，例如榛子，花生，核桃，也適用于澳洲堅(jiān)果，其為澳大利亞常青樹(shù)(四葉澳洲堅(jiān)果(macadamiatetraphylla)和澳洲堅(jiān)果(m.integrifolia))的果實(shí)。
澳洲堅(jiān)果(就植物學(xué)而言，其是種子)不像許多其它樹(shù)堅(jiān)果一樣是常見(jiàn)的食物，但其越來(lái)越頻繁地被生吃或烘焙食用，并且常常被添加至各種食物例如小吃棒、谷物和混合堅(jiān)果。碎澳洲堅(jiān)果膳食正在成為烘焙食品中日益流行的成分，冷壓澳洲堅(jiān)果油亦如此。絕非少數(shù)情況的是，澳洲堅(jiān)果常常可用作堅(jiān)果混合物的一部分，并因此在先前不進(jìn)口其的國(guó)家中銷(xiāo)售。
在敏化個(gè)體中因暴露于澳洲堅(jiān)果而引起的過(guò)敏反應(yīng)可包括嚴(yán)重的癥狀(pallares,d.e.(2000):allergytomacadamianut.annallergyasthmaimmunol2000；85(5):385-6)。因此，患有過(guò)敏的受試者知曉過(guò)敏原的來(lái)源是至關(guān)重要的，因?yàn)樗麄冃枰苊饨佑|含有任何過(guò)敏原或已接觸過(guò)任何過(guò)敏原的食品、化妝品和其它產(chǎn)品。
過(guò)敏可以使用常規(guī)皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)來(lái)診斷，所述試驗(yàn)涉及將懷疑患有過(guò)敏的受試者的皮膚暴露于潛在致敏性果實(shí)的提取物，并用合適的對(duì)照進(jìn)行補(bǔ)充。然而，假陰性結(jié)果經(jīng)常發(fā)生，因?yàn)槟承┻^(guò)敏原可能以不足夠低的濃度存在于這些提取物中(sicherer,s.h.,teuber,s.s.(2004):currentapproachtothediagnosisandmanagementofadversereactionstofoods.journalofallergyandclinicalimmunology2004；114.5,1146–50)。另外，特定的過(guò)敏原可以在提取物中進(jìn)行蛋白水解(rancé,f.,juchet,a.,brémont,f.,dutau,g.(1997):correlationbetweenskinpricktestsusingcommercialextractsandfreshfoods,specificigeandfoodchallenges.allergy1997；52.10,1031–5)。此外，基于全提取物的測(cè)定由于交叉反應(yīng)性而不夠特異。
因此，期望基于針對(duì)特異性過(guò)敏原的抗體例如ige或igg的檢測(cè)來(lái)設(shè)計(jì)測(cè)定。這樣的測(cè)定涉及將包含抗體的患者樣品暴露于固定化的過(guò)敏原，隨后進(jìn)行檢測(cè)，任選地定量結(jié)合至固定化的過(guò)敏原的ige抗體(volcheck,g.w.(2009):clinicalallergy,diagnosisandmanagement)。
主要過(guò)敏原已在一系列堅(jiān)果中被鑒定。例如，花生過(guò)敏的絕大多數(shù)病例與對(duì)儲(chǔ)存蛋白arah2、arah7和arah6的敏感性相關(guān)。因此，已經(jīng)設(shè)計(jì)了基于針對(duì)這些過(guò)敏原的ige抗體的檢測(cè)的合理可靠的測(cè)定(codreanu,f.,collignon,o.,roitel,o.,thouvenot,b.,sauvage,c.,vilain,a.c.,cousin,m.o.,decoster,a.,renaudin,j.m.,astier,c.,monnez,j.m.,vallois,p.,morisset,m.,moneret-vautrin,d.a.,brulliard,m.,ogier,v.,castelain,m.c.,kanny,g.,bihain,b.e.,jacquenet,s.(2011):anovelimmunoassayusingrecombinantallergenssimplifiespeanutallergydiagnosis.intarchallergyimmunol2011；154(3):216-26；ep15075033.9)。
相比之下，關(guān)于澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原的身份的信息非常少。迄今為止，描述用于診斷澳洲堅(jiān)果過(guò)敏的免疫測(cè)定的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的作者必須依賴(lài)于全堅(jiān)果提取物或部分純化的提取物。例如，ghorbani等人進(jìn)行了基于檢測(cè)食品中殘留的澳洲堅(jiān)果蛋白質(zhì)的免疫測(cè)定(ghorbani,m.,morgan,m.r.a.(2010):proteincharacterisationandimmunochemicalmeasurementsofresidualmacadamianutproteinsinfoodstuffs.foodagrimmunol2010；21:347-360)。
herbst等人使用來(lái)自引起患者顯示過(guò)敏癥狀的單一批次的澳洲堅(jiān)果的全堅(jiān)果提取物(herbst,r.a.,wahl,r.,frosch,p.j.(2010):specificigereactivityandidentificationofpotentialallergensinmacadamiaallergy.jeuracaddermatolvenereol2010；24(11):1361-3)。
sathe等人報(bào)道了從包括澳洲堅(jiān)果的各種樹(shù)堅(jiān)果制備的全提取物的溶解并將其用于western印跡中(sathe,s.k.,venkatachalam,m.,sharma,g.m.,kshirsagar,h.h.,teuber,s.s.,roux,k.h.(2009):solubilizationandelectrophoreticcharacterizationofselectediblenutseedproteins.jagricfoodchem2009；57(17):7846-56)。
在缺乏特異性過(guò)敏原的情況下，提供足夠可靠的診斷是不可行的。全堅(jiān)果提取物或部分純化的提取物與類(lèi)似于皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)的缺點(diǎn)的限制(例如不穩(wěn)定性和不足的特異性，更具體地說(shuō)是假陰性結(jié)果)有關(guān)。
因此，本發(fā)明涉及的問(wèn)題是提供一種用于診斷過(guò)敏，優(yōu)選堅(jiān)果過(guò)敏，更優(yōu)選澳洲堅(jiān)果過(guò)敏的方法，以及用于這樣的方法的試劑，相較于現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定，所述方法具有改善的診斷可靠性(特別是靈敏度)。
本發(fā)明涉及的另一個(gè)問(wèn)題是提供用于鑒別診斷過(guò)敏，優(yōu)選堅(jiān)果過(guò)敏例如樹(shù)堅(jiān)果過(guò)敏的測(cè)定，更優(yōu)選用于區(qū)分對(duì)澳洲堅(jiān)果的過(guò)敏與對(duì)非澳洲堅(jiān)果的堅(jiān)果的過(guò)敏的測(cè)定，和/或用于監(jiān)測(cè)患有這種過(guò)敏的個(gè)體的治療。
本發(fā)明涉及的另一個(gè)問(wèn)題是提供可用于這樣的測(cè)定的試劑，用于制備這樣的試劑的方法和用于這樣的診斷的方法。本發(fā)明涉及的另一個(gè)問(wèn)題是提供用于治療患有對(duì)澳洲堅(jiān)果的過(guò)敏的患者的治療方法和藥物組合物。
本發(fā)明涉及的問(wèn)題通過(guò)所附的獨(dú)立和從屬權(quán)利要求的主題來(lái)解決。
在第一方面，本發(fā)明涉及的問(wèn)題通過(guò)一種多肽來(lái)解決，所述多肽包括選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅(jiān)果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其變體，優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)或其變體。所述多肽是來(lái)自四葉澳洲堅(jiān)果(macadamiatetraphylla)和澳洲堅(jiān)果(m.integrifolia)優(yōu)選澳洲堅(jiān)果的多肽。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽是分離的和/或重組的多肽。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽是融合多肽，其優(yōu)選包含用于檢測(cè)或純化的標(biāo)簽。
在第二方面，該問(wèn)題通過(guò)一種核酸來(lái)解決，所述核酸編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽，其優(yōu)選在載體中，更優(yōu)選在細(xì)胞中的載體中。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽是固定化的。
在第三方面，該問(wèn)題通過(guò)一種醫(yī)療器械來(lái)解決，所述醫(yī)療器械包含根據(jù)本發(fā)明的多肽，其中所述醫(yī)療器械優(yōu)選是診斷上有用的載體，更優(yōu)選選自包含珠子、測(cè)試條、微量滴定板、印跡的組，優(yōu)選選自包含蛋白質(zhì)印跡、線(xiàn)印跡和斑點(diǎn)印跡、玻璃表面、載玻片、生物芯片、膜、微陣列、電泳凝膠和微量滴定板的組。
在第四方面，該問(wèn)題通過(guò)包括以下步驟的方法來(lái)解決：在樣品，優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選來(lái)自人的樣品中檢測(cè)與根據(jù)本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體，所述方法優(yōu)選用于診斷堅(jiān)果過(guò)敏，更優(yōu)選用于診斷澳洲堅(jiān)果過(guò)敏。
在第五方面，該問(wèn)題通過(guò)包括下列步驟的治療疾病的方法來(lái)解決：向受試者施用或使來(lái)自受試者的樣品接觸根據(jù)本發(fā)明的多肽，
其中所述疾病優(yōu)選是堅(jiān)果過(guò)敏，更優(yōu)選是樹(shù)堅(jiān)果過(guò)敏，最優(yōu)選是澳洲堅(jiān)果過(guò)敏。
在第六方面，該問(wèn)題通過(guò)一種抗體來(lái)解決，所述抗體結(jié)合選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅(jiān)果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其變體，
優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)，
其中任選地所述抗體處于與所述澳洲堅(jiān)果蛋白或其變體的復(fù)合物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合澳洲堅(jiān)果蛋白的抗體是分離的抗體。
在第七方面，該問(wèn)題通過(guò)用于診斷疾病的測(cè)試試劑盒來(lái)解決，所述試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的多肽和任選地用于檢測(cè)包含所述多肽和根據(jù)本發(fā)明的抗體的復(fù)合物的工具。
在第八方面，該問(wèn)題通過(guò)用于分離抗體的方法來(lái)解決，所述抗體結(jié)合選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅(jiān)果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其抗原性片段，所述方法包括下列步驟：
a)在適于形成復(fù)合物的條件下，使包含所述抗體的樣品與澳洲堅(jiān)果蛋白或其變體接觸，
b)分離在步驟a)中形成的復(fù)合物，
c)解離在步驟b)中分離的復(fù)合物，和
d)使澳洲堅(jiān)果蛋白與所述抗體分離。
在第九方面，該問(wèn)題通過(guò)一種藥物組合物或疫苗來(lái)解決，所述藥物組合物或疫苗包含根據(jù)本發(fā)明的多肽，任選地另外包含藥學(xué)上可接受的載物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述樣品是包含抗體的體液，所述體液優(yōu)選選自包含全血、血清、腦脊液和唾液的組，更優(yōu)選為全血。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是ige或igg，例如igg4，優(yōu)選ige抗體。
在第十面，該問(wèn)題通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的多肽用于診斷過(guò)敏，優(yōu)選堅(jiān)果過(guò)敏，更優(yōu)選樹(shù)堅(jiān)果過(guò)敏，最優(yōu)選澳洲堅(jiān)果過(guò)敏的用途來(lái)解決。
本發(fā)明基于本發(fā)明人的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：在澳洲堅(jiān)果中存在一系列特異性過(guò)敏原，其顯示針對(duì)來(lái)自患有堅(jiān)果過(guò)敏的患者的血清的反應(yīng)性，并且可用于診斷和治療堅(jiān)果過(guò)敏，特別是澳洲堅(jiān)果過(guò)敏。此外，這些過(guò)敏原可用于區(qū)分堅(jiān)果過(guò)敏，特別是區(qū)分對(duì)澳洲堅(jiān)果的過(guò)敏與對(duì)非澳洲堅(jiān)果的堅(jiān)果的過(guò)敏。就發(fā)明人所知，這些抗原在本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有被描述。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的術(shù)語(yǔ)“樹(shù)堅(jiān)果”是選自包含以下的組的堅(jiān)果：澳洲堅(jiān)果，榛子，花生，核桃，杏仁，美洲山核桃，腰果，巴西堅(jiān)果，栗子，松子，開(kāi)心果，mongongoyeheb堅(jiān)果，石栗和智利榛子。
本發(fā)明涉及診斷上有用的載體，優(yōu)選為固相載體，用于使特異性捕獲抗體的工具(所述工具與所述載體締合)與來(lái)自受試者，優(yōu)選哺乳動(dòng)物受試者，更優(yōu)選人受試者的體液樣品接觸。載體可以直接與樣品接觸，并且允許用于特異性捕獲抗體的工具暴露于樣品中的任何抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相載體是診斷裝置，更優(yōu)選選自包含珠子、測(cè)試條、微量滴定板、印跡的組，優(yōu)選選自包含蛋白質(zhì)印跡、線(xiàn)印跡和斑點(diǎn)印跡、玻璃表面、載玻片、生物芯片、膜、微陣列、電泳凝膠和微量滴定板的組。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，診斷上有用的載體是線(xiàn)印跡(raoult,d.,anddasch,g.a.(1989),thelineblot:animmunoassayformonoclonalandotherantibodies.itsapplicationtotheserotypingofgram-negativebacteria.j.immunol.methods,125(1-2),57-65；wo2013041540)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的術(shù)語(yǔ)“線(xiàn)印跡”是指已用一種或多種用于捕獲抗體的工具(優(yōu)選各自為多肽)包被的測(cè)試條，更優(yōu)選是基于膜的。如果使用兩種或更多種工具，則它們優(yōu)選在載體上是在空間上分離的。優(yōu)選地，帶的寬度為測(cè)試條的寬度的至少30％，更優(yōu)選地40％，50％，60％，70％或80％。測(cè)試條可以包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)照帶，用于確認(rèn)其已在適當(dāng)?shù)臈l件下，特別是在存在人血清、抗體綴合物或兩者的情況下，與樣品接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間。許多線(xiàn)印跡可商購(gòu)獲得，例如獲自euroimmunag,lübeck,germany。
必要的是，用于實(shí)施本發(fā)明的樣品包含抗體，也稱(chēng)為免疫球蛋白。通常，樣品是包含受試者的全部免疫球蛋白的代表性集合的體液。然而，在提供樣品后，樣品可以經(jīng)歷進(jìn)一步的處理，這可包括分級(jí)分離、離心、富集或分離受試者的全部免疫球蛋白或任何免疫球蛋白類(lèi)別，優(yōu)選ige和/或igg4，這可影響各種類(lèi)型的免疫球蛋白的相對(duì)分布。樣品可以選自全血、血清、腦脊液和唾液，優(yōu)選血清。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品包含ige類(lèi)抗體。
必要的是，診斷上有用的載體包含用于特異性捕獲針對(duì)在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的澳洲堅(jiān)果蛋白或在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的澳洲堅(jiān)果蛋白(優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的澳洲堅(jiān)果蛋白)的抗體的工具，所述澳洲堅(jiān)果蛋白已被本發(fā)明人鑒定為澳洲堅(jiān)果豌豆球蛋白樣蛋白(macadamiavicilin-likeprotein)(多肽的數(shù)據(jù)庫(kù)登錄碼：q9spl3；編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的數(shù)據(jù)庫(kù)登錄碼：af161885)。本申請(qǐng)通篇中提及的任何數(shù)據(jù)庫(kù)代碼是指在本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日時(shí)可通過(guò)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)獲得的多肽序列。
優(yōu)選地，用于特異性捕獲這樣的抗體的這樣的工具是一種多肽，其包括選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅(jiān)果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)或在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其變體，優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)或其變體。
根據(jù)本發(fā)明，載體包括用于特異性捕獲抗體的一種或多種工具，優(yōu)選一種或多種，更優(yōu)選兩種或更多種，更優(yōu)選三種或更多種，更優(yōu)選四種或更多種這樣的工具，它們中的每一種能夠特異性捕獲不同的抗體。除了用于捕獲澳洲堅(jiān)果蛋白(優(yōu)選澳洲堅(jiān)果豌豆球蛋白樣蛋白(q9spl3))的工具以外，所述載體還可包括用于捕獲針對(duì)一種或多于一種來(lái)自包含下列蛋白質(zhì)的組的蛋白質(zhì)的抗體的工具：seqidno3(來(lái)自榛子的cora11),seqidno4(來(lái)自芝麻(sesam)的sesi3),seqidno5(來(lái)自花生的arah1),seqidno6(來(lái)自開(kāi)心果的pisv3),seqidno7(來(lái)自腰果的anao1),seqidno8(來(lái)自美洲山核桃的cari2),seqidno9(來(lái)自核桃的jugr2)；例如用于捕獲針對(duì)seqidno3的抗體的工具和用于捕獲針對(duì)seqidno4的抗體的工具。所述工具優(yōu)選固定在所述載體上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于特異性捕獲抗體的工具是與待捕獲的抗體結(jié)合的多肽或其變體，例如根據(jù)本發(fā)明的多肽或seqidno3(來(lái)自榛子的cora11),seqidno4(來(lái)自芝麻的sesi3),seqidno5(來(lái)自花生的arah1),seqidno6(來(lái)自開(kāi)心果的pisv3),seqidno7(來(lái)自腰果的anao1),seqidno8(來(lái)自美洲山核桃的cari2),seqidno9(來(lái)自核桃的jugr2)，例如用于捕獲針對(duì)seqidno3的抗體的工具和用于捕獲針對(duì)seqidno4的抗體的工具。所述工具與其附著至的不溶性載體一起可以以直接方式例如通過(guò)過(guò)濾、離心或傾析從反應(yīng)混合物中分離。所述工具可以以可逆或不可逆的方式固定。例如，如果分子經(jīng)由可以通過(guò)加入高濃度的鹽掩蔽的離子相互作用與載體相互作用，或者如果分子通過(guò)可切割的共價(jià)鍵結(jié)合，則固定是可逆的。相比之下，如果分子通過(guò)不能在水溶液中裂解的共價(jià)鍵連接到載體上，則固定是不可逆的。所述工具(優(yōu)選多肽)可以是間接固定的，例如通過(guò)固定對(duì)多肽具有親和力的抗體或其它實(shí)體，然后加入多肽并形成多肽-抗體復(fù)合物。
然而，本發(fā)明的教導(dǎo)不僅可以使用具有本申請(qǐng)中明確或隱含提及(例如通過(guò)功能、名稱(chēng)、序列或登錄號(hào))的精確序列的多肽或野生型序列來(lái)執(zhí)行，還可以使用這樣的多肽的變體來(lái)執(zhí)行。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“變體”可以指所提及的全長(zhǎng)序列的至少一個(gè)片段，更具體地，相對(duì)于全長(zhǎng)序列而言在一個(gè)或兩個(gè)末端上截短一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸或核酸序列。這樣的片段包含或編碼具有原始序列的至少10、15、25、50、75、100、150、200、300、400或500個(gè)連續(xù)氨基酸的肽或其變體。變體的總長(zhǎng)度可以是25、30、40、50、60、70、80、90、100個(gè)或更多個(gè)氨基酸。優(yōu)選的片段是seqidno：1或其變體。
變體可以與所提及的參考氨基酸序列或其片段具有至少40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％的同一性，其中除了對(duì)生物活性必需的那些氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代和/或一個(gè)或多個(gè)這樣的必需氨基酸以保守方式被替換和/或氨基酸被添加或缺失以使得多肽的生物活性至少被部分保留?，F(xiàn)有技術(shù)包括可用于比對(duì)兩個(gè)給定的核酸或氨基酸序列和計(jì)算同一性程度的各種方法，參見(jiàn)例如arthurlesk(2008),introductiontobioinformatics,oxforduniversitypress,2008，第三版。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用clustalw軟件(larkin,m.a.,blackshields,g.,brown,n.p.,chenna,r.,mcgettigan,p.a.,mcwilliam,h.,valentin,f.,wallace,i.m.,wilm,a.,lopez,r.,thompson,j.d.,gibson,t.j.,higgins,d.g.(2007):clustalwandclustalxversion2.0.bioinformatics,23,2947-2948)，應(yīng)用默認(rèn)設(shè)置。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體可以另外包含化學(xué)修飾，例如同位素標(biāo)記或共價(jià)修飾，例如糖基化，磷酸化，乙?；擊然?，瓜氨酸化，羥基化等。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于修飾多肽的方法。此外，還可以通過(guò)與其它已知多肽或其變體融合來(lái)產(chǎn)生變體。
必要的是，多肽的變體具有生物活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的生物活性是結(jié)合來(lái)自患者，優(yōu)選患有過(guò)敏，更優(yōu)選對(duì)堅(jiān)果的過(guò)敏，最優(yōu)選對(duì)澳洲堅(jiān)果的過(guò)敏的患者的過(guò)敏特異性ige抗體的能力。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的生物活性是在對(duì)堅(jiān)果，優(yōu)選樹(shù)堅(jiān)果，更優(yōu)選澳洲堅(jiān)果過(guò)敏的受試者中引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的能力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)從原始澳洲堅(jiān)果蛋白質(zhì)開(kāi)始，引入修飾點(diǎn)突變、截短等來(lái)設(shè)計(jì)變體，隨后通過(guò)測(cè)試所述變體是否結(jié)合獲自對(duì)澳洲堅(jiān)果過(guò)敏的受試者的樣品中的抗體來(lái)確認(rèn)該變體仍然具有生物活性。
變體可以使用遺傳工程方法或化學(xué)合成法制備。
可以通過(guò)蛋白質(zhì)印跡，使用來(lái)自對(duì)澳洲堅(jiān)果過(guò)敏的患者的血清(優(yōu)選如實(shí)施例中所述的)作為抗體來(lái)源來(lái)確定結(jié)合活性。
根據(jù)本發(fā)明的多肽或其變體可以是融合蛋白，即任選通過(guò)接頭與其它序列融合(優(yōu)選在n末端或c末端上)的多肽。該其它序列可以是用于檢測(cè)的標(biāo)簽，例如flag標(biāo)簽，或用于純化的標(biāo)簽，例如選自包含gst、his或mbp標(biāo)簽的組。根據(jù)本發(fā)明的示例性融合多肽顯示于seqidno：2中。
根據(jù)本發(fā)明的多肽可以以任何形式和以任何純化程度提供，從以?xún)?nèi)源形式包含所述多肽的組織、果實(shí)或細(xì)胞、更優(yōu)選過(guò)表達(dá)所述多肽的細(xì)胞、這樣的細(xì)胞的粗制或富集的裂解物到純化和/或分離的多肽(其基本上是純的)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽是天然多肽，其中本文所用的術(shù)語(yǔ)“天然多肽”是指折疊的多肽，更優(yōu)選從組織或細(xì)胞，更優(yōu)選從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織，任選地從非重組組織或細(xì)胞純化的折疊多肽。如果使用天然多肽，與其天然狀態(tài)相比，優(yōu)選是富集的。
根據(jù)本發(fā)明，多肽可以是重組蛋白，其中本文使用的術(shù)語(yǔ)“重組”是指在生產(chǎn)過(guò)程的任何階段使用遺傳工程方法產(chǎn)生的多肽，例如通過(guò)融合編碼多肽的核酸至用于在細(xì)胞或組織中過(guò)表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子或通過(guò)工程改造多肽本身的序列和/或使用用于通過(guò)遺傳工程修飾的細(xì)胞的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于工程改造核酸和編碼的多肽的方法(例如，在sambrook,j.,fritsch,e.f.andmaniatis,t.(1989),molecularcloning,csh或brownt.a.(1986),genecloning–anintroduction,chapman&hall中描述的)以及用于產(chǎn)生和純化天然或重組多肽的方法(例如由gehealthcarelifesciences出版的handbooks“strategiesforproteinpurification”,“antibodypurification”，以及在burgess,r.r.,deutscher,m.p.(2009):guidetoproteinpurification中描述的)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“分離的”意指多肽相對(duì)于在整個(gè)堅(jiān)果或從整個(gè)堅(jiān)果獲得的全堅(jiān)果提取物中的全部澳洲堅(jiān)果蛋白，優(yōu)選澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原，已被富集。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽是分離的多肽，其中術(shù)語(yǔ)“分離的”意指該多肽相較于其在使用生物技術(shù)或合成方法產(chǎn)生后的狀態(tài)已被富集并且優(yōu)選是純的，即所使用的多肽的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％由所述多肽組成，如通過(guò)sds聚丙烯酰胺凝膠電泳隨后考馬斯藍(lán)染色和目視檢查所判斷的。
根據(jù)本發(fā)明的受試者是產(chǎn)生抗體，優(yōu)選ige類(lèi)別或等同的過(guò)敏相關(guān)抗體，更優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人的抗體的動(dòng)物，包括人。
根據(jù)本發(fā)明的方法考慮了在樣品中檢測(cè)與根據(jù)本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體，所述方法優(yōu)選用于診斷堅(jiān)果過(guò)敏，更優(yōu)選用于診斷澳洲堅(jiān)果過(guò)敏。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可用于檢測(cè)樣品中的抗體的各種方法，例如選自包括免疫擴(kuò)散技術(shù)、通過(guò)ige抗體的嗜堿性粒細(xì)胞活化、免疫電泳技術(shù)、光散射免疫測(cè)定、凝集技術(shù)、標(biāo)記的免疫測(cè)定例如放射性標(biāo)記的免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定例如比色測(cè)定、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定和免疫熒光技術(shù)的組。
在許多情況下，檢測(cè)樣品中的抗體的不存在或存在(任選地意指確定抗體的濃度是否超過(guò)某些閾值，常常通過(guò)檢測(cè)限度顯示)足以用于診斷。如果可以檢測(cè)抗體，則這將是對(duì)臨床醫(yī)生的診斷有用的信息，并且表明患者患有過(guò)敏的可能性增加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以測(cè)定血清中的抗體相對(duì)于可能在平均健康受試者中發(fā)現(xiàn)的水平的相對(duì)濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)存在或不存在”意指足以核查是否可以使用合適的復(fù)合物檢測(cè)方法檢測(cè)足夠超過(guò)任何背景水平的信號(hào)，所述復(fù)合物檢測(cè)方法指示目標(biāo)抗體存在或存在比在健康受試者中所存在的更多的目標(biāo)抗體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這可以包括確定濃度是否超過(guò)對(duì)照中的濃度或超過(guò)閾值，優(yōu)選至少0.1，優(yōu)選0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、50、100，200、500、1000、10000或100000倍高于在平均健康受試者中發(fā)現(xiàn)的目標(biāo)抗體的濃度。
簡(jiǎn)言之，檢測(cè)抗體可以包括步驟a)在適于形成復(fù)合物的條件下，使包含抗體的樣品與根據(jù)本發(fā)明的多肽或其變體接觸。這可以通過(guò)使液體樣品與固定化形式(例如被固定在膜上，例如在蛋白質(zhì)印跡或線(xiàn)印跡中所使用的)的多肽接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)樣品和多肽接觸時(shí)，樣品中存在的能夠特異性結(jié)合多肽的任何抗體將進(jìn)行這樣的結(jié)合達(dá)到使包含多肽和抗體的復(fù)合物存在的效果。
隨后，進(jìn)行步驟b)，其包括分離在步驟a)中形成的所述復(fù)合物，例如通過(guò)除去樣品和任選地使用洗滌緩沖液洗滌被固定的多肽來(lái)進(jìn)行分離。
最后的步驟c)包括檢測(cè)復(fù)合物，例如通過(guò)添加可結(jié)合來(lái)自樣品的抗體的第二抗體來(lái)檢測(cè)。第二抗體可以包含標(biāo)記，例如酶或放射性同位素。或者，可以使用方法諸如化學(xué)交聯(lián)隨后sdspage或使用質(zhì)譜法來(lái)直接檢測(cè)復(fù)合物。
針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的多肽的抗體的檢測(cè)表明，供給樣品的受試者對(duì)澳洲堅(jiān)果過(guò)敏。在受試者表現(xiàn)出過(guò)敏反應(yīng)，但這樣的樣品不含有針對(duì)本發(fā)明受試者的抗體的情況下，受試者可能患有過(guò)敏，例如堅(jiān)果過(guò)敏，但對(duì)澳洲堅(jiān)果不過(guò)敏。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是診斷上有用的載體，其包含用于特異性捕獲針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體的工具。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“特異性捕獲抗體”是指特異性結(jié)合目標(biāo)抗體達(dá)到從樣品中結(jié)合和去除其而其它抗體基本上不結(jié)合并保留在樣品中的效果的能力。
根據(jù)本發(fā)明，提供了用于特異性檢測(cè)捕獲的抗體的工具，任選地作為試劑盒的一部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“特異性檢測(cè)捕獲的抗體”意指在捕獲后檢測(cè)到特異性結(jié)合至特異性捕獲抗體(其結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽)的工具的抗體，而不是樣品中存在的任何其它抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”意指該結(jié)合比其特征在于下述解離常數(shù)的結(jié)合反應(yīng)更強(qiáng)：1×10-5m，更優(yōu)選1×10-7m，更優(yōu)選1×10-8m，更優(yōu)選1×10-9m，更優(yōu)選1×10-10m，更優(yōu)選1×10-11m，更優(yōu)選1×10-12m，如通過(guò)表面等振子體共振使用biacore設(shè)備在25℃下在ph7的pbs緩沖液中測(cè)定的。
本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了試劑盒，其優(yōu)選用于診斷過(guò)敏，更優(yōu)選用于診斷澳洲堅(jiān)果過(guò)敏。這樣的試劑盒是包含實(shí)施本發(fā)明方法所需的特定試劑(特別是根據(jù)本發(fā)明的診斷上有用的載體，任選地除了實(shí)施本發(fā)明方法所需的一種或多種溶液之外，該溶液優(yōu)選選自或全部選自包括樣品稀釋緩沖液、洗滌緩沖液和包含用于檢測(cè)任何特異性捕獲的抗體例如第二抗體的工具和任選地用于檢測(cè)后者的工具的緩沖液的組)的容器。此外，其可以包括詳述如何使用試劑盒和本發(fā)明的用于使本發(fā)明的多肽與來(lái)自受試者優(yōu)選人受試者的體液樣品接觸的診斷上有用的載體(例如線(xiàn)印跡，其中將用于特異性捕獲抗體至根據(jù)本發(fā)明的多肽的工具固定在線(xiàn)印跡上)的說(shuō)明書(shū)。此外，試劑盒可以包含陽(yáng)性對(duì)照，例如已知結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽的重組抗體，和陰性對(duì)照，例如對(duì)根據(jù)本發(fā)明的多肽沒(méi)有可檢測(cè)的親和力的蛋白質(zhì)。最后，這樣的試劑盒可以包含含有用于制備校準(zhǔn)曲線(xiàn)的抗體的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
根據(jù)本發(fā)明，需要用于檢測(cè)一種或多種捕獲的抗體的工具。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以使用的許多方法，所述方法也被描述在現(xiàn)有技術(shù)中，例如在zane,h.d.(2001),immunology–theoretical&practicalconceptsinlaboratorymedicine,w.b.saunderscompany中，特別是在第14章中描述的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用結(jié)合一種或多種捕獲的抗體(其是相應(yīng)的第一抗體)的恒定區(qū)的第二抗體，所述第二抗體可以與直接檢測(cè)例如熒光、放射性或酶活性標(biāo)記(后者可以催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)或可使用比色法或光譜或其它分析方法檢測(cè)的分子的產(chǎn)生)的標(biāo)記相關(guān)聯(lián)。
或者，生物功能測(cè)定可用作檢測(cè)一種或多種捕獲的抗體的工具，條件是抗體是ige類(lèi)抗體，優(yōu)選基于通過(guò)ige抗體的嗜堿性粒細(xì)胞活化的測(cè)定。這樣的測(cè)定法已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述，例如hausmann,o.v.,gentinetta,t.,bridts,c.h.,andebo,e.g.(2009):thebasophilactivationtestinimmediate-typedrugallergy,immunol.allergyclin.n.am.29,555-566。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“診斷”是指旨在獲得在評(píng)估患者是否患有或可能或比平均或比較受試者(后者優(yōu)選地具有相似的癥狀)更可能在診斷時(shí)或在未來(lái)患有某種疾病或病癥的過(guò)程中有用的信息以發(fā)現(xiàn)疾病如何進(jìn)展或在未來(lái)可能進(jìn)展或評(píng)估患者對(duì)于某種治療(例如施用合適的藥物，例如用于使過(guò)敏患者脫敏的藥物)的反應(yīng)性的任何種類(lèi)的程序。換句話(huà)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“診斷”不僅包括診斷，而且包括預(yù)測(cè)和/或監(jiān)測(cè)疾病或病癥的過(guò)程或治療的成功。優(yōu)選檢測(cè)igg(更優(yōu)選igg4)類(lèi)別的自身抗體用于監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展和/或治療的成功。
因此，術(shù)語(yǔ)“診斷”優(yōu)選地不意味著根據(jù)本發(fā)明的診斷方法或試劑將是結(jié)論性的并且足以基于單一測(cè)試(更不用說(shuō)參數(shù))來(lái)完成診斷，而是可以指對(duì)被稱(chēng)為“鑒別診斷”(即基于一系列診斷參數(shù)考慮一系列可能條件的可能性的系統(tǒng)診斷程序)的貢獻(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“診斷”還可以指用于為患者選擇最有希望的治療方案的方法或試劑。換句話(huà)說(shuō)，所述方法或藥劑可涉及選擇用于受試者的治療方案。
本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的藥物組合物，優(yōu)選疫苗，所述組合物優(yōu)選適于施用至受試者，優(yōu)選哺乳動(dòng)物受試者，更優(yōu)選施用至人。這樣的藥物組合物可以包含藥學(xué)上可接受的載體。藥物組合物可以例如經(jīng)口、腸胃外、通過(guò)吸入噴霧、局部地、通過(guò)滴眼劑、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)口腔、經(jīng)陰道或經(jīng)由植入的儲(chǔ)庫(kù)施用，其中本文所用的術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。藥物組合物可以以合適的劑型提供，例如膠囊、片劑和水性懸浮液和溶液，優(yōu)選為無(wú)菌形式。其可用于治療疾病優(yōu)選過(guò)敏的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的多肽。可以使用根據(jù)本發(fā)明的多肽的低過(guò)敏原性變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于產(chǎn)生已知過(guò)敏原的低過(guò)敏原性變體的方法。
本發(fā)明提供了用于通過(guò)向受試者施用本發(fā)明的藥物組合物治療、預(yù)防或改善過(guò)敏，優(yōu)選堅(jiān)果過(guò)敏，更優(yōu)選澳洲堅(jiān)果過(guò)敏的方法。
通過(guò)以下附圖和非限制性序列和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，從中可以獲得本發(fā)明的其它特征、實(shí)施方案、方面和優(yōu)點(diǎn)。
附圖描述
圖1顯示了澳洲堅(jiān)果提取物的2d凝膠電泳分離的結(jié)果。在ph3-10非線(xiàn)性ipg條上在第一維中分離，隨后在還原條件下通過(guò)sdspage分離蛋白質(zhì)，通過(guò)考馬斯染色進(jìn)行染色并從凝膠中切出。數(shù)字標(biāo)記隨后進(jìn)行maldi-tof分析的點(diǎn)。箭頭標(biāo)記代表后續(xù)被鑒定為澳洲堅(jiān)果豌豆球蛋白樣蛋白的蛋白質(zhì)的條帶。
圖2顯示了澳洲堅(jiān)果提取物的蛋白質(zhì)印跡分析和通過(guò)2d凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。分子量標(biāo)記與圖1所示相同。
圖3顯示了使用涂覆有來(lái)自澳洲堅(jiān)果的豌豆球蛋白樣蛋白的euroline品系測(cè)定法對(duì)來(lái)自澳洲堅(jiān)果致敏患者(n＝20)和健康獻(xiàn)血者(n＝17)的人血清的分析?；趀ast參考系統(tǒng)進(jìn)行來(lái)自人血清的結(jié)合抗體的評(píng)價(jià)。
圖4a至4g顯示了比較數(shù)據(jù)，其指示如使用線(xiàn)印跡測(cè)定的來(lái)自所述患者的血清中以east類(lèi)別形式表達(dá)的ige濃度。這些圖顯示了針對(duì)來(lái)自非澳洲堅(jiān)果的樹(shù)堅(jiān)果的一種樹(shù)堅(jiān)果或核7s豌豆球蛋白樣蛋白的ige與針對(duì)來(lái)自澳洲堅(jiān)果的maci豌豆球蛋白的ige之間的相關(guān)性(如果有的話(huà))。
本申請(qǐng)包括多個(gè)氨基酸序列，更具體地，包括：
seqidno1(優(yōu)選澳洲堅(jiān)果豌豆球蛋白樣蛋白(q9spl3)的片段)
seqidno2(包含澳洲堅(jiān)果豌豆球蛋白樣蛋白的融合蛋白)
seqidno3(來(lái)自榛子的cora11),
seqidno4(來(lái)自芝麻的sesi3),
seqidno5(來(lái)自花生的arah1),
seqidno6(來(lái)自開(kāi)心果的pisv3)
seqidno7(來(lái)自腰果的anao1)
seqidno8(來(lái)自美洲山核桃的cari2)
seqidno9(來(lái)自核桃的jugr2)
seqidno10(來(lái)自澳洲堅(jiān)果的maci豌豆球蛋白)
通過(guò)以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，從中可以獲得本發(fā)明的其它特征、實(shí)施方案、方面和優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例：
實(shí)施例1：
澳洲堅(jiān)果提取物的制備
將烘焙和鹽腌的市售澳洲堅(jiān)果仁研磨，然后用丙酮脫脂3次。將脫脂的堅(jiān)果碎片在折疊的過(guò)濾器上干燥。將干燥的材料重懸于緩沖液例如磷酸緩沖鹽水(pbs，50mm磷酸鈉，150mmnacl,ph7.4)中，在孵育振蕩器中在4℃孵育3小時(shí)，隨后過(guò)濾并在臺(tái)式離心機(jī)中在4℃以4000rpm離心30分鐘。
使用100％硫酸銨沉淀上清液，并將所得沉淀針對(duì)pbs透析。如生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)中所述，通過(guò)bio-rad蛋白測(cè)定(bio-radlaboratories,inc.,hercules,usa)進(jìn)行蛋白濃度的估計(jì)。
制備凝膠電泳
將粗制的澳洲堅(jiān)果提取物用冷的丙酮沉淀，并且在-20℃孵育2小時(shí)且在4℃以20000xg離心30分鐘后，將沉淀物重懸在樣品緩沖液中用于等電聚焦(2.5％磺基甜菜堿3-10，4m尿素，2m硫脲，0.5％(v/v)載體兩性電解質(zhì)(carrierampholyte)ph3-10、40mmdtt和0.003％溴酚藍(lán))。在室溫下用樣品再次水化ipg條(readystripipg條7cmph3至10(bio-rad)，固定的ph梯度)過(guò)夜。
隨后，使用proteani12ief系統(tǒng)(bio-rad)聚焦蛋白質(zhì)，并且通過(guò)用于在凝膠上產(chǎn)生純蛋白點(diǎn)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(4至12％bis-tris蛋白質(zhì)凝膠，1.0mmx2d孔，thermofisherscientific)，基于其表觀(guān)分子量在第二維進(jìn)行分離。對(duì)于2d凝膠中的點(diǎn)的尺寸估計(jì)，如制造商的說(shuō)明書(shū)中所述使用spectramulticolorbroadrange(thermofisherscientific)進(jìn)行估計(jì)。
通過(guò)blue-銀染色(candiano等人,electrophoresis.2004may；25(9):1327-33.bluesilver:averysensitivecolloidalcoomassieg-250stainingforproteomeanalysis)對(duì)所得2d凝膠的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。染色的凝膠如圖1所示。
蛋白質(zhì)印跡
如制造商的說(shuō)明書(shū)中所述，將堅(jiān)果提取物的2d凝膠通過(guò)te22miniblotter(hoeferinc.，holliston，ma，usa)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。通過(guò)用ponceaus染色檢測(cè)轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)。將所得蛋白質(zhì)印跡在洗滌緩沖液(euroimmunag,lübeck,germany)中孵育15分鐘，隨后用在洗滌緩沖液中1:10稀釋的來(lái)自澳洲堅(jiān)果致敏的患者的血清孵育1小時(shí)。
在用洗滌緩沖液(產(chǎn)品號(hào)zd1100，由euroimmunag提供用于euroline線(xiàn)印跡，lübeck，germany)洗滌3次，每次5分鐘后，將膜與抗ige-ap綴合物(euroimmunag,lübeck,germany)孵育并再次用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。如制造商的說(shuō)明書(shū)中推薦的，通過(guò)與bcip/nbt底物(euroimmunag,lübeck,germany)孵育來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體。
獲得的印跡示于圖2中。主要的目標(biāo)蛋白質(zhì)包括在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)。
maldi
切下用blue銀染色染色的2d凝膠的選定點(diǎn)并用胰蛋白酶消化。如制造商的說(shuō)明書(shū)中所述，使用maldi-tof/tofautoflexiii(brukercorporation,billerica,ma,usa)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋分析(pmf)和msms。就方便的序列篩選針對(duì)綠色植物的ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)，導(dǎo)致作為在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)的澳洲堅(jiān)果豌豆球蛋白樣蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)登錄碼：q9spl3)的鑒定。
澳洲堅(jiān)果豌豆球蛋白樣蛋白的克隆、重組表達(dá)和純化
通過(guò)基因合成(eurofinsgenomicsgmbh)生成澳洲堅(jiān)果豌豆球蛋白樣蛋白的編碼區(qū)，更具體地等同于如seqidno：2所示的通過(guò)接頭與his標(biāo)簽融合的af161885中的核苷酸序列的編碼dna，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增并使用
線(xiàn)印跡(euroline)的制備
通過(guò)使用精密分配器(可從zetacorporation商購(gòu)獲得)將融合蛋白涂覆在硝酸纖維素膜(可從schleicher&schüll商購(gòu)獲得)上來(lái)產(chǎn)生euroline線(xiàn)印跡。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)的推薦封閉和洗滌后，將膜切成3mm的條。
使用euroline線(xiàn)測(cè)定法評(píng)價(jià)樣品
根據(jù)制造商(euroimmunag,lübeck,germany)說(shuō)明書(shū)的推薦孵育euroline條。具體來(lái)說(shuō)，在室溫下，用1ml在洗滌緩沖液中1/11(v/v)稀釋的患者樣品(20個(gè)澳洲堅(jiān)果致敏的患者和17個(gè)健康血液供體)孵育所述條16小時(shí)。棄去患者樣品后，將所述條洗滌3次，每次用每條1ml洗滌緩沖液洗滌5分鐘，隨后用1ml與ap綴合的抗人ige抗體孵育1小時(shí)。然后，將所述條再次用洗滌緩沖液洗滌5次，然后用bcip/nbt底物孵育10分鐘。
通過(guò)掃描儀和
表1：east類(lèi)別
實(shí)施例2：
來(lái)自榛子(seqidno3)、芝麻(seqidno4)、花生(seqidno5)、開(kāi)心果(seqidno6)、腰果(seqidno7)、美洲山核桃(seqidno8)、核桃(seqidno9)和澳大利亞堅(jiān)果(seqidno10)的豌豆球蛋白樣蛋白根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法表達(dá)為his標(biāo)簽融合蛋白，并如實(shí)施例1所述純化。
制備線(xiàn)印跡，將其與患者樣品接觸，并如ep15001277的實(shí)施例2和3中所述進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)試了來(lái)自對(duì)樹(shù)堅(jiān)果過(guò)敏的29個(gè)患者和9個(gè)健康獻(xiàn)血者的血清。
測(cè)試來(lái)自健康獻(xiàn)血者的對(duì)照血清，并且發(fā)現(xiàn)其均為陰性(east類(lèi)別0)。
圖4a至4g顯示了比較數(shù)據(jù)，其指示如使用線(xiàn)印跡測(cè)定的來(lái)自所述患者的血清中以east類(lèi)別形式表達(dá)的ige濃度。這些圖顯示了針對(duì)來(lái)自非澳洲堅(jiān)果的樹(shù)堅(jiān)果的一種樹(shù)堅(jiān)果或核7s豌豆球蛋白樣蛋白的ige與針對(duì)來(lái)自澳洲堅(jiān)果的maci豌豆球蛋白的ige之間的相關(guān)性(如果有的話(huà))。
例如，圖4g顯示，對(duì)于maci豌豆球蛋白，一個(gè)患者顯示出east類(lèi)別1ige反應(yīng)，幾個(gè)患者顯示east類(lèi)別2ige反應(yīng)，并且一個(gè)患者顯示east類(lèi)別5ige反應(yīng)，但是對(duì)于anao1(腰果)沒(méi)有反應(yīng)，如通過(guò)他們?cè)趯?duì)應(yīng)于anao1的0east類(lèi)別的那一排中所顯示的情況所指示的。
這些結(jié)果顯示，在每個(gè)比較實(shí)驗(yàn)中，顯著數(shù)量的過(guò)敏性患者(圖4a至4g中的暗視野)對(duì)maci豌豆球蛋白反應(yīng)，但不對(duì)來(lái)自另一樹(shù)堅(jiān)果的相應(yīng)豌豆球蛋白樣蛋白反應(yīng)，更具體地，該數(shù)量為29個(gè)患者中的13個(gè)(cora11相比于maci)，29個(gè)患者中的9個(gè)(sesi3)，29個(gè)患者中的10個(gè)(jugr2)，29個(gè)患者中的9個(gè)(pisv3)，29個(gè)患者中的8個(gè)(cari2)，29個(gè)患者中的4個(gè)(arah1)和29個(gè)患者中的4個(gè)(anao1)。這些患者之一不能通過(guò)檢測(cè)針對(duì)來(lái)自其它樹(shù)堅(jiān)果的豌豆球蛋白而非maci豌豆球蛋白的ige類(lèi)別抗體來(lái)診斷，因?yàn)槠溲逯械膇ge抗體僅對(duì)maci豌豆球蛋白反應(yīng)。
maci豌豆球蛋白與來(lái)自其它堅(jiān)果和核的7s豌豆球蛋白樣蛋白沒(méi)有east類(lèi)別相關(guān)性。一些患者對(duì)maci豌豆球蛋白的反應(yīng)比對(duì)各自的其它樹(shù)堅(jiān)果過(guò)敏原的反應(yīng)強(qiáng)得多，表明各患者主要對(duì)澳洲堅(jiān)果過(guò)敏而不是對(duì)另一種樹(shù)堅(jiān)果過(guò)敏。例如，圖4a顯示4名患者具有對(duì)maci豌豆球蛋白的6(強(qiáng)反應(yīng))的east類(lèi)別，但對(duì)于cora11沒(méi)有或僅有輕微反應(yīng)(east類(lèi)別0或1)。這表明，maci豌豆球蛋白具有不與任何其它豌豆球蛋白共有的獨(dú)特的ige表位。
序列表
<110>euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag
<120>新型澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原
<130>15pp017ep2
<160>10
<170>patentinversion3.5
<210>1
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>1
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<213>榛子
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