本發(fā)明屬于植物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)植物蛋白酶體活性基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

新蛋白的合成和已有蛋白的降解控制著植物生命周期中的所有過程，每周約有50％的蛋白通過這種合成-降解循環(huán)進(jìn)行更新?？茖W(xué)家們很早就開始對(duì)控制蛋白合成的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的機(jī)制進(jìn)行研究，但直到近來才開始認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)降解的重要性。蛋白降解可有效降解細(xì)胞內(nèi)不正常的蛋白從而產(chǎn)生自由的氨基酸供植物的生長發(fā)育及更新。

泛素-蛋白酶體降解體系是已知的最重要的蛋白降解體系，在動(dòng)植物發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用，aaronciechanover，avramhershko和irwinrose也因發(fā)現(xiàn)泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解過程而獲得了2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)該降解體系基本涉及到植物生命活動(dòng)的每個(gè)方面，包括抵抗逆境和疾病、激素信號(hào)調(diào)控、細(xì)胞周期控制、胚胎發(fā)育及光形態(tài)建成等。

鑒于蛋白酶體降解體系的重要作用，通過調(diào)節(jié)植物蛋白酶體活性對(duì)于植物的發(fā)育，抵抗逆境和疾病、激素信號(hào)調(diào)控、細(xì)胞周期控制、胚胎發(fā)育及光形態(tài)建成等具有重要的意義。

因此，本領(lǐng)域需要對(duì)蛋白酶體降解體系的調(diào)控基因進(jìn)行更為深入的研究，定位到可以調(diào)控植物蛋白酶體功能的基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)節(jié)植物蛋白酶體活性的基因及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種調(diào)節(jié)植物蛋白酶體活性或激素信號(hào)的方法，所述方法包括：調(diào)節(jié)植物中ptre1蛋白的表達(dá)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的植物是雙子葉植物；較佳地，所述的 植物包括但不限于：十字花科植物，禾本科植物，茄科植物，大戟科植物。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述十字花科植物包括：擬南芥；或者

所述的禾本科植物包括：水稻、小麥、玉米；或者

所述的茄科植物包括：馬鈴薯、西紅柿；或者

所述的大戟科植物包括：木薯、甘薯。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的ptre1蛋白選自下組：

(a)如seqidno:3氨基酸序列的蛋白；

(b)將seqidno:3氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；如5個(gè)，3個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)與(a)限定的蛋白序列有80％以上(較佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述方法包括：上調(diào)或下調(diào)表達(dá)植物中ptre1蛋白的表達(dá)；從而：

減弱植物體內(nèi)蛋白酶體活性或者促進(jìn)植物蛋白酶體活性；

減弱或促進(jìn)相關(guān)激素信號(hào)強(qiáng)度。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述方法包括：上調(diào)植物中ptre1蛋白的表達(dá)，從而：

促進(jìn)26s蛋白酶體活性，抑制20s蛋白酶體活性；

上調(diào)iaa1、iaa2、iaa3、iaa4、iaa5或iaa6的表達(dá)水平，或下調(diào)iaa7、iaa17或iaa19的表達(dá)水平；或

減弱植物對(duì)脫落酸的響應(yīng)的敏感度。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述方法包括：下調(diào)植物中ptre1蛋白的表達(dá)，從而：

抑制26s蛋白酶體活性，促進(jìn)20s蛋白酶體活性；

下調(diào)iaa1、iaa2、iaa3、iaa4、iaa5或iaa6的表達(dá)水平，或上調(diào)iaa7或iaa17的表達(dá)水平；或

促進(jìn)(或者，上調(diào))植物對(duì)脫落酸的響應(yīng)的敏感度，下調(diào)植物對(duì)生長素的敏感度，或上調(diào)(或者，促進(jìn))植物對(duì)油菜素內(nèi)酯的敏感度。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述上調(diào)植物中ptre1蛋白的表達(dá)包括：

將ptre1蛋白的編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子，從而上調(diào)植物中蛋白酶體活性。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述下調(diào)植物中ptre1蛋白的表達(dá)包括：下調(diào)或敲除植物中ptre1基因，或下調(diào)植物中ptre1蛋白的表達(dá)或活性。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種ptre1蛋白或其編碼基因用途，用于調(diào)節(jié)(包括上調(diào)或下調(diào))植物蛋白酶體活性或激素信號(hào)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，，所述的植物是雙子葉植物；較佳地，所述的植物包括但不限于：十字花科植物，禾本科植物，茄科植物，大戟科植物。較佳地，所述十字花科植物包括：擬南芥；或者

所述的禾本科植物包括：水稻、小麥、玉米；或者

所述的茄科植物包括：馬鈴薯、西紅柿；或者

所述的大戟科植物包括：木薯、甘薯。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種ptre1蛋白或其編碼基因用途，用于作為鑒定植物蛋白酶體活性強(qiáng)度或激素信號(hào)強(qiáng)弱的分子標(biāo)記。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，若經(jīng)檢測(cè)植物組織中ptre1蛋白表達(dá)高于一個(gè)特定值，則相對(duì)而言，所述植物的蛋白酶體活性增強(qiáng)；若經(jīng)檢測(cè)植物組織中ptre1蛋白表達(dá)低于一個(gè)特定值，則相對(duì)而言，所述植物的蛋白酶體活性減弱。其中，除非另外說明，所述的“特定值”是指植物中ptre1蛋白表達(dá)量的平均值。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1為ptre1體外調(diào)控蛋白酶體活性結(jié)果。ptre1可以促進(jìn)26s蛋白酶體活性，抑制20s蛋白酶體活性。

圖2為ptre1體內(nèi)調(diào)控蛋白酶體活性結(jié)果。ptre1突變體中26s蛋白酶體活性下調(diào)(左圖)，20s蛋白酶體活性上調(diào)(右圖)。

圖3為ptre1調(diào)控生長素信號(hào)蛋白aux/iaa結(jié)果。ptre1及ptre1過量材料中aux/iaa蛋白積累情況。

圖4為ptre1調(diào)控生長素信號(hào)基因aux/iaa結(jié)果。ptre1及ptre1過量材料中aux/iaa基因表達(dá)情況。

圖5為ptre1對(duì)激素響應(yīng)的敏感度表型分析。包括脫落酸(上圖)，油菜素內(nèi)酯(下左圖)，生長素(下右圖)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的ptre1蛋白酶體調(diào)控基因，ptre1基因可以調(diào)節(jié)植物蛋白酶體活性，從而實(shí)現(xiàn)植物品種改良，還可以將ptre1基因應(yīng)用于植物的培育中，選育出合適蛋白酶體活性強(qiáng)度的品種。

如本文所用，如本文所用，所述的“植物(作物)”包括農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物可以是：雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。所述的“植物”包括：十字花科植物，禾本科植物、茄科植物、大戟科植物等。比如，可以包括但不限于：水稻、小麥、玉米、馬鈴薯、木薯等。較佳的，所述的植物是十字花科植物。

本發(fā)明所述的ptre1蛋白還包括ptre1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的ptre1蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的蛋白。本發(fā)明的蛋白片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；如5個(gè)，3個(gè))保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的蛋白，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；如5個(gè)，3個(gè))氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。

任何一種ptre1蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，ptre1蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種蛋白，其仍然能保持全長的 ptre1蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％的全長ptre1蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長ptre1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本發(fā)明中，術(shù)語“ptre1蛋白”指具有ptre1蛋白活性的seqidno:3序列的蛋白。該術(shù)語還包括具有與ptre1蛋白相同功能的、seqidno:3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：若干個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；如5個(gè)，3個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括ptre1蛋白的活性片段和活性衍生物。

編碼ptre1蛋白或其保守性變異蛋白的多核苷酸序列(編碼序列)也可以應(yīng)用到本發(fā)明中。編碼成熟ptre1蛋白的編碼區(qū)序列可以與seqidno:1或seqidno:2所示的序列基本上相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有seqidno:3的蛋白質(zhì)，但與seqidno:1或seqidno:2所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。

術(shù)語“編碼基因”可以是包括編碼所述蛋白的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

上述多核苷酸的變異體也是可用的，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的蛋白的功能。

應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的ptre1基因優(yōu)選獲自十字花科植物，但是獲自其它植物的與該ptre1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，例如blast。

本發(fā)明的ptre1蛋白的編碼序列通?？梢杂胮cr擴(kuò)增法、重組法或人 工合成的方法獲得。對(duì)于pcr擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cdna庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列。

包含所述編碼序列的載體，以及用所述的載體或ptre1蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含ptre1蛋白編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mrna合成。包含上述的適當(dāng)編碼序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。

宿主細(xì)胞通常是植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化植物一般可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法等；優(yōu)選的是農(nóng)桿菌法。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得相對(duì)于野生型而言性狀發(fā)生改變的植物。

蛋白酶體是在真核生物普遍存在的一種巨型蛋白質(zhì)復(fù)合物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，ptre1蛋白參與了對(duì)于植物體內(nèi)蛋白酶體的調(diào)控作用。同時(shí)，ptre1還參與了對(duì)生長素信號(hào)因子的調(diào)控作用，能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)多種生長素的高低。

脫落酸(abscisicacid，aba)是一種抑制生長的植物激素，因能促使葉子脫落而得名，廣泛分布于高等植物。除促使葉子脫落外尚有其他作用，如使芽進(jìn)入休眠狀態(tài)、促使馬鈴薯形成塊莖等。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上調(diào)植物中ptre1蛋白的表達(dá)可以減弱植物對(duì)脫落酸的響應(yīng)的敏感度；下調(diào)植物中ptre1蛋白的表達(dá)可以增強(qiáng)植物對(duì)脫落酸的響應(yīng)的敏感度。

此外，ptre1還參與了對(duì)植物中生長素、油菜素內(nèi)酯的調(diào)節(jié)作用。

因此，ptre1可用于制備具有所需的蛋白酶體活性強(qiáng)度或具有所需生長素信號(hào)因子強(qiáng)度的轉(zhuǎn)基因植物。

基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了所述的ptre1蛋白或其編碼基因的用途，用于調(diào)節(jié)(包括上調(diào)或下調(diào))植物蛋白酶體活性或激素信號(hào)。在一種方式下，過表達(dá)正義ptre1蛋白可以促進(jìn)26s蛋白酶體活性，抑制20s蛋白酶 體活性；上調(diào)iaa1、iaa2、iaa3、iaa4、iaa5或iaa6的表達(dá)水平，或下調(diào)iaa7、iaa17或iaa19的表達(dá)水平；或減弱植物對(duì)脫落酸的響應(yīng)的敏感度。在另一種方式下，下調(diào)ptre1基因(或基因片段)后可抑制26s蛋白酶體活性，促進(jìn)20s蛋白酶體活性；下調(diào)iaa1、iaa2、iaa3、iaa4、iaa5或iaa6的表達(dá)水平，或上調(diào)iaa7或iaa17的表達(dá)水平；或促進(jìn)植物對(duì)脫落酸的響應(yīng)的敏感度。因此，可基于ptre1蛋白對(duì)于植物性狀的影響作用來改變植物，從而達(dá)到根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要改良植物品質(zhì)的目的。

本發(fā)明還涉及ptre1蛋白或其編碼基因的上調(diào)劑或下調(diào)劑(如反義的ptre1基因或如mirna)及其用途。由于ptre1的上調(diào)劑或下調(diào)劑可調(diào)節(jié)ptre1的表達(dá)和/或調(diào)節(jié)ptre1的活性等，因此，所述的ptre1的上調(diào)劑或下調(diào)劑也可通過對(duì)ptre1的影響來調(diào)節(jié)植物性狀，從而達(dá)到改良植物的目的。

任何可調(diào)節(jié)ptre1蛋白的活性、調(diào)節(jié)ptre1蛋白的穩(wěn)定性、促進(jìn)或抑制ptre1蛋白的表達(dá)、延長或減少ptre1蛋白有效作用時(shí)間、或促進(jìn)或降低ptre1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于調(diào)節(jié)植物蛋白酶體活性或激素信號(hào)的有效物質(zhì)。

本發(fā)明還涉及一種改良植物的方法，該方法包括調(diào)節(jié)所述植物中ptre1蛋白的表達(dá)。

在得知了所述的ptre1蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來調(diào)節(jié)所述的ptre1蛋白的表達(dá)。比如可通過一定的途徑將攜帶ptre1編碼基因的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)活性的ptre1蛋白。此外，也可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來降低ptre1蛋白的表達(dá)或使之缺失表達(dá)，比如將攜帶反義ptre1基因的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上，使得細(xì)胞或植物組織不表達(dá)或降低表達(dá)ptre1蛋白；或?qū)tre1基因進(jìn)行敲除。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，將ptre1蛋白的編碼基因通過常規(guī)的方法克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，將所述的帶有外源基因的重組載體導(dǎo)入到可表達(dá)所述ptre1蛋白的植物細(xì)胞中，使所述的植物細(xì)胞表達(dá)ptre1蛋白?？赏ㄟ^將所述植物細(xì)胞再生成植物，獲得過量表達(dá)ptre1蛋白的植物。優(yōu)選的，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將ptre1蛋白的編碼基因或反義基因轉(zhuǎn)入植物中。

如本文所用，所述的正向連接是指：ptre1的編碼基因與表達(dá)載體的連接是正義的連接，即編碼基因按照5’→3’的方向連接于載體上。通常，ptre1的編碼基因位于表達(dá)載體中啟動(dòng)子的下游，也即啟動(dòng)子的3’端下游連接該編碼基因的5’端。所述的編碼基因是可操作性地連接到表達(dá)載體上的。所述的“操作性連接”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性dna序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性dna序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。

如本文所用，所述的反向連接是指：ptre1的編碼基因與表達(dá)載體的連接是反義的連接，即編碼基因按照3’→5’的方向連接連接于載體上。通常，ptre1的編碼基因位于表達(dá)載體中啟動(dòng)子的下游，也即啟動(dòng)子的3’端下游連接該編碼基因的3’端。

可采用任何適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實(shí)施所述的方法。其它增加ptre1表達(dá)的方法是本領(lǐng)域周知的。例如，可通過用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)從而增強(qiáng)ptre1的表達(dá)?；蛘咄ㄟ^增強(qiáng)子來增強(qiáng)該ptre1基因的表達(dá)。適用于本發(fā)明方法的強(qiáng)啟動(dòng)子包括但不限于：35s啟動(dòng)子、水稻、玉米的ubi啟動(dòng)子等。

此外，本發(fā)明還涉及利用ptre1蛋白或其編碼基因作為一種基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標(biāo)記。本發(fā)明還涉及利用ptre1蛋白或其編碼基因作為一種分子標(biāo)記，通過檢測(cè)植物中ptre1蛋白的表達(dá)情況，鑒定植物的蛋白酶體活性情況或植物對(duì)激素信號(hào)的敏感度等。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例1、ptre1基因的分離及在體內(nèi)和體外對(duì)蛋白酶體活性的調(diào)控

1、ptre1基因的表達(dá)、分離純化

以擬南芥col的cdna為模板，用引物ptre128a5’和ptre128a3’擴(kuò)增出全長的ptre1編碼區(qū)，然后通過ncoi和xhoi酶切連接到pet-28a載體中，構(gòu)建成pet-28a-ptre1表達(dá)載體用于ptre1蛋白表達(dá)。

ptre128a5’序列：catgccatggcgaattctcagacgg(seqidno:4)；

ptre128a3’序列：ccgctcgagtataaaatctgaaccgccgg(seqidno:5)。

蛋白的表達(dá)和純化方法如下：將構(gòu)建的pet-28a-ptre1表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌蛋白表達(dá)菌株rosetta(de3)中，篩選陽性克隆后挑取單克隆接入含有相應(yīng)抗性的2ml的lb液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)；將過夜培養(yǎng)的菌液按1/100的比例接種到30ml含相應(yīng)抗性的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)至od600約0.6；加入終濃度為1mm的iptg(isopropyl-b-d-thiogalactoside)，繼續(xù)在37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)1-3小時(shí)，以誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)；收集不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)菌用于重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的鑒定。誘導(dǎo)細(xì)菌重懸在裂解緩沖液(50mmnah2po4，300mmnacl和10mm，ph8.0)中，用超聲法(10s，間隔10s，至懸浮液呈清)破碎后鑒定誘導(dǎo)表達(dá)情況。成功誘導(dǎo)且正確表達(dá)的菌株重新進(jìn)行較大量(100ml)的誘導(dǎo)。

用ni-ntaagarose(qiagen)按照其操作手冊(cè)描寫的步驟進(jìn)行非變性條件下純化。

2、體外蛋白酶體活性測(cè)定

ptre1蛋白酶體活性用20s蛋白酶體活性分析試劑盒鑒定(millipore)。非變性條件下純化的ptre1蛋白、20s蛋白酶體、蛋白酶體降解底物suc-llvy-amc(succinyl-leu-leu-val-tyr-7-amido-4-methylcoumarin)(購自bostonbiochem公司)根據(jù)試劑盒操作手冊(cè)在反應(yīng)緩沖液37℃反應(yīng)105分鐘。lactacystin作為系統(tǒng)正對(duì)照。反應(yīng)之后立刻用1.9ml的ddh2o稀釋并終止反應(yīng)，然后用380nmexcitation/460nmemission檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)生的自由amc(perkinelmerls55fluorescencespectrometer)。

ptre1體外調(diào)控蛋白酶體活性結(jié)果如圖1，可見ptre1可以促進(jìn)26s蛋 白酶體活性，抑制20s蛋白酶體活性。

3、體內(nèi)蛋白酶體活性檢測(cè)

擬南芥ptre1突變體的建立：為了研究ptre1的生理功能，本發(fā)明人檢索了擬南芥t-dna插入突變體庫(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress)，得到一個(gè)可能的t-dna插入突變體salk_034353。經(jīng)種子擴(kuò)繁、篩選及鑒定，證明插入位置在第一個(gè)內(nèi)含子上。后代群體約300株經(jīng)t-dna插入驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在含t-dna插入雜合的植株成苗中，除果莢中胚胎發(fā)育異常外其他生長發(fā)育狀態(tài)和野生型沒有明顯差異，但t-dna插入純合植株的發(fā)育明顯異常。

用于鑒定突變體的引物如下：

lba1：tggttcacgtagtgggccatcg(seqidno:6)；

ptre1-rp：aacgtaggcccaaatttgatc(seqidno:7)；

ptre1-lp：ctccacaaaacgaagttccac(seqidno:8)。

擬南芥的突變體、野生型(col)材料中的蛋白酶體活性分析，利用suc-llvy-amc作為底物，擬南芥的全蛋白提取物作為樣品。植物材料液氮研磨后用抽提緩沖液(50mmtris-hclph7.5，150mmnacl，1mmedtaph7.5，0.1％tritonx-100)提取，4℃，12000rpm離心15分鐘，取上清，再次離心后取上清即為全蛋白提取物。然后用bradford方法定量后用于蛋白酶體活性分析。37℃反應(yīng)120分鐘。

結(jié)果如圖2，可見ptre1突變體中26s蛋白酶體活性下調(diào)，20s蛋白酶體活性上調(diào)。

綜上結(jié)果，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，ptre1基因可以調(diào)控植物蛋白酶體活性。

實(shí)施例2、制備ptre1基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物

植物轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建方法如下：根據(jù)ptre1基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物ptre15’和ptre13’，以全長ptre1cdna為模板擴(kuò)增出全長的ptre1編碼區(qū)，經(jīng)ncoi和spei酶切后連接到pcambia1302載體(自帶gfp)中，構(gòu)建成1302-ptre1雙元表達(dá)載體(可以表達(dá)35s驅(qū)動(dòng)的ptre1-gfp(p35s::ptre1-gfp))。

ptre15’序列：catgccatggcgaattctcagacggtga(seqidno: 9)；

ptre13’序列：ggactagttataaaatctgaaccgccg(seqidno:10)。

轉(zhuǎn)化植物方法具體如下：根據(jù)cloughandbent(1998)的floraldipping方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化。取生長一個(gè)月左右的植株，去除已經(jīng)開放的花朵和結(jié)實(shí)的果莢，轉(zhuǎn)化前一天澆足水。將含有轉(zhuǎn)基因載體的農(nóng)桿菌gv3101于28℃培養(yǎng)過夜至od600≈2.0，4500rpm離心10min，菌體沉淀懸浮于新鮮配制的轉(zhuǎn)化液中，至終濃度od600≈0.8。轉(zhuǎn)化時(shí)將擬南芥地上部分浸泡于菌液中30-40s，確保全部花苞都被浸沒。用吸水紙吸去多余的液體，將植物平放并用保鮮膜保持濕度，避光過夜。第二天將植物取出，豎直并轉(zhuǎn)移到正常條件下生長收種。

采用上述方法，獲得ptre1基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。

實(shí)施例3、ptre1基因?qū)ιL素信號(hào)因子aux/iaa蛋白及基因的調(diào)控

本實(shí)施例中，檢測(cè)ptre1突變體和ptre1基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物材料中aux/iaa蛋白降解及aux/iaa基因表達(dá)發(fā)生變化情況。

iaa7-luc載體的構(gòu)建：以擬南芥col材料的cdna為模板，通過引物iaa7-1：acgcgtcgacatgatcggccaacttatgaa(seqidno:11)和iaa7-2：gactagtccagatctgttcttgcagtactt(seqidno:12)擴(kuò)增iaa7基因，然后連入p35s::iaa-luc載體。

iaa17-luc載體和iaa19-luc載體的構(gòu)建方法基本同iaa7-luc載體，相關(guān)引物如下：

iaa17-1：acgcgtcgacatgatgggcagtgtcgagct(seqidno:13)，

iaa17-2：gactagtccagctctgctcttgcacttctc(seqidno:14)；

iaa19-1：acgcgtcgacatggagaaggaaggactcgg(seqidno:15)，

iaa19-2：gactagtccctcgtctactcctctaggctg(seqidno:16)。

p35s::iaa-luc的構(gòu)建方法如下：以原始載體pa7為骨架，使用酶切位點(diǎn)spei及bamhi將gfp替換為luc即可，使用引物如下：

gactagtgatggaagacgccaaaaacata(seqidno:17)；及

cgggatccttacaatttggactttccgcc(seqidno:18)。

pubi10::gus的方法如下：以原始載體pa7為骨架，使用酶切位點(diǎn)sali及xbai將gfp替換為gus即可，使用引物如下：

acgcgtcgacatgttacgtcctgtagaa(seqidno:19)；及

gctctagatcattgtttgcctccctgctg(seqidno:20)。

檢測(cè)aux/iaa蛋白變化的方法如下：轉(zhuǎn)化iaa(iaa7，iaa17或iaa19)-luc載體到原生質(zhì)體中，是用3-4周的擬南芥材料葉片獲得大量原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化p35s::iaa-luc(30μg)和pubi10::gus(6μg，作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參)到300μl原生質(zhì)體中，孵育12小時(shí)在22℃。之后取出20μl裂解液和100μllucassay混合，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量數(shù)值分析。

ptre1調(diào)控生長素信號(hào)蛋白aux/iaa結(jié)果見結(jié)果圖3。可見ptre1突變體中iaa7、iaa17的蛋白水平顯著高于野生型；ptre1基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物中iaa1、iaa17和iaa19的蛋白水平均顯著低于野生型和ptre1突變體。ptre1增多，促進(jìn)了上述iaa的降解，表現(xiàn)出這些iaa量減少，所以是一個(gè)促進(jìn)的作用(iaa減少代表正調(diào)控)。因此，在植物中ptre1基因?qū)ιL素信號(hào)因子aux/iaa蛋白的表達(dá)具有正調(diào)控作用。

檢測(cè)aux/iaa基因變化的方法如下：使用trizol試劑提取三種擬南芥材料的rna，通過toyobo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得相關(guān)cdna，使用bio-rad實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀器檢測(cè)相關(guān)aux/iaa基因的表達(dá)情況。

熒光定量pcr引物如下：

iaa1正向：accgaccaacatccaatctc(seqidno:21)，

反向：tggacggagctccatatctc(seqidno:22)；

iaa2正向：atcaccaaccaacatccagtc(seqidno:23)，

反向：tggacggagctccatatctc(seqidno:24)；

iaa3正向：caacccaagcacagacagag(seqidno:25)，

反向：tgattggatgctcattggtg(seqidno:26)；

iaa4正向：caacaatctgagcctttggag(seqidno:27)，

反向：attgggattaccagggacag(seqidno:28)；

iaa5正向：tccaaggaacatttcccaag(seqidno:29)，

反向：ccggagaaagaacagtctcg(seqidno:30)；

iaa6正向：aactgttgctcgaaccaagg(seqidno:31)，

反向：actgccggttgtgaagagtc(seqidno:32)。

ptre1調(diào)控生長素信號(hào)基因aux/iaa結(jié)果如圖4。可見，與野生型col相比，擬南芥ptre1突變體中iaa1、iaa2、iaa3、iaa4、iaa5、iaa6的基因表達(dá)均顯著性下降，而ptre1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，iaa1、iaa2、iaa3的基因表達(dá)有顯著性提高。

綜上，ptre1突變體和ptre1基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物中aux/iaa蛋白降解及aux/iaa基因表達(dá)發(fā)生變化。

實(shí)施例4、ptre1突變體對(duì)生長素，油菜素內(nèi)酯及脫落酸的敏感度響應(yīng)

本實(shí)施例中，測(cè)定ptre1突變體對(duì)生長素，油菜素內(nèi)酯及脫落酸的敏感度響應(yīng)發(fā)生變化。

生長素處理是使用含有不同濃度(0～1000nm)的2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)的ms培養(yǎng)基，上面播種未萌發(fā)的擬南芥種子，豎直生長7天后測(cè)量相關(guān)根長變化情況。

油菜素內(nèi)酯處理是使用不同濃度(0～100nm)的油菜素內(nèi)酯ms培養(yǎng)基，上面播種未萌發(fā)的種子，暗下豎直生長7天后測(cè)量相關(guān)下胚軸變化情況。

脫落酸處理是使用不同濃度(0.2～1um)的脫落酸ms培養(yǎng)基，上面播種未萌發(fā)的種子，水平生長7天后觀察相關(guān)材料生長情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由結(jié)果可見，ptre1蛋白的過表達(dá)減弱植物對(duì)脫落酸的響應(yīng)的敏感度；ptre1突變體(即下調(diào)ptre1表達(dá)的植物)對(duì)激素油菜素內(nèi)酯和脫落酸超敏感，對(duì)生長素的敏感度下降。

綜上可見，ptre1突變體對(duì)生長素，油菜素內(nèi)酯及脫落酸的敏感度響應(yīng)發(fā)生變化。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。