專利名稱：提高蛋白酶體活性的組合物和方法
提高蛋白酶體活性的組合物和方法相關申請本申請要求2010年8月13日遞交的美國臨時專利申請第61/373，404號，以及2010年I月28日遞交的美國臨時專利申請第61/336,959號的優(yōu)先權，兩者在此全文參考并入。政府支持本發(fā)明是在美國政府支持下，由美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes ofHealth)第GM065592、GM66492和DK082906號基金贊助進行的。美國政府對于本發(fā)明擁有 一定權利。
背景技術：
蛋白酶體是ー種包含33種不同亞基的大型蛋白質(zhì)復合物。蛋白酶體復合物起到蛋白酶的作用，可部分地降解不需要的或折疊錯誤的蛋白質(zhì)。蛋白酶體可以調(diào)節(jié)細胞在生理學上的許多方面，其功能失調(diào)會引起多種疾病，包括癌癥以及神經(jīng)退行性疾病(Finley D.，(2009)，Annu. Rev. Biochem.，78，477-513;Hoeller and Dikic, (2009), Nature,458, 438-444;Demartoand Gillette, (2007)，Cell, 129，659-662);Dahlmann, B. (2007)BCB Biochem 8,Suppl I, S3;Schartz AL and Ciechanover A(2009)Ann Rev PharmacolToxicol 49, 73-96)。多數(shù)情況下，但并非絕對的，蛋白酶體底物會通過泛素的多聚體鏈共價結合而靶向性降解，泛素是ー種小型、高度保守的蛋白質(zhì)。由于較長鏈的泛素與蛋白酶體的相互作用比較短鏈的泛素更強烈(Thrower et al. (2000)，EMBO J. 19，94-102)，所以頻繁改變泛素鏈長度的過程也會影響底物降解速率。某些蛋白酶體相關的去泛素化酶和泛素連接酶可以調(diào)控附著在標記蛋白酶體降解的底物上的泛素鏈的長度。這些去泛素化酶和連接酶似乎通過拆分和延伸與蛋白酶體結合的泛素鏈來調(diào)節(jié)蛋白酶體活性。哺乳動物的蛋白酶體包括三種主要的去泛素化酶Rpnll、Uch37和Uspl4(FinleyD.，(2009), Annu. Rev. Biochem.，78，477-513)。Rpnll 通過切斷泛素鏈和底物的結合部位將泛素從標記的底物上移除。由于Rpnll介導的裂解發(fā)生在底物的蛋白質(zhì)水解定型之后，但在底物降解之前，Rpnll有助于防止泛素與底物一起降解，從而使細胞泛素水平的波動最小化。此外，由于蛋白酶體底物在接觸蛋白酶體隱蔽的蛋白水解位點之前，必須通過狹窄的轉位通道，所以，除去大泛素鏈也可能促進底物轉位。因此，在蛋白酶體途徑的相對較晚階段，Rpnll通過對泛素鏈的整塊移除而促進底物降解(Verma et al.，(2002)Science, 298, 611-615;Yao and Cohen, (2002)，Nature, 419，403-407)。和Rpnll相反，Uch37作用于底物蛋白酶體的降解定型之前。Uch37分解底物末端的泛素鏈(Lam et al. , (1997)，Nature, 385，737-740)，其酶活性只是縮短鏈長而不是將它們完全移除?，F(xiàn)已提出，被Uch37修切過的鏈可以增強蛋白酶體辨別多泛素鏈長短的能力(Lam et al. , (1997)，Nature, 385，737-740)。Uch37是怎樣調(diào)節(jié)細胞中蛋白酶體功能的則了解甚少。
Uspl4的功能鮮為人知。但是，現(xiàn)已提出，Uspl4、Ubp6的酵母直系同源物分解底物末端泛素鏈，并且作用于底物蛋白酶體降解定型之前(Hanna et al. , (2006), Cell, 127 (7)
，1401-1413)。Ubp6被作為蛋白酶體抑制劑使用，對其進行的前期研究顯示，Ubp6具有非催化模式的蛋白酶體抑制作用(Hanna et al. , (2006)，Cell, 127 (7)，1401-1413)。發(fā)明簡述本發(fā)明提供抑制Uspl4、增強蛋白酶體活性以及治療蛋白質(zhì)病和可通過提高蛋白質(zhì)分解治療的其他疾病的新組合物和方法。除了蛋白質(zhì)病外，蛋白酶體活性的提高可治療任何以蛋白酶體活性缺乏、或者泛素-蛋白酶體途徑的其他構成部分活性缺乏為特征的疾病，例如遺傳性斑痣性錯構瘤病、I型脊髄小腦共濟失調(diào)、Angelman綜合征、巨軸突性神經(jīng)病變、伴有佩吉特骨病的包涵體肌病以及額顳葉癡呆(I BMPFD )等等(Lehman, N. L.，(2009)，Acta Neuropathologica, 118 (3)，329-347;Weihl et al. , (2007), Neuromuscular Disorders, 17,87-87)。提高蛋白酶體活性也可對與蛋白酶體底物有關的疾病起治療作用，并對病理學也做出貢獻，但是并沒有令人滿意的對蛋白質(zhì)病精確定義。例如，許多腫瘤蛋白是蛋白酶體底物，可以通過提高蛋白酶體活性而潛在地減弱其促進癌變的能力。本發(fā)明一方面涉及通式I、II、III、IV、V、VI、VII、或VIII表示的化合物，及其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水化物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，其中，所述通式定義如下。本發(fā)明另一方面涉及抑制Uspl4蛋白去泛素化活性的方法，其特征在于包括使所述的Uspl4蛋白與IUl或通式I、II、III、IV、V、VI、VII、或VIII的化合物，或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水化物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體接觸。本發(fā)明另一方面涉及通過蛋白酶體提高細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解作用的方法，其特征在于包括使所述細胞與IUI或通式I、II、III、IV、V、VI、VII、或VIII的化合物，或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水化物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體接觸。本發(fā)明另一方面涉及治療或預防對象中蛋白質(zhì)病的方法，其特征在于包括給予對象IUl或通式I、II、III、IV、V、VI、VII、或VIII的化合物，或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水化物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者包含上述物質(zhì)的藥物組合物。本發(fā)明另一方面涉及提高對象蛋白酶體功能的方法，其特征在于包括給予對象IUl或通式I、II、III、IV、V、VI、VII、或VIII的化合物，或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水化物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者包含上述物質(zhì)的藥物組合物。本發(fā)明另一方面涉及加速對象Tau、TDP-43或ataxin_3降解的方法,其特征在于包括給予對象IUI或通式I、II、III、IV、V、VI、VII、或VIII的化合物，或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水化物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者包含上述物質(zhì)的藥物組合物。本發(fā)明另一方面涉及ー種分離得到的蛋白酶體，其特征在于包括無酶活性的Uch37并包括有酶活性的Uspl4。在某些實施例中，所述的蛋白酶體包括無酶活性的Uch37和/或者こ烯砜_Uch37加合物。在某些實施例中，具有酶活性的Usp 14是ー種重組體蛋白。在某些實施例中，所述的蛋白酶體是人蛋白酶體或鼠蛋白酶體。本發(fā)明另一方面涉及ー種產(chǎn)生蛋白酶體的方法，所述蛋白酶體包括無酶活性的Uch37，且進ー步包括有酶活性的Uspl4，所述方法包括純化缺乏Uspl4但含有Uch37的蛋白酶體，用去泛素化酶抑制劑處理所述純化的蛋白酶體，并用有酶活性的Uspl4重新組成所述純化的蛋白酶體。在某些實施例中，所述的蛋白酶體是人蛋白酶體或鼠蛋白酶體。在某些實施例中，蛋白酶體純化自HEK293細胞。在某些實施例中，所述的去泛素化酶抑制劑是泛素-こ烯砜。在某些實施例中，具有活性的Uspl4是重組產(chǎn)生的。本發(fā)明另一方面涉及ー種篩選Uspl4抑制劑的方法，包括提供ー種蛋白酶體，所述蛋白酶體包括無酶活性的Uch37，且進ー步包括有酶活性的Uspl4，用所述蛋白酶體與待測化合物和Uspl4底物接觸，并且確定所述待測化合物是否抑制所述底物的去泛素作用。在某些實施例中，所述的底物與報告子偶合，所述報告子在由去泛素酶降解之后可檢測，和/或所述底物是泛素依賴性蛋白酶體底物。在某些實施例中，所述底物是Ub-AMC或聚泛 素化細胞周期蛋白B。在某些實施例中，所述底物的去泛素作用表現(xiàn)為對底物降解的抑制作用。在某些實施例中，所述蛋白酶體包括こ烯砜_Uch37加合物。在某些實施例中，所述Usp 14是重組體蛋白。在某些實施例中，所述蛋白酶體是人蛋白酶體或鼠蛋白酶體。本發(fā)明另一方面涉及ー種試劑盒，其特征在于包括分離得到的蛋白酶體，以及使用說明，所述的蛋白酶體缺乏有酶活性的Uch37并包含有酶活性的Uspl4。在某些實施例中，所述試劑盒包括Uspl4底物。在某些實施例中，所述的Uspl4底物是Ub-AMC和/或聚泛素化周期蛋白B。下文詳述本發(fā)明的其他方面、實施例以及優(yōu)點。此外，上述信息以及下文的詳細說明僅僅解釋本發(fā)明的各方面例證和實施例，為理解本發(fā)明要求的方面和實施例的性能和性質(zhì)提供概述或者構架。附圖簡述圖IA顯示用重組Uspl4蛋白質(zhì)(純化Uspl4)或者親和純化的Uspl4缺陷的人蛋白酶體(人蛋白酶體)以及抗Uspl4抗體得到的免疫印跡。已標識出與Uspl4對應的條帶。圖IB顯示用抗Uch37抗體和純化的Uspl4缺陷的人蛋白酶體(26S)得到的免疫印跡，所述蛋白酶體未經(jīng)Ub-VS處理(-VS)，或者經(jīng)過Ub-VS處理(+VS)。已標識出與Uch37對應的條帶。非特異性條帶以星號標記。圖2A顯示經(jīng)suc-LLVY-AMC膠染色(提示蛋白酶體的存在)的非變性凝膠分析結果。使用市售的人蛋白酶體(Biomol)完成,未經(jīng)處理的、純化的Uspl4缺陷的人蛋白酶體(-Ub-VS)或者經(jīng)Ub-VS處理的、純化的Uspl4缺陷的人蛋白酶體(+Ub-VS)進行試驗。圖2B顯示帶有或不帶GST標簽，純化并重組的野生型Uspl4 (Uspl4-wt)或者催化無活性的突變體Uspl4 (Uspl4-C114A)的考馬斯亮藍(CBB)染色結果，其帶有GST對照(GST)和蛋白質(zhì)大小標記(Marker)。圖2C顯示對單獨蛋白酶體(_)、GST和蛋白酶體(GST)、GST標記的野生型Usp 14和蛋白酶體(GST-Uspl4-wt)、GST標記的催化無活性突變體Usp 14和蛋白酶體(GST_Uspl4_C114A)、未標記的野生型Usp 14和蛋白酶體(Uspl4_wt)或者未標記的催化無活性突變體Usp 14和蛋白酶體(Uspl4-C114A)進行suc-LLVY-AMC膠染色(上圖，為說明蛋白酶體的存在)或者進行考馬斯亮藍(CBB)染色的凝膠遷移實驗的結果。圖3顯示對存在Uspl4活性或者Ub-VS處理過的人蛋白酶體進行Ub-AMC水解作用檢測實驗的結果。
圖4A顯示通過Uspl4和蛋白酶體在I μ M Ub-AMC, InM蛋白酶體中Ub-AMC水解作用初始速率的線性動力學圖(R2X). 99)，已標識出Uspl4的濃度。圖4B顯示在人類蛋白酶體存在25分鐘的情況下，當存在I μΜ Ub_AMC、lnM蛋白酶體時進行的Uspl4依賴性Ub-AMC水解的米氏圖，已標識出Uspl4的濃度。圖4C顯示通過Uspl4和蛋白酶體在4nM Uspl4、InM蛋白酶體時Ub-AMC水解作用初始速率的線性動力學圖(R2X). 99)，已標識出Ub-AMC的濃度。圖4D顯示在Uspl4和人類蛋白酶體存在30分鐘的情況下，當存在4nM UspHUnM蛋白酶體時進行的濃度依賴性的Ub-AMC水解的米氏圖，已標識出Ub-AMC的濃度。圖5顯示使用細胞周期蛋白B特異性抗體進行的免疫印跡檢測，所述蛋白也能夠檢測聚泛素化細胞周期蛋白(Ubn-ClbB)15在這個實驗中，Ubn-ClbB用26S人類蛋白酶體單 獨處理、用人蛋白酶體和野生型Uspl4 (Uspl4-wt)處理、或者用人蛋白酶體和催化無活性的Uspl4 (UspH-CA)處理，隨后用免疫印跡法進行分析。圖6A顯示人Uspl4的圖解，描述了泛素樣(UBL)結構域、催化結構域(CAT)、外顯子4的定位以及Cys114的位置。圖6B顯示人類293細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達Tau和野生型Uspl4(Uspl4_wt)、催化無活性的Uspl4 (Uspl4_CA)、截短形式的Uspl4 (Uspl4_SF)或者缺乏UBL結構域的Uspl4 (Uspl4-AUBL)中的ー項,如上面所示,用Tau、Uspl4或者肌動蛋白特異性抗體染色。圖7顯示293細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達flag標記的Uspl4和在蛋白酶體親和純化前(提取物)或親和純化后(純化的蛋白酶體)被標記的hRpnll，用抗Flag抗體進行染色。這里要注明，在蛋白酶體純化之前將Ub-VS與裂解物共同孵育。提取樣本為總數(shù)的5%。星號為非特異性信號。蛋白酶體亞基Rpnl3，上樣對照。對照樣品，空載體。圖8A顯示ー個高通量大規(guī)模化合物篩選Uspl4催化抑制劑的抑制劑的統(tǒng)計圖。圖8B顯示用來確定AMC猝滅化合物的頻率分布曲線(對照=底部曲線)。圖9A顯示Usp 14抑制劑IUl的化學結構。圖9B顯示IUl對加載Uspl4的蛋白酶體(Uspl4_Ptsm)去泛素化酶活性的抑制作用(左圖)(左ー為O μ M，左ニ為4 μ Μ，左三為8 μ Μ，右一為17 μ Μ)，以及IUl對AMC缺乏熒光淬滅效應(右圖)(左為O μ Μ，右為17 μ Μ)。圖9C顯示IUl對加載Uspl4的蛋白酶體(Uspl4_Ptsm)去泛素化酶活性的抑制作用(左圖)(左為O μ M，中為8 μ M，右為17 μ Μ)，以及IUl對異肽酶T (IsoT)缺乏抑制作用(右圖)(左為ΟμΜ，中為8μΜ，右為17μΜ)。圖9D顯示溶劑(DMSO)、IUl或IUlC對沒有與蛋白酶體結合的Uspl4缺乏抑制作用。圖9E顯示溶劑(DMSO)或者IUl對未經(jīng)Ub-VS處理的26S人蛋白酶體(Ptsm)(8ロ，缺少Usp 14的蛋白酶體)缺乏抑制作用。圖IOA顯示IUlC的化學結構，IUl的無活性對照化合物。圖IOB顯示對IUl的去泛素化酶抑制活性(下部圓形，下部三角形)與IUlC的去泛素化酶抑制活性(上部圓形，上部三角形，正方形)的比較。圖IOC顯示IUlC在促進Tau降解方面的無效性。使用MEF細胞裂解物進行免疫印跡，所述細胞共表達Tau和Uspl4，用0、25、50、75或者100 μ M的IUlC處理，以及用Tau或肌動蛋白特異性抗體染色。圖IOD顯示IUlC對標識的去泛素化酶活性的抑制作用(左為O μ Μ，右為17 μ Μ)。圖IlA顯示與Uspl4、IsoT或者Uch37結合的蛋白酶體的去泛素化酶活性，所述的蛋白酶體已用標識濃度的IUl處理。圖IlB顯示IUl對標識的去泛素化酶活性的抑制作用(左為O μ M，右為17 μ Μ)。

圖12Α顯示純化的26S人蛋白酶體Γ4ηΜ)的免疫印跡，所述的蛋白酶體在存在或不存在Uspl4 (80nM)的環(huán)境下孵育，在所示濃度用溶劑(DMSO)、IUlC或者IUl處理，用Uspl4或者Alpha7特異性抗體染色。星號(*)表示抗Uspl4抗體產(chǎn)生的非特異性信號。 圖12B顯示了圖12A的免疫印跡，除此之外還有，在存在或不存在標識的化合物(30 μ M)的情況下，超出 2倍摩爾數(shù)的Uspl4與蛋白酶體共同孵育。圖13顯示與Uspl4結合的蛋白酶體的去泛素化活性，其經(jīng)溶劑(對照)或者IUl處理，并對其進行標識次數(shù)的超濾(左圖為旋轉；左為無旋轉，中為Ix旋轉，右為3x旋轉),或旋轉柱凝膠過濾(右圖；左為對照，右為IU1)。圖14A顯示與Uspl4結合的蛋白酶體的IC5tl曲線，通過標識濃度的IUl處理45分鐘。圖14B顯示與Uspl4結合的蛋白酶體的IC5tl曲線，通過標識濃度的IUl處理30分鐘。圖15顯示用細胞周期蛋白B和聚泛素化周期蛋白(Ubn-ClbB)的特異性抗體得到的免疫印跡，所述抗體用4nM的26S人蛋白酶體單獨處理,或與野生型Uspl4 (Uspl4_wt)、IU1、和/或標識的蛋白酶體抑制劑共同處理。此免疫印跡進行長時間暴露(Long exp)或者短時間暴露(Short exp)ο圖16A顯示用細胞周期蛋白B和聚泛素化周期蛋白(Ubn-ClbB)的特異性抗體得到的免疫印跡，所述抗體用4nM的26S人蛋白酶體單獨處理，或與野生型Uspl4 (60nM)及溶劑或IUl (34 μ M)聯(lián)合處理。圖16Β顯不用T7_tagged SiclPY和聚泛素化SiclPY (Ubn_SiclPY)的特異性抗體得到的免疫印跡，所述抗體用5nM的26S人蛋白酶體單獨處理，或與野生型Uspl4 (75nM)及溶劑或IUl (75 μ M)聯(lián)合處理。圖17顯示對MEF細胞裂解物采用液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)痕量法測定的離子計數(shù)，所述細胞未經(jīng)IUl處理(無IUl),或者已經(jīng)IUl處理I或24小時。下圖表示I μ g/mLIUl標準溶液的離子計數(shù)。圖18表示不同濃度IUl標準品的LC/MS痕量測定的離子計數(shù)。圖19顯示IUl的紫外光譜，表示吸收光譜在255nm和305nm的最大值(左)以及在300nm下IUl細胞內(nèi)吞的時間依賴性的高效液相色譜圖(右)。圖20A顯示經(jīng)UV吸收試驗測定的細胞數(shù)標準化后，MEF細胞中的IUl濃度。圖20B顯示經(jīng)UV吸收試驗測定的細胞數(shù)標準化后，293細胞中的IUl濃度。圖21A顯示MEF細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達Tau和Uspl4，用0、25、50,75或100 μ M IUl處理，用Tau、LacZ或肌動蛋白特異性抗體染色。圖21Β顯示MEF細胞中Tau RNA水平的定量RT-PCR分析結果，所述細胞共表達Tau 和 Uspl4,并用 0、25、50、75 或 100 μ M IUl 處理。圖22Α顯示MEF細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達TDP43fag和Uspl4，并用75 μ M IUl處理標識的時間，用TDP43flag、LacZ或肌動蛋白特異性抗體染色。圖22B顯示MEF細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達Atx3_Q80或Atx3_Q22二者之ー以及Uspl4，并用0、50或100 μ M IUl處理標識的時間，用Atx3或肌動蛋白特異性抗體染色。 圖22C顯示MEF細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達野生型GFAP(GFAP-wt)、K36Q 突變體 GFAP (GFAP-K63Q)或 E210K GFAP (GFAP-E210K)三者之ー以及 Uspl4，并用 O、25,50或100 μ M IUl處理標識的時間，用GFAP或肌動蛋白特異性抗體染色。圖22D顯示MEF細胞中TDP-43RNA水平的定量RT-PCR分析結果，所述細胞共表達TDP-43和Uspl4，并用75 μ M IUl處理各個標識的時間。圖23Α顯示抗-DNPH或抗肌動蛋白抗體染色的免疫印跡,如圖所示,用MEF細胞的經(jīng)DNPH處理的裂解物進行試驗，在溶劑或75 μ M IUl中預孵育，并用63 μ M甲萘醌處理。圖23Β顯示抗-DNPH或抗肌動蛋白抗體染色的免疫印跡，如圖所示，用ΗΕΚ293細胞的經(jīng)DNPH處理的裂解物進行試驗，ΗΕΚ293細胞在IUl (75 μ Μ)或蛋白酶體抑制劑(20 μ MMG132, 10 μ M PS-341)中預孵育4小時，并用甲萘醌(300 μ Μ)處理60分鐘。圖24顯示用MTT檢測評價MEF細胞活力的圖表，所述細胞經(jīng)標識濃度的IUl處理48小時。圖25Α顯示用MTT檢測評價MEF細胞活力的圖表，所述細胞經(jīng)標識濃度的IUl處通6小時。圖25Β顯示用MTT檢測評價MEF細胞活力的圖表，所述細胞經(jīng)標識濃度的IUl處理12小時。圖25C顯示用MTT檢測評價MEF細胞活力的圖表，所述細胞經(jīng)標識濃度的IUl處理24小時。圖26Α顯示用MTT檢測評價293和HeLa細胞活力的圖表，所述細胞經(jīng)標識濃度的IUl處理6小時。圖26Β顯示用MTT檢測評價293和HeLa細胞活力的圖表，所述細胞經(jīng)標識濃度的IUl處理12小時。圖26C顯示用MTT檢測評價293和HeLa細胞活力的圖表，所述細胞經(jīng)標識濃度的IUl處理24小時。圖27Α顯示經(jīng)TUNEL染色的MEF細胞的熒光顯微圖像，所述細胞用100 μ M IUl或?qū)φ仗幚?小時。圖27Β顯示如圖31Α所述的TUNEL染色分析的定量圖表。圖28顯示用標識濃度的溶劑或IUl處理標識時間的MEF細胞的融合百分率。圖29顯示ー種制備本發(fā)明化合物的方法。圖30顯示細胞活力的MTT檢測結果；特別是，IUl通過氧化應激影響細胞存活。用甲萘醌(劑量依賴性，4小時)和IUl (50uM，6小時)在HEK293細胞中進行試驗。MEF細胞也顯示上述作用。甲萘醌對IC5tl的上述作用約為4倍。圖31顯示本發(fā)明選定化合物的列表，包括某些抑制百分率和IC5tl值。抑制百分率由 8μΜ 的 IUl-I 至 υ-46，4μΜ 的 IU1-47 至 IU1-96 和 17μΜ 的 C，I 至 C，9 測定。圖31Α顯示Uspl4-/_MEF細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達tau和LacZ，用0、25、50、75或ΙΟΟμΜ IUl處理，用tau、LacZ或肌動蛋白特異性抗體染色。圖31B顯示Uspl4-/_MEF細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達TDP_43flag和LacZ，用75 μ M IUl處理所示時間，用TDP_43flag、LacZ或肌動蛋白特異性抗體染色。圖32顯示野生型MEF細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達tau和ub非依賴性蛋白酶體底物cODCEGFP，用50 μ M IUl培養(yǎng)6小時，用tau、cODC-EGFP或肌動蛋白特異性抗體染色。在裂解之前4小時處理蛋白酶體抑制劑(30 μ M MG132U0yM PS-341)。圖33顯示野生型MEF細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞共表達HA-標記Ub和/或Flag-標記TDP-43，用50 μ M IUl培養(yǎng)6小時，用Flag_TDP_43、HA-Ub或肌動蛋白特異 性抗體染色。在裂解之前4小時加入蛋白酶體抑制劑(20 μ M MG132U0yM PS-341)。箭頭表示可能是泛素化的TDP-43種類。HC表示抗體的重鏈。圖34A顯示野生型或UspH+MEF細胞裂解物的免疫印跡。所述細胞經(jīng)IUl (O、25、50、75或ΙΟΟμΜ)處理6小時，用Ub、肌動蛋白、CP亞基α 7或RP亞基mRPT5染色。圖34B顯示圖34A中泛素水平的定量。在多種濃度的IUl處理后，測定野生型或UspHvIffiF細胞聚泛素和單體泛素水平的量。Ub信號標準化至內(nèi)源性肌動蛋白。通過膠片成象的密度測定獲得量化值(左ー為聚UB (+/+MEF);左ニ為聚Ub (UspH+MEF);左三為單體 Ub (+/+MEF);右一為單體 Ub (Uspl4^MEF))0圖35A顯示不依賴于Ub-AMC濃度的Uspl4特異性的IU1。除非使用低濃度的Ub-AMC，否則Ub-AMC水解的測定如圖IlB所述(左為ΟμΜ ;右為17 μ Μ)。圖35Β顯示本研究中去泛素化酶的Ub-AMC的Km值概述。選擇性試驗中使用的DUB的Km值取自文獻。本研究所測定的未知Km值如圖所示。這些值是顯著的，因為底物相對于所述酶的Km為低濃度吋，DUB測定對抑制作用最為敏感。CD，催化區(qū)域。圖36顯示IUl抑制蛋白酶體相關的Uspl4活性，其沒有可測定的延遲期。將2. 5nM的人蛋白酶體與30nM的重組體Uspl4蛋白混合。然后加入I μ M Ub-AMC啟動反應。30分鐘后，向樣品中加入IUl (ΙΟΟμΜ)或溶劑(DMS0)。圖37除已檢測的長期培養(yǎng)(5和8小時)夕卜，其余部分驗證圖13。將Uspl4百分率活性標準化為26S肽酶活性卿，LLVY-AMC水解)。加入IUl至100 μ M (左為DMSO ;右為皿)。圖38顯示在ADP (ADP預處理)存在的條件下，用純化的人蛋白酶體進行體外鏈切邊試驗，并在ADP存在的條件下測定的結果。用人細胞周期蛋白B (CCNB)的特異性抗體進行免疫印跡。如Ub-AMC水解數(shù)據(jù)所預期的，IUl在約5 μ M時對鏈切邊起抑制作用。圖39顯示在UspH-CA存在的條件下，IUl不影響細胞周期蛋白B的降解。檢測與圖5中進行的一致。圖40Α顯示IUl的1H-NMR光譜數(shù)據(jù)。圖40Β顯示IUl的LC/MS分析結果。TIC，總離子計數(shù)。SPC，從標識的保留時間峰提取的共有峰計算。圖41Α顯示IUlC的1H-NMR光譜數(shù)據(jù)。圖41Β顯示IUlC的LC/MS分析結果。TIC，總離子計數(shù)。SPC，從標識的保留時間峰提取的共有峰計算。圖42A顯示野生型MEF細胞中內(nèi)化IUl的快速釋放。用50 μ M的IUl培養(yǎng)野生型MEFl小時后，將培養(yǎng)基替換為不含IUl的新鮮培養(yǎng)基。在標識的時間點監(jiān)測內(nèi)化IU1，井根據(jù)UV吸收檢測測定以細胞數(shù)標準化的濃度。圖42Β顯示ΗΕΚ293細胞在含血清培養(yǎng)基中I小時至48小時IUl的相當濃度。圖42C顯示UspH+MEF細胞在含血清培養(yǎng)基中I小時至48小時IUl的相當濃度。圖43Α顯示野生型MEF中IUl處理后tau水平的定量分析結果。用Odyssey成像系統(tǒng)通過紅外共軛染色的ニ抗進行定量。Tau信號強度標準化至其內(nèi)源肌動蛋白，并顯示相對量。

圖43B顯示UspH+MEFs中IUl處理后tau水平的定量分析結果。按照圖43A所述的方法進行定量。圖44A表示野生型MEF經(jīng)200 μ M洛霉素Al (BafAl)處理6小時后，瞬時表達mCherry-NBRl (上一行)免疫熒光信號強度顯著性增強，洛霉素A1是ー種自溶體形成抑制齊 。圖44Β表示IUl對tau降解的促進作用不受細胞自體吞曬作用的介導。使用tau表達質(zhì)粒轉染野生型MEF細胞，然后用200 μ M BafAl和/或75 μ M IUl處理6小時，并用SDS-PAGE/Odyssey紅外成像系統(tǒng)的免疫印跡法對其進行分析。圖44C表示使用Odyssey軟件對圖44B中三個獨立試驗(平均值土 SD)所得的標準化tau蛋白質(zhì)水平的定量測定結果。圖45A表示IUl處理不會影響蛋白酶體的完整性。IUl處理(100 μ M)6小時之前和之后的總細胞提取物(50 μ g/道)經(jīng)非變性PAGE區(qū)分，使用熒光肽底物的膠上活性染色法(LLVY-AMC)或亞基α 6特異性抗體的免疫印跡法目測蛋白酶體。RP2-CP和RP-CP表示不同形式的26S蛋白酶體。圖45Β表示IUl處理不會誘導Psmb5基因的轉錄，其中Psmb5基因是蛋白酶體亞基。將包含鼠源性Psmb5啟動子(-Ikb至Okb)的熒光素酶報告子基因在野生型和UspHvIffiF中瞬間表達，且在25或50 μ M IUl中培養(yǎng)8小時后測定啟動子活性。為標準化熒光素酶活性，用無啟動子的PGL3質(zhì)粒進行對照試驗。所得數(shù)值為三次獨立試驗的平均值土SD。RLU，相對光單位。圖45C表示IUl處理不會誘導UbB的轉錄，其中UbB是泛素基因。用在不同劑量IUl中培養(yǎng)6小時、源自+/+ (左)和UspH+MEF (右)的總mRNA進行定量RT-PCR。圖4 表示IUl處理不會誘導α 6的轉錄，其中α 6是蛋白酶體亞單位。用在不同劑量IUl中培養(yǎng)6小時、源自+/+ (左)和UspH+MEF (右)的總mRNA進行定量RT-PCR。圖45E表示IUl處理不會誘導α 7的轉錄，其中α 7是蛋白酶體亞單位。用在不同劑量IUl中培養(yǎng)6小時、源自+/+ (左)和UspH+MEF (右)的總mRNA進行定量RT-PCR。圖46A為顯示細胞活力的MTT檢測結果，特別是，IUlC通過氧化應激對細胞活力的影響。用甲萘醌(劑量依賴性，4小時)和IUlC (50uM，6小時)在HEK293細胞中進行試驗。圖46B顯示野生型MEF細胞中內(nèi)化IUlC的濃度。用50uM IUlC處理標識的時間段后，使用LC/MS檢測IUlC水平。用UV吸收試驗測定的細胞數(shù)對濃度進行標準化。圖46C顯示野生型293細胞中內(nèi)化IUlC的濃度。用50uM IUlC處理標識的時間段后，使用LC/MS檢測IUlC水平。用UV吸收試驗測定的細胞數(shù)對濃度進行標準化。圖46D顯示野生型MEF細胞中內(nèi)化IUlC的快速釋放。按照圖42A進行實驗。圖46E顯示293細胞中內(nèi)化IUlC的快速釋放。按照圖42A進行實驗。圖47顯示野生型MEF細胞裂解物的免疫印跡，所述細胞瞬時表達Tau，用0、20、40,60或80 μ M的IU1-47處理，并用Tau特異性抗體染色。IU1-47是ー種更為有效的IUl衍生物。發(fā)明詳述蛋白質(zhì)病是由異常或錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集引起的ー類疾病和病癥。通常，或可能典型地，通過蛋白酶體介導的降解作用將上述蛋白質(zhì)從細胞中清除。但是，在蛋白質(zhì)病的 情況下，蛋白酶體不足以有效地清除所有有害的蛋白質(zhì)并防止形成致病聚合體。 如本發(fā)明證明的，在正常生長情況下，與底物結合的泛素鏈被Uspl4修切后容易引起蛋白酶體的持續(xù)性抑制。修切的泛素鏈抑制蛋白酶體，因為它將可被蛋白酶體識別的信號(泛素鏈)從蛋白酶體底物上移除；使得與蛋白酶體結合的底物可在不降解的情況下即發(fā)生逸出。因此，Uspl4修切鏈的抑制劑通過蛋白酶體提高蛋白質(zhì)的降解作用。這樣，根據(jù)上述抑制機制，哺乳動物的蛋白酶體途徑通常并不是全效運行的，因為Uspl4部分地抑制了該途徑。本發(fā)明提供的方法和組合物通過抑制Uspl4去泛素化酶活性從而提高蛋白酶體活性。如本發(fā)明證明的，蛋白酶體活性的提高，增強了細胞對異?；蝈e誤折疊蛋白質(zhì)的清除能力，包括那些與人類疾病相關的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明提供的方法和組合物用于提高蛋白酶體功能以及治療蛋白質(zhì)病。定義為了使本發(fā)明更易于理解，定義某些名詞和術語如下，并貫穿用于整個說明書。本申請使用的冠詞“ー個”指的是ー個或多于ー個(B卩，至少ー個)語法上的冠詞對象。舉例來說，“ー個元素”表示ー個元素或多于ー個的元素。本申請的說明書和權利要求書中使用的短語“和/或”應理解為相關元素的“分別或同吋”，例如，元素在某些情況下聯(lián)合存在，在另ー些情況下分離存在。被列為“和/或”的多個元素應以相同方式理解，即，“一個或多個”聯(lián)合的元素。除了 “和/或”從句特殊定義的元素外，可任選存在與特殊定義元素相關或不相關的其他元素。因此，作為非限制性的示例，參考“A和/或B”，用于連接開放性詞語例如“包括”時，在一實施例中，理解為僅是A(可任選地包括除B以外的元素)；在另ー實施例中，理解為僅是B (可任選地包括除A以外的元素)；在又一實施例中，理解為A和B (可任選地包括其他元素) ，等。本申請的說明書和權利要求書中使用的“或”應理解為與上述定義的“和/或”具有相同的含義。例如，列表中的分隔項，“或”和“和/或”應解釋為包含的，即，不僅包括若干或系列元素的至少ー個，還包括多于ー個，并且，可任選地，附加的未列出項。只有明確指出相反含義的術語，例如“僅其一”或“恰其一”，或者，權利要求中使用的“由……組成”，應理解為包含若干或系列元素的僅僅ー個。通常，當本發(fā)明使用的術語“或”綴有排除性術語時，例如，“任一的”、“之一的”、“唯一的”、“恰其ー的”，理解為僅表示排他性的替代方案(即，“ー個或另ー個但并非二者都”)，“基本上由……組成”用于權利要求中時，表示專利法領域的通常含義。
本申請的說明書和權利要求書中使用的短語“至少ー個”，涉及一系列的一個或多個元素，應理解為表示選自列表元素中的任意ー個或多個，但不必須包括列表元素中被特殊列舉的每個或所有元素中的至少ー個，也不排除列表元素中的任何元素的結合。該定義還理解為除列表元素中短語“至少ー個”所特殊定義的元素外，還可任選地存在與其相關或不相關的其他元素。因此，作為非限制性的示例，“A和B中至少ー個”(或，同意義的，“A或B中至少ー個”，或，同意義的，“A和/或B中至少ー個”)，在一實施例中，可理解為至少ー個A，可任選地包括多于ー個A，不存在B (并且可任選地包括除B以外的元素);在另ー實施例中，至少ー個B，可任選地包括多于ー個B，不存在A (并且可任選地包括除A以外的元素)；在又一實施例中，可理解為至少ー個A，可任選地包括多于ー個A，和至少ー個B，可任選地包括多于ー個B (可任選地包括其他元素)等。同時，除非存在明確的相反指示，否則也應理解，本發(fā)明要求保護的多于ー步步驟或エ藝的方法中，所述方法的步驟或エ藝的順序并不限于其所列舉的順序。在權利要求書以及上述說明書中，所有過渡性詞語，例如“包含”、“包括”、“含有”、 “有”、“涵蓋”、“涉及”、“具有”、“構成”等等應被理解為開放式的，即，表示包括但不限干。僅過渡性詞語“由……組成”和“基本上由……組成”分別為封閉式或半封閉式過渡性詞語，如美國專利局專利審查規(guī)程手冊第2111. 03部分所述。如燒基、m、η等等姆個表述的定義，當他們在任意結構中出現(xiàn)超過一次時，在同一結構中的定義被認定為獨立于其他位置出現(xiàn)的定義。應理解，“取代”或“用……取代”包含隱含條件，即需根據(jù)被取代原子和取代基允許的化學價進行所述的取代，且取代后產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如，不會通過如重排、環(huán)化、消除或其他反應自發(fā)地進行轉化的化合物。術語“取代”還預期地包括所有有機化合物允許的取代基。廣泛的方面，允許的取代基包括有機化合物的無環(huán)的和環(huán)狀的、支鏈的和無支鏈的、碳環(huán)的和雜環(huán)的、芳香族的和非芳香族的取代基。示例性的取代基包括，例如，如下所述。所述允許的取代基對于合適的有機化合物可以是ー個或多個相同或不同的取代基。對于本發(fā)明而言，雜原子例如氮可具有氫取代基和/或本申請所述的滿足雜原子化學價的有機化合物任何允許的取代基。本發(fā)明不受限于任何形式的有機化合物允許的取代基。術語“低級”附加于任何下列基團時，表示該基團含有少于7個碳原子(即6個碳原子或更少)。例如“低級烷基”表示含有1-6個碳原子的烷基基團，“低級烯基”表示含有
2-6個碳原子的烯基基團。本申請中使用的術語“飽和的”表示不具有任何碳碳雙鍵或碳碳三鍵的化合物和
/或基團。本申請中使用的術語“不飽和的”表示具有至少ー個碳碳雙鍵或碳碳三鍵的化合
物和/或基團。本申請中使用的術語“脂肪族的”表示具有直鏈或支鏈，但非環(huán)狀(也稱為“無環(huán)族的”或“開鏈式的”基團)的化合物和/或基團。本申請中使用的術語“環(huán)的”表示具有ー個、兩個或多個環(huán)(例，螺合、稠合、橋合)的化合物和/或基團。術語“芳香族的”表示平面或多環(huán)結構，其特征在于包括4η+2電子的周期性共軛分子部分，其中η為整數(shù)的絕對值。包含螺接或連接環(huán)的芳香族分子還被稱為ニ環(huán)芳香族環(huán)。例如，烴環(huán)結構中含有雜原子的ニ環(huán)芳香族環(huán)稱為ニ環(huán)雜芳基環(huán)。本申請中使用的術語“烴”表示完全由氫和碳組成的有機化合物。就本發(fā)明而言，化學元素與元素周期表，CAS版，化學和物理學手冊第67版，1986-87內(nèi)頁所記載的一致。本申請中使用的術語“雜原子”為本領域公知的，表示除碳或氫以外的任何元素的原子。示例性雜原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒。術語“烷基”表示含有I至12個碳原子的脂肪族或環(huán)烴基團。烷基的典型示例包括，但不限干，甲基、こ基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、2-甲基環(huán)戊基和I-環(huán)己基こ基。
術語“取代烷基”表示被1、2、3、4、或5個取代基取代的含有I至12個碳原子的
脂肪族或環(huán)烴基團，所述取代基獨立地選自以下基團組成的組烷基、烯基、炔基、鹵素、鹵
代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、稀基氧基、塊基氧基、碳環(huán)基氧基、雜環(huán)基氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、疏基、硫代焼基、齒代硫代焼基、氣代硫代焼基、硫代稀基、硫代塊基、橫酸、烷基磺酰基、齒代烷基磺?；⒎榛酋；⑾┗酋；?、炔基磺?；?、烷氧基磺?；?、鹵代烷氧基磺?；?、氟代烷氧基磺酰基、烯基氧基磺酰基、炔基氧基磺酰基、氨基磺?；?、亞橫酸、焼基亞硫酸基、齒代焼基亞硫酸基、氣代焼基亞硫酸基、稀基亞硫酸基、塊基亞硫酉先基、焼氧基亞硫酸基、齒代焼氧基亞硫酸基、氣代焼氧基亞硫酸基、稀基氧基亞硫酸基、塊基氧基亞硫酸基、氣基亞硫酸基、甲酸基、焼基擬基、齒代焼基擬基、氣代焼基擬基、稀基擬基、塊基擬基、駿基、焼氧基擬基、齒代焼氧基擬基、氣代焼氧基擬基、稀基氧基擬基、塊基氧基擬基、焼基擬基氧基、齒代焼基擬基氧基、氣代焼基擬基氧基、稀基擬基氧基、塊基擬基氧基、烷基磺?；趸?、南代烷基磺酰基氧基、氟代烷基磺?；趸?、烯基磺酰基氧基、炔基磺?；趸?、齒代烷氧基磺?；趸?、氟代烷氧基磺?；趸⑾┗趸酋；趸⑷不趸鶛M酸基氧基、焼基亞硫酸基氧基、齒代焼基亞硫酸基氧基、氣代焼基亞硫酸基氧基、稀基亞硫酸基氧基、塊基亞硫酸基氧基、焼氧基亞硫酸基氧基、齒代焼氧基亞硫酸基氧基、氣代焼氧基亞硫酸基氧基、稀基氧基亞硫酸基氧基、塊基氧基亞硫酸基氧基、氣基亞硫酸基氧基、氨基、酰胺基、氨基磺?；被鶃喠蝓；?、氰基、硝基、疊氮基、氧膦基、磷酰基、甲硅烷基和甲娃焼基氧基。術語“亞烷基”為本領域公知的，本申請中使用的“亞烷基”如上所述，屬于移除烷基基團的兩個氫原子后得到的雙配位基部分。本申請中使用的術語“烯基”表示含有2至10個碳且含有至少ー個通過移除兩個氫后形成的碳碳雙鍵的直鏈或支鏈烴。烯基的典型示例包括，但不限于，乙烯基、2-丙烯基、2_甲基-2_丙稀基、3_丁稀基、4_戊稀基、5_己稀基、2_庚稀基、2_甲基-1-庚稀基和3-癸稀基。本申請中使用的術語“炔基”表示含有2至10個碳且含有至少ー個碳碳三鍵的直鏈或支鏈烴。炔基的典型示例包括，但不限于，乙炔基、I-丙炔基、2-丙炔基、3-丁炔基、2_戊炔基和I- 丁炔基。本申請中使用的術語“碳環(huán)基”表示含有3至12個碳原子的全飽和或具有ー個或多個不飽和鍵的單環(huán)或多環(huán)(如、ニ環(huán)、三環(huán)等)烴，為避免發(fā)生混淆，該不飽和度不產(chǎn)生芳香環(huán)系統(tǒng)(如苯環(huán))。碳環(huán)基基團示例包括I-環(huán)丙基、I-環(huán)丁基、2-環(huán)戊基、I-環(huán)戊烯基、
3-環(huán)己基、I-環(huán)己烯基和2-環(huán)戊烯甲基。本申請中使用的術語“雜環(huán)基”包括非芳香族環(huán)系統(tǒng)，包括但不限于單環(huán)、雙環(huán)(如稠環(huán)或螺環(huán))和三環(huán)，其可為全飽和或包括一個或多個不飽和単元，為避免發(fā)生混淆，該不飽和度不產(chǎn)生芳香環(huán)系統(tǒng)；并含有3至12個原子，包括至少ー個雜原子，如氮、氧、硫。就示例而言，并不限制本發(fā)明的范圍，雜環(huán)基的示例如下氮雜卓基、氮雜啶基、嗎啉基、氧代哌啶烷基、氧代吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、喹寧烷基、硫代嗎啉基、四氫吡喃基和四氫呋喃基。本發(fā)明的雜環(huán)基獨立地被0、1、2、3、4或5個選自以下群組的取代基取代烷基、稀基、塊基、齒素、齒代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、稀基氧基、塊基氧基、碳環(huán)基氧基、雜環(huán)基氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、疏基、硫代焼基、齒代硫代焼基、氣代硫代焼基、硫代烯基、硫代炔基、磺酸、烷基磺?；?、齒代烷基磺?；⒎榛酋；?、烯基磺?；?、炔基磺?；?、烷氧基磺酰基、南代烷氧基磺?；⒎檠趸酋；?、烯基氧基磺?；?、炔基氧基磺酉先基、氣基橫酸基、亞橫酸、焼基亞硫酸基、齒代焼基亞硫酸基、氣代焼基亞硫酸基、稀基亞硫酉先基、塊基亞硫酸基、焼氧基亞硫酸基、齒代焼氧基亞硫酸基、氣代焼氧基亞硫酸基、稀基 氧基亞硫酸基、塊基氧基亞硫酸基、氣基亞硫酸基、甲酸基、焼基擬基、齒代焼基擬基、氣代焼基擬基、稀基擬基、塊基擬基、駿基、焼氧基擬基、齒代焼氧基擬基、氣代焼氧基擬基、稀基氧基擬基、塊基氧基擬基、焼基擬基氧基、齒代焼基擬基氧基、氣代焼基擬基氧基、稀基擬基氧基、炔基羰基氧基、烷基磺酰基氧基、南代烷基磺?；趸⒎榛酋；趸?、烯基磺酰基氧基、炔基磺酰基氧基、齒代烷氧基磺酰基氧基、氟代烷氧基磺?；趸⑾┗趸怯舷然趸K基氧基橫酸基氧基、焼基亞硫酸基氧基、齒代焼基亞硫酸基氧基、氣代焼基亞硫酉先基氧基、稀基亞硫酸基氧基、塊基亞硫酸基氧基、焼氧基亞硫酸基氧基、齒代焼氧基亞硫酉先基氧基、氣代焼氧基亞硫酸基氧基、稀基氧基亞硫酸基氧基、塊基氧基亞硫酸基氧基、氨基亞硫?；趸被?、酰胺基、氨基磺酰基、氨基亞硫?；⑶杌?、硝基、疊氮基、氧膦基、磷?；⒓坠柰榛?、甲硅烷基氧基以及任何通過亞烷基部分(如，亞甲烷基)與雜環(huán)基相連的所述取代基。本申請中使用的術語“N-雜環(huán)基”為雜環(huán)基的亞結構，此處定義為具有至少ー個氮原子連接N-雜環(huán)基部分與母體部分。典型示例包括吡咯烷-I-基、哌啶-I-基、哌嗪-I-基、六氫嘧啶-I-基、嗎啉-I-基、1、3_噁唑-3-基和6-氮雜螺[2.5]辛烷-6-基。作為雜環(huán)基基團，本發(fā)明的N-雜環(huán)基獨立地被0、1、2、3、4或5個選自以下組的取代基取代烷基、烯
基、塊基、 "素、 "代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、稀基氧基、塊基氧基、碳環(huán)基氧基、雜環(huán)基氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、疏基、硫代焼基、齒代硫代焼基、氣代硫代焼基、硫代稀基、硫代塊基、橫酸、焼基橫酸基、齒代焼基橫酸基、氣代焼基橫酸基、稀基橫酸基、塊基橫酉先基、烷氧基磺?；?、南代烷氧基磺?；⒎檠趸酋；?、烯基氧基磺?；?、炔基氧基磺?；饣鶛M酸基、亞橫酸、焼基亞硫酸基、齒代焼基亞硫酸基、氣代焼基亞硫酸基、稀基亞硫酉先基、塊基亞硫酸基、焼氧基亞硫酸基、齒代焼氧基亞硫酸基、氣代焼氧基亞硫酸基、稀基氧基亞硫酸基、塊基氧基亞硫酸基、氣基亞硫酸基、甲酸基、焼基擬基、齒代焼基擬基、氣代焼基擬基、稀基擬基、塊基擬基、駿基、焼氧基擬基、齒代焼氧基擬基、氣代焼氧基擬基、稀基氧基擬基、塊基氧基擬基、焼基擬基氧基、齒代焼基擬基氧基、氣代焼基擬基氧基、稀基擬基氧基、炔基羰基氧基、烷基磺?；趸?、南代烷基磺?；趸?、氟代烷基磺?；趸?、烯基磺酰基氧基、炔基磺?；趸?、齒代烷氧基磺?；趸?、氟代烷氧基磺?；趸⑾┗趸酋；趸K基氧基橫酸基氧基、燒基亞硫酸基氧基、齒代燒基亞硫酸基氧基、氣代燒基亞硫酸基氧基、稀基亞硫酸基氧基、塊基亞硫酸基氧基、燒氧基亞硫酸基氧基、齒代燒氧基亞硫酸基氧基、氣代燒氧基亞硫酸基氧基、稀基氧基亞硫酸基氧基、塊基氧基亞硫酸基氧基、氣基亞硫?；趸?、氨基、酰胺基、氨基磺酰基、氨基亞硫?；?、氰基、硝基、疊氮基、氧膦基、磷?；?、甲硅烷基、甲硅烷基氧基以及任何通過亞烷基部分(如，亞甲烷基)與雜環(huán)基相連的所述取代基。本申請中使用的術語“芳基” 表示苯基、萘基或蒽基基團。本發(fā)明的芳基可選地被O、1、2、3、4或5個獨立地選自以下群組的取代基取代燒基、稀基、塊基、齒素、齒代燒基、氣代燒基、輕基、燒氧基、稀基氧基、塊基氧基、碳環(huán)基氧基、雜環(huán)基氧基、齒代燒氧基、氣代燒基氧基、疏基、硫代燒基、齒代硫代燒基、氣代硫代燒基、硫代稀基、硫代塊基、橫酸、燒基橫酰基、齒代烷基磺酰基、氟代烷基磺?；?、烯基磺?；?、炔基磺?；⑼檠趸酋；?、齒代烷氧基磺?；?、氟代烷氧基磺酰基、烯基氧基磺?；?、炔基氧基磺?；被酋；?、亞磺酸、燒基亞硫酸基、齒代燒基亞硫酸基、氣代燒基亞硫酸基、稀基亞硫酸基、塊基亞硫酸基、燒氧基亞硫酸基、齒代燒氧基亞硫酸基、氣代燒氧基亞硫酸基、稀基氧基亞硫酸基、塊基氧基亞硫酸基、氣基亞硫酸基、甲酸基、燒基擬基、齒代燒基擬基、氣代燒基擬基、稀基擬基、塊基擬基、竣基、燒氧基擬基、齒代燒氧基擬基、氣代燒氧基擬基、稀基氧基擬基、塊基氧基擬基、燒基擬基氧基、齒代燒基擬基氧基、氣代燒基擬基氧基、稀基擬基氧基、塊基擬基氧基、燒基橫?；趸?、南代烷基磺酰基氧基、氟代烷基磺?；趸?、烯基磺?；趸?、炔基磺?；趸Ⅺu代烷氧基磺?；趸?、氟代烷氧基磺?；趸?、烯基氧基磺?；趸?、炔基氧基磺?；趸?、燒基亞硫酸基氧基、齒代燒基亞硫酸基氧基、氣代燒基亞硫酸基氧基、稀基亞硫酸基氧基、塊基亞硫酸基氧基、燒氧基亞硫酸基氧基、齒代燒氧基亞硫酸基氧基、氣代燒氧基亞硫?；趸?、烯基氧基亞硫?；趸⑷不趸鶃喠蝓；趸被鶃喠蝓；趸?、氨基、酰胺基、氣基橫酸基、氣基亞硫酸基、氰1基、硝基、置氣基、氧勝基、憐酸基、甲娃燒基、甲娃燒基氧基以及任何通過亞烷基部分(如，亞甲烷基)與雜環(huán)基相連的所述取代基。術語“亞芳基”為本領域公知的，本發(fā)明中使用的“亞芳基”如上所述，表示移除芳基環(huán)的兩個氫原子后得到的雙配位基部分。本申請中使用的術語“芳烷基”或“烷基取代的芳基”表示本文定義的芳基基團在其母體分子部分附加本文限定的烷基基團。芳烷基的典型示例包括，但不限于，芐基、2-苯こ基、3-苯丙基和2-萘-2基こ基。本申請中使用的“ニ芳基”表示被芳基取代的芳基、芳基取代的雜芳基、雜芳基取代的芳基或雜芳基取代的雜芳基，其中芳基和雜芳基如本文定義。典型示例包括4-(苯基)苯基和4-(4-氟代苯基)吡啶基。本申請中使用的“雜芳基”包括芳環(huán)系，包括，但不限于單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)，并具有3至12個原子，包括至少ー個雜原子，例如氮、氧或硫。就示例而言，并不限制本發(fā)明的范圍，舉例如下氮雜吲哚基、苯并(b)噻吩基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻ニ唑基、苯并三唑基、苯并噁ニ唑基、呋喃基、咪唑基、咪唑并吡啶基、吲哚基、ニ氫吲哚基、吲唑基、異ニ氫氮茚基、異噁唑基、異噻唑基、異喹啉基、噁ニ唑基、噁唑基、嘌呤基、批喃基、批嗪基、吡唑基、批啶基、嘧啶基、批咯基、批咯并[2，3-d]嘧啶基、吡唑基[3，4-d]嘧啶基、喹啉基、喹唑啉基、三唑基、噻唑基、苯硫基、四氫化吲哚基、四唑基、噻ニ唑基、噻吩基、硫代嗎啉基、三唑基或托烷基。本發(fā)明所述的雜芳基基團被O、1、2、3、4或5個獨立地選自以下組的取代基取代燒基、稀基、塊基、齒素、齒代燒基、氣代燒基、輕基、燒氧基、稀基氧基、塊基氧基、碳環(huán)基氧基、雜環(huán)基氧基、齒代燒氧基、氣代燒基氧基、疏基、硫代燒基、齒代硫代燒基、氣代硫代燒基、硫代稀基、硫代塊基、橫酸、燒基橫酸基、齒代燒基橫酸基、氣代烷基磺?；?、烯基磺?；?、炔基磺?；?、烷氧基磺?；?、南代烷氧基磺酰基、氟代烷氧基磺?；?、烯基氧基磺酰基、炔基氧基磺酰基、氨基磺?；?、亞磺酸、烷基亞硫酰基、南代烷基亞硫酸基、氣代燒基亞硫酸基、稀基亞硫酸基、塊基亞硫酸基、燒氧基亞硫酸基、齒代燒氧基亞硫酰基、氟代烷氧基亞硫?；?、烯基氧基亞硫?；⑷不趸鶃喠蝓；?、氨基亞硫?；?、甲酸基、燒基擬基、齒代燒基擬基、氣代燒基擬基、稀基擬基、塊基擬基、竣基、燒氧基擬基、齒代燒氧基擬基、氣代燒氧基擬基、稀基氧基擬基、塊基氧基擬基、燒基擬基氧基、齒代燒基擬基氧基、氟代烷基羰基氧基、烯基羰基氧基、炔基羰基氧基、烷基磺酰基氧基、齒代烷基磺酰基氧基、氟代烷基磺?；趸?、烯基磺?；趸?、炔基磺?；趸?、齒代烷氧基磺酰基氧基、氟代烷氧基磺?；趸⑾┗趸酋；趸⑷不趸酋；趸⑼榛鶃喠蝓；趸?、鹵代燒基亞硫酸基氧基、氣代燒基亞硫酸基氧基、稀基亞硫酸基氧基、塊基亞硫酸基氧基、燒 氧基亞硫酸基氧基、齒代燒氧基亞硫酸基氧基、氣代燒氧基亞硫酸基氧基、稀基氧基亞硫酸基氧基、炔基氧基亞硫?；趸被鶃喠蝓；趸?、氨基、酰胺基、氨基磺?；被鶃喠蛩峄?、氰1基、硝基、置氣基、氧勝基、憐酸基、甲娃燒基、甲娃燒基氧基以及任何通過亞燒基部分(如，亞甲烷基)與雜環(huán)基相連的所述取代基。術語“亞雜芳基”為本領域公知的，本發(fā)明中使用的“亞雜芳基”如上所述，表示移除雜芳基環(huán)的兩個氫原子后得到的雙配位基部分。本申請中使用的術語“雜芳基烷基”或“雜芳烷基”表示本文定義的雜芳基基團在其母體分子部分附加本文定義的烷基基團。雜芳烷基的典型示例包括，但不限于吡啶-3-基甲基和2-(噻吩-2-基)こ基。術語“鹵”或“鹵素”表示-Cl、-Br、-I或-F。術語“鹵代烷基”表示本文定義的烷基基團，其中至少ー個氫被本文定義的鹵素取代。鹵代烷基的典型示例包括，但不限于氯代甲基、2-氟代こ基、三氟甲基、五氟こ基和2-氯-3-氟代戍基。術語“氟代烷基”表示本文定義的烷基基團，其中所有的氫被氟取代。本申請中使用的術語“羥基”表示-OH基團。本申請中使用的術語“烷氧基”表示本文定義的烷基基團在其母體分子部分附加ー個氧原子。烷氧基的典型示例包括，但不限于甲氧基、こ氧基、丙氧基、2_丙氧基、丁氧基、叔- 丁氧基、戊氧基和己氧基。術語“烯氧基”、“炔氧基”、“碳環(huán)氧基”和“雜環(huán)氧基”同理定義。本申請中使用的術語“鹵代烷氧基”表示本文定義的烷氧基基團，其中至少ー個氫被本文定義的鹵素取代。鹵代烷氧基的典型示例包括，但不限于氯代甲氧基、2-氟代こ氧基、三氟代甲氧基和五氟代こ氧基。術語“氟代烷氧基”同理定義。本申請中使用的術語“芳氧基”表示本文定義的芳基基團在其母體分子部分附加ー個氧原子。本文使用的術語“雜芳氧基”表示本文定義的雜芳基基團在其母體分子部分附加ー個氧原子。術語“雜芳氧基”同理定義。本申請中使用的術語“芳烷氧基”或“芳基烷氧基”表示本文定義的芳基烷基基團通過ー個氧原子附加在母體分子部分。術語“雜芳基烷氧基”同理定義。芳烷氧基和雜芳基烷氧基的典型示例包括，但不限于2-氯苯基甲氧基、3-三氟甲基-苯基こ氧基和2、3_ ニ甲基批唳基甲氧基。本申請中使用的術語“巰基”或“硫代”表示-SH基團。本申請中使用的術語“硫代烷基”表示本文定義的烷基基團在其母體分子部分附加一個硫。硫代烷基的典型示例包括，但不限于甲硫基、こ硫基、叔丁硫基和己硫基。術語“齒代硫代燒基”、“氣代硫代燒基”、“硫代稀基”、“硫代塊基”、“硫代碳環(huán)基”和“硫代雜環(huán)基”
同理定義。
本文使用的術語“硫代芳基”表示本文定義的芳基基團在其母體分子部分附加ー個硫。術語“雜芳基巰基”同理定義。本申請中使用的術語“硫代芳烷基”或“硫代芳基烷基”表示本文定義的芳烷基基團在其母體分子部分附加ー個硫。術語“硫代雜芳基烷基”同理定義。 本申請中使用的術語“磺?；北硎?S (=0) 2_基團。本申請中使用的術語“磺酸”表示-S (=0) 20H。本申請中使用的術語“烷基磺酰基”表示本文定義的烷基基團在其母體分子部分附加ー個本文定義的磺?；鶊F。烷基磺?；牡湫褪纠?，但不限于甲基磺?；亭郴酋；?。術語“齒代烷基磺酰基”、“氟代烷基磺?；?、“烯基磺酰基”、“炔基磺酰基”、“碳環(huán)基磺?；?、“雜環(huán)基磺?；?、“芳基磺酰基”、“芳烷基磺酰基”、“雜芳基磺?；焙汀半s芳基烷基磺?；蓖矶x。本申請中使用的術語“烷氧基磺?；北硎颈疚亩x的烷氧基基團在其母體分子部分附加ー個本文定義的磺?；鶊F。烷氧基磺?；牡湫褪纠ǎ幌抻诩籽趸酋；?、こ氧基磺?；捅趸酋；?。術語“南代烷氧基磺?；薄ⅰ胺檠趸酋；薄ⅰ跋┭趸酋；?、“炔氧基磺?；?、“碳環(huán)氧基磺?；?、“雜環(huán)氧基磺酰基”、“芳氧基磺?；薄ⅰ胺纪檠趸酋；?、“雜芳氧基磺?；焙汀半s芳基烷氧基磺?；蓖矶x。術語triflyl、tosyl、mesyl和nonaflyl為本領域公知的，分別表示三氟甲磺?；妆交酋；?、甲磺?；腿』酋；鶊F。術語triflate、tosylate、mesylate和nonaflate為本領域公知的，分別表示三氟甲烷磺酸酯、對甲苯磺酸酷、甲磺酸酯和全氟正丁基磺酸酯官能團，以及包括所述基團的分子。本申請中使用的術語“氨基磺?；北硎颈疚亩x的氨基基團在其母體分子部分附加ー個磺?；鶊F。本申請中使用的術語“亞磺?；北硎?S (=0)-基團。亞磺?；鶊F如上述磺酰基基團的定義。本申請中使用的術語“亞磺酸”表示S(=0)0H。術語“氧”表示-O-基團。本申請中使用的術語“羰基”表示-C (=0)-基團。本申請中使用的術語“硫代羰基”表示-C (=S)-基團。 本申請中使用的術語“甲酰基”表示-C (=0) H基團。本文使用的術語“烷基羰基”表示本文定義的烷基基團在其母體分子部分附加ー個本文定義的羰基基團。烷基羰基的典型示例包括，但不限于こ?；?、I-氧代丙基、2、2_ ニ甲基-1-氧代丙基、I-氧代丁基和I-氧代戊基。術語“鹵代烷基羰基”、“氟代烷基羰基”、“烯基羰基”、“炔基羰基”、“碳環(huán)基羰基”、“雜環(huán)基羰基”、“芳基羰基”、“芳烷基羰基”、“雜芳基羰基”和“雜芳烷基羰基”同理定義。本申請中使用的術語“羧基”表示-CO2H基團。本申請中使用的術語“烷氧基羰基”表示本文定義的烷氧基基團在其母體分子部分附加ー個本文定義的羰基基團。烷氧基羰基的典型示例包括，但不限于甲氧基羰基、こ氧基擬基和叔丁氧基擬基。術語“齒代燒氧基擬基”、“氣代燒氧基擬基”、“稀氧基擬基”、“塊氧基羰基”、“碳環(huán)氧基羰基”、“雜環(huán)氧基羰基”、“芳氧基羰基”、“芳烷氧基羰基”、“雜芳氧基羰基”和“雜芳烷氧基羰基”同理定義。本申請中使用的術語“烷基羰基氧基”表示本文定義的烷基羰基基團在其母體分
子部分附加ー個氧原子。烷基羰基氧基的典型示例包括，但不限于こ?；趸?、こ基羰基氧基和叔丁基擬基氧基。術語“齒代燒基擬基氧基”、“氣代燒基擬基氧基”、“稀基擬基氧基”、“塊基擬基氧基”、“碳環(huán)基擬基氧基”、“雜環(huán)基擬基氧基”、“芳基擬基氧基”、“芳燒基擬基氧基”、“雜芳基羰基氧基”和“雜芳烷基羰基氧基”同理定義。本申請中使用的術語“烷基磺酰氧基”表示本文定義的烷基磺?；鶊F在其母體分子部分附加ー個氧原子。術語“鹵代烷基磺酰氧基”、“氟代烷基磺酰氧基”、“烯基磺酰氧基”、“炔基磺酰氧基”、“碳環(huán)基磺酰氧基”、“雜環(huán)基磺酰氧基”、“芳基磺酰氧基”、“芳烷基磺酰氧基”、“雜芳基磺酰氧基”、“雜芳烷基磺酰氧基”、“南代烷氧基磺酰氧基”、“氟代烷氧基磺酰氧基”、“烯氧基磺酰氧基”、“炔氧基磺酰氧基”、“碳環(huán)氧基磺酰氧基”、“雜環(huán)氧基磺酰氧基”、“芳氧基磺酰氧基”、“芳烷氧基磺酰氧基”、“雜芳氧基磺酰氧基”和“雜芳烷氧基磺酰氧基”同理定義。本文使用的術語“氨基”表示-NH2以及其中ー個或兩個氫獨立地被選自以下組的取代基取代或當兩個氫一起被亞烷基基團取代(形成含有氮的環(huán))所得的衍生物。所述取代基組由以下取代基組成燒基、齒代燒基、氣代燒基、稀基、塊基、碳環(huán)基、雜環(huán)基、芳基、芳燒基、雜芳基、雜芳燒基、燒基擬基、齒代燒基擬基、氣代燒基擬基、稀基擬基、塊基擬基、碳環(huán)基擬基、雜環(huán)基擬基、芳基擬基、芳燒基擬基、雜芳基擬基、雜芳燒基擬基以及上述的橫酸基和亞硫?；鶊F；。典型示例包括，但不限于甲氨基、こ酰氨基和ニ甲氨基。本申請中使用的術語“酰胺基”表示本文定義的氨基基團在其母體分子部分附加ー個羰基。本申請中使用的術語“氰基”表不-C = N基團。本申請中使用的術語“硝基”表示-NO2基團。本申請中使用的術語“疊氮基”表示-N3基團。本申請中使用的術語“氧膦基”包括-PH3及其取代衍生物，其中ー個、兩個或三個氫獨立地被選自以下組的取代基取代。所述取代基群組由以下取代基組成烷基、鹵代燒基、氣代燒基、稀基、塊基、碳環(huán)基、雜環(huán)基、芳基、芳燒基、雜芳基、雜芳燒基、燒氧基、齒代烷氧基、氟代烷基氧基、烯基氧基、炔基氧基、碳環(huán)基氧基、雜環(huán)基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、雜芳基氧基、雜芳烷基氧基和氨基。本申請中使用的術語“磷?；北硎?Ρ(=0)0Η2及其取代衍生物，其中ー個或兩個羥基獨立地被選自以下組的取代基取代。所述取代基群組由以下取代基組成烷基、鹵代燒基、氣代燒基、稀基、塊基、碳環(huán)基、雜環(huán)基、芳基、芳燒基、雜芳基、雜芳燒基、燒氧基、齒代烷氧基、氟代烷基氧基、烯基氧基、炔基氧基、碳環(huán)基氧基、雜環(huán)基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、雜芳基氧基、雜芳烷基氧基和氨基。本申請中使用的術語“甲硅烷基”包括H3Si-及其取代衍生物，其中ー個、兩個或三個氧獨立地被選自由燒基、齒代燒基、氣代燒基、稀基、塊基、碳環(huán)基、雜環(huán)基、芳基、芳燒基、雜芳基和雜芳烷基組成的群組的取代基取代。典型示例包括三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基ニ苯基甲硅烷基(TBDPS)、叔丁基ニ甲基甲硅烷基(TBS/TBDMS)、三異丙基甲硅烷基(TIPS)和[2-(三甲基甲硅烷基)こ氧基]甲基(SEM)。本申請中使用的術語“甲硅烷氧基”表示本文定義的甲硅烷基基團在其母體分子部分附加ー個氧原子。縮寫Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts和Ms分別代表甲基、こ基、苯基、三氟甲磺酰基、全氟正 丁基磺?；?、對甲苯磺酰基和甲磺?；?。本領域技術人員進ー步使用的縮寫ー覽表出現(xiàn)在每卷有機化學雜志的第一期；該列表通常記載于標題為縮寫標準列表的表格中。本申請中使用的術語“給予”表示給對象提供ー種藥學試劑或組合物，包括但不限于專業(yè)醫(yī)生給藥或自行給藥。本申請中使用的短語“神經(jīng)系退行性病癥”和“神經(jīng)退行性疾病”表示中樞和末梢神經(jīng)系統(tǒng)的大范圍疾病和/或病癥，例如，神經(jīng)病理學，包括但不限于帕金森氏病、阿爾海默氏癥(AD)、肌萎縮側索硬化癥(ALS)、神經(jīng)性萎縮、耳硬化癥、中風、癡呆、多發(fā)性硬化、亨廷頓舞蹈病、與獲得性免疫缺陷性疾病(AIDS)有關的腦病以及其他與神經(jīng)細胞毒性和細胞死亡有關的疾病。本申請中使用的短語“藥學可接受的”表示在醫(yī)學正確評價的范圍內(nèi)的，與人和動物的組織接觸后不產(chǎn)生過多的毒性、刺激、變態(tài)反應或其他問題或并發(fā)癥，具有相對合理的收益/風險比的那些試劑、化合物、原料、組合物和/或劑型。本申請中使用的短語“藥學可接受的載體”表示一種藥學可接受的原料、組合物或溶剤，如ー種液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、或溶劑包封材料，涉及將試劑從身體的ー個器官或部分運送或轉移至另ー器官或部分。每個載體必須是“可接受的”，其意義是與制劑的其他成分相容并且對患者無害?？捎米魉帉W可接受的載體的原料的示例包括(I)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉，こ基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉末狀西黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可油和栓劑蠟；(9)油，例如花生油，棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) ニ醇類，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚こ二醇；(12)酷，例如油酸こ酯和月桂酸こ酷；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)酒精；
(20)pH緩沖溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)藥物制劑中采用的其他無毒性配伍物質(zhì)。本申請中使用的術語“藥學可接受的鹽”表示化合物的相對無毒性的無機或有機鹽。本申請中使用的術語“蛋白質(zhì)病”表示任何與異常或錯誤折疊蛋白質(zhì)的積聚和/或聚集相關的疾病。雖然蛋白質(zhì)病通常為神經(jīng)退行性疾病，但蛋白質(zhì)病還包括其他組織疾病，包括肝臟、肌肉和心臟的病變，并且包括ー些癌癥。本申請中使用的術語“對象”表示被選作處理或治療對象的人類或非人類的動物。本申請中使用的短語“疑似對象”表示表現(xiàn)出疾病或病態(tài)的ー項或多項臨床指標的對象。在某些實施例中，疾病或病態(tài)為癌癥、神經(jīng)退行性疾病或胰腺炎。本申請中使用的短語“有需要的對象”表示確定為需要接受本發(fā)明治療或處理的對象。本申請中使用的短語“療效”表示試劑對動物，特別是哺乳動物，且更特別是人類的局部或全身效應。短語“治療有效量”和“有效量”表示試劑至少在細胞亞群中產(chǎn)生預期效果的量。治療有效量包括在合理的收益/風險比下，適用于任何治療的產(chǎn)生預期的局部或全身效應的藥劑用量。例如，本發(fā)明方法中使用的某些試劑，給予足夠的量以使上述治療
本申請中使用的術語“治療”患病對象或“治療”疑似患病對象表示對對象進行藥物治療，例如，給予藥劑，以減輕所述疾病的至少ー種癥狀或防止其惡化。本申請中使用的“任何上述化合物”為通式I、II、III、IV、V、VI、VII和VIII的任何化合物。Usp 14 抑制劑本發(fā)明一方面涉及通式I表示的化合物A-N 丄G^z
I或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體；其中，獨立地發(fā)生以下取代，A為芳基、雜芳基、碳環(huán)基、雜環(huán)基或ニ芳基；R1為氫、烷基、鹵代烷基、氟代烷基、低級烷氧基、鹵素或三氟甲基；G 為-N=或-C (R2)=;Z 為=C(Rs)_、=C(R2)-或=N-;R2為氫、烷基、鹵代烷基、氟代烷基、低級烷氧基、鹵素或三氟甲基；或者，當G為-C(R2) =且Z為=C(R2)-時，兩個R2連接在一起形成R
R10 R10 權利要求
1.通式II
2.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為芳基或雜芳基。
3.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或嘧啶-2-基，可任選地被1、2、3、4或5個獨立地選自以下群組的取代基取代烷基、烯基、炔基、南素、鹵代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、稀基氧基、塊基氧基、碳環(huán)基氧基、雜環(huán)基氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、甲酸基、焼基擬基、齒代焼基擬基、氣代焼基擬基、稀基擬基、塊基擬基、駿基、焼氧基擬基、齒代焼氧基擬基、氣代焼氧基擬基、稀基氧基擬基、塊基氧基擬基、焼基擬基氧基、齒代焼基擬基氧基、氣代焼基擬基氧基、稀基擬基氧基、塊基擬基氧基、氣基、酉先胺基、置氣基、氣基橫酉先基、氣基亞硫酉先基、氰I基、硝基、氧勝基、憐酉先基、甲娃焼基、甲娃焼基氧基和通過亞甲基或亞乙基部分與雜環(huán)基相連的任意的所述取代基。
4.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為苯基，任選地被1、2、3、4或5個獨立地選自由焼基、齒素、齒代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、氣基、置氣基、氰基和硝基組成的群組的取代基取代。
5.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為
6.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為二位被取代基取代(鄰位取代)的苯基，所述取代基選自由焼基、齒素、齒代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、氨基、疊氮基、氰基和硝基組成的群組。
7.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為
8.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為三位被取代基取代(間位取代)的苯基，所述取代基選自由焼基、齒素、齒代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、氨基、疊氮基、氰基和硝基組成的群組。
9.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為
10.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為四位被取代基取代(對位取代)的苯基，所述取代基選自由焼基、齒素、齒代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、氨基、疊氮基、氰基和硝基組成的群組。
11.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為MトCl^
12.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為二位和四位被兩個取代基取代的苯基，所述取代基獨立地選自由焼基、齒素、齒代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、氨基、疊氮基、氰基和硝基組成的群組。
13.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為
14.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為吡啶-2-基，任選地四位被取代基取代，所述取代基選自由焼基、齒素、齒代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、氨基、疊氮基、氰基和硝基組成的群組。
15.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為
16.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為嘧啶-2-基，任選地四位被取代基取代，所述取代基選自由焼基、齒素、齒代焼基、氣代焼基、輕基、焼氧基、齒代焼氧基、氣代焼基氧基、氨基、疊氮基、氰基和硝基組成的群組。
17.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為
18.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為ニ芳基。
19.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為4-(苯基)苯-I-基或4-
20.根據(jù)權利要求I所述化合物，其中A為
21.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，其中R1為氫。
22.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R1為烷基、鹵代烷基或氟代烷基。
23.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R1為甲基、鹵代甲基或氟代甲基。
24.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R1為こ基、鹵代こ基或氟代こ基。
25.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R2為氫。
26.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R2為烷基、鹵代烷基或氟代烷基。
27.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R2為甲基、鹵代甲基或氟代甲基。
28.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R2為こ基、鹵代こ基或氟代こ基。
29.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R1為氫；且R2為氫。
30.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R1為烷基；且R2為烷基。
31.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R1為甲基；且R2為甲基。
32.根據(jù)權利要求1-20任一項所述的化合物，R1為こ基；且R2為こ基。
33.根據(jù)權利要求1-32任一項所述的化合物，Z為=C(Rs)-;且R8為氫。
34.根據(jù)權利要求1-32任一項所述的化合物，Z為=C(Rs)-;且R8為烷基。
35.根據(jù)權利要求1-32任一項所述的化合物，Z為=N-。
36.根據(jù)權利要求1-24任一項所述的化合物，其中Z為=C(R2)-;且兩個R2連接在一起形成
37.根據(jù)權利要求1-32任一項所述的化合物，X為
38.根據(jù)權利要求1-32任一項所述的化合物，X為'
39.根據(jù)權利要求1-32任一項所述的化合物，X為
40.根據(jù)權利要求ト39任一項所述的化合物，Y為-CH2NR3R'
41.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2NR3R4;且R3為氫。
42.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2NR3R4;且R3為烷基。
43.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2NR3R4;且R4為氫。
44.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2NR3R4;且R4為烷基。
45.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2NR3R4；R3為氫；且R4為烷基。
46.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2NR3R4；R3為烷基；且R4為烷基。
47.根據(jù)權利要求1-38任一項所述的化合物，Y為
48.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2(N-雜環(huán)基)，并可任選地被I、2、3、4或5個取代基取代，所述取代基獨立地選自由燒基、齒代燒基、氣代燒基、齒素、輕基、燒氧基、齒代燒氧基、氣代燒氧基、氣基和硝基組成的群組。
49.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2(哌啶-I-基)、-CH2 (哌嗪-I-基)、-CH2 (六氫化嘧啶-I-基)、-CH2 (嗎啉-I-基)或-CH2 (1,3-噁嗪-3-基)，并可任選地被1、2、3、4或5個取代基取代，所述取代基獨立地選自由烷基、齒代烷基、氟代烷基、齒素、輕基、燒氧基、齒代燒氧基、氣代燒氧基、氣基和硝基組成的群組。
50.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2(哌啶-I-基)或-CH2 (哌嗪-I -基)，并可任選地被1、2、3、4或5個獨立地選自由烷基、鹵代烷基、氟代烷基、鹵素、羥基、燒氧基、齒代燒氧基、氣代燒氧基、氣基和硝基組成的群組的取代基取代。
51.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為！
52.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-CH2NH(CH2)nNH(烷基)、-CH2NH(CH2)nN (烷基)2、-CH2NH(CH2)nN (亞烷基)、-CH2N (烷基)(CH2)nNH (烷基)、-CH2N (烷基)(CH2)nN(烷基)2或-CH2N (烷基)(CH2)nN (亞烷基)。
53.根據(jù)權利要求1-38任一項所述的化合物，Y為-CH2NH(CH2)nO(烷基)或-CH2N (燒基)(CH2)nO (烷基)。
54.根據(jù)權利要求52或53所述的化合物，其中η為I。
55.根據(jù)權利要求52或53所述的化合物，其中η為2。
56.根據(jù)權利要求52或53所述的化合物，其中η為3。
57.根據(jù)權利要求52或53所述的化合物，其中η為4。
58.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，
59.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR3R4。
60.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR3R4;且R3為氫。
61.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR3R4;且R3為烷基。
62.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR3R4;且R4為氫。
63.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR3R4;且R4為烷基。
64.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR3R4；R3為氫；且R4為烷基。
65.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR3R4；R3為烷基；且R4為烷基。
66.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR5NR6R7或-NR5(N-雜環(huán)基)。
67.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR5NR6R7;且R5為氫。
68.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR5NR6R7;且R5為烷基。
69.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR5NR6R7;且R5、R6和R7獨立地為氫!或燒基。
70.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR5(N-雜環(huán)基)；且R5為氫。
71.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為-NR5(N-雜環(huán)基)；且R5為烷基。
72.根據(jù)權利要求1-39任一項所述的化合物，Y為
73.一種化合物或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，選自由以下化合物組成的群組
74.—種藥物組合物，其包含權利要求1-73任一項所述的化合物或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者IUl或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，以及一種藥學可接受的賦形劑。
75.—種抑制Uspl4蛋白質(zhì)去泛素化活性的方法，包括使權利要求1-73任一項所述的化合物或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者IUl或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體與所述Uspl4蛋白質(zhì)接觸。
76.—種通過蛋白酶體提高細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解作用的方法，包括用權利要求1-73任一項所述的化合物或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者IUl或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體與所述細胞接觸。
77.一種治療或預防對象中蛋白質(zhì)病的方法，包括給予對象權利要求1-73任一項所述的化合物或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者IUI或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者權利要求74所述的藥物組合物。
78.根據(jù)權利要求77所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)病選自以下群組阿爾茨海默病、腦β -淀粉樣蛋白血管病、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞變性、瘋牛病、庫魯病、克雅氏癥、變異克雅氏癥、格斯特曼-施特勞斯綜合征、致死性家族性失眠癥、額顳癡呆、阿爾茨海默病、進行性核上性麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性、額顳葉變性、前顳葉變性、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、亨廷頓舞蹈癥、家族性英國型癡呆、家族性丹麥型癡呆、遺傳性腦出血伴淀粉樣變(Iclandic)、遺傳性多發(fā)梗死癡呆病、亞歷山大病、家族性淀粉樣神經(jīng)病、老年系統(tǒng)性淀粉樣變、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白病變、AL淀粉樣變、AA淀粉樣變、II型糖尿病、主動脈瓣內(nèi)側淀粉樣變性、ApoAI淀粉樣變、ApoII淀粉樣變、ApoAIV淀粉樣變、最終型的家族性淀粉樣變、溶菌酶淀粉樣變、纖維蛋白原淀粉樣變、透析淀粉樣變、包涵體肌炎/肌病、白內(nèi)障、甲狀腺髓樣癌、心臟心房淀粉樣變、垂體催乳素瘤、遺傳晶格角膜營養(yǎng)不良、皮膚地衣淀粉樣變、角膜乳鐵蛋白淀粉樣變、角膜乳鐵蛋白淀粉樣變、肺泡蛋白沉積癥、齒源性淀粉腫瘤、生殖膀胱淀粉樣變性、囊纖維化、鐮狀細胞疾病和重癥肌肉病變。
79.根據(jù)權利要求77所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)病為阿爾茨海默病、額顳葉變性、肌萎縮性脊髓側索硬化癥或馬查多-約瑟夫病。
80.一種治療或預防疾病的方法，所述方法治療蛋白質(zhì)分解增強，包括給予對象權利 要求1-73任一項所述的化合物或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者IUl或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者權利要求74所述的藥物組合物。
81.根據(jù)權利要求80所述的方法，其中所述的疾病選自由遺傳性斑痣性錯構瘤病、I型脊髓小腦共濟失調(diào)、Angelman綜合征、巨軸突神經(jīng)病變、包合體肌病和佩吉特骨病以及額顳癡呆(IBMPFD)組成的群組。
82.一種提高對象蛋白酶體功能的方法，包括給予所述對象權利要求1-73任一項所述的化合物或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者IUl或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者權利要求74所述的藥物組合物。
83.—種加速對象Tau、TDP-43或ataxin_3降解的方法,包括給予所述對象權利要求1-73任一項所述的化合物或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者IUl或其藥學可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥、化學保護形式、對映異構體或立體異構體，或者權利要求74所述的藥物組合物。
84.根據(jù)權利要求77-83任一項所述的方法，其中所述對象為人類。
85.一種分離得到的蛋白酶體，包括無酶活性的Uch37，且進一步包括有酶活性的Uspl4。
86.根據(jù)權利要求85所述的蛋白酶體，其中所述的蛋白酶體包含乙烯基砜-Uch37加合物。
87.根據(jù)權利要求85所述的蛋白酶體，其中所述的Uspl4是重組體蛋白。
88.根據(jù)權利要求85所述的蛋白酶體，其中所述的蛋白酶體是人蛋白酶體或鼠蛋白酶體。
89.一種分離得到的蛋白酶體，包括有酶活性的Uspl4且缺乏有酶活性的Uch37。
90.根據(jù)權利要求89所述的蛋白酶體，其中所述的Uspl4是重組體蛋白。
91.根據(jù)權利要求89所述的蛋白酶體，其中所述的蛋白酶體是人蛋白酶體或鼠蛋白酶體。
92.一種產(chǎn)生蛋白酶體的方法，所述蛋白酶體包括無酶活性的Uch37，且進一步包括有酶活性的Uspl4,包括 (a)純化缺乏Uspl4但含有Uch37的蛋白酶體； (b)用去泛素化酶抑制劑處理所述純化的蛋白酶體；并且 (c)用有酶活性的Uspl4重新組成所述純化的蛋白酶體。
93.根據(jù)權利要求92所述的方法，其中所述的蛋白酶體是人蛋白酶體或鼠蛋白酶體。
94.根據(jù)權利要求92所述的方法，其中所述的含有Uch37但缺乏Uspl4的蛋白酶體純化自HEK293細胞。
95.根據(jù)權利要求92所述的方法，其中所述的去泛素化酶抑制劑是泛素-乙烯砜。
96.根據(jù)權利要求92所述的方法，其中所述的Uspl4是重組產(chǎn)生的。
97.—種篩選Uspl4抑制劑的方法,包括 Ca)提供一種蛋白酶體，所述蛋白酶體包括無酶活性的Uch37，且進一步包括有酶活性的 Usp14 ； (b)用所述蛋白酶體與待測化合物和Uspl4底物接觸；并且 (c)確定所述待測化合物是否抑制所述底物的去泛素作用。
98.根據(jù)權利要求97所述的方法，其中所述的底物與報告子偶合，所述報告子在由去泛素酶降解之后可檢測。
99.根據(jù)權利要求98所述的方法，其中所述底物是Ub-AMC。
100.根據(jù)權利要求97所述的方法，其中所述底物是泛素依賴性蛋白酶體底物。
101.根據(jù)權利要求100所述的方法，其中所述底物的去泛素作用表現(xiàn)為對底物降解的抑制作用。
102.根據(jù)權利要求101所述的方法，其中所述底物是聚泛素化細胞周期蛋白B。
103.根據(jù)權利要求97所述的方法，其中所述蛋白酶體包括乙烯砜_Uch37加合物。
104.根據(jù)權利要求97所述的方法，其中所述Uspl4是重組體蛋白。
105.根據(jù)權利要求97所述的方法，其中所述蛋白酶體是人蛋白酶體或鼠蛋白酶體。
106.—種試劑盒，包括權利要求85-91任一項所述的分離得到的蛋白酶體，以及使用說明。
107.根據(jù)權利要求106所述的試劑盒，進一步包括Uspl4底物。
108.根據(jù)權利要求107所述的試劑盒，其中所述的Uspl4底物是Ub-AMC或聚泛素化細胞周期蛋白B。
全文摘要
蛋白酶體不足以有效地消除有害蛋白質(zhì)并阻止致病聚合體的形成導致了蛋白質(zhì)病。如本申請所述，抑制蛋白酶體相關的去泛素酶Usp14可以增強蛋白酶體的效力。本發(fā)明提供了抑制Usp14、增強蛋白酶體活性和治療蛋白質(zhì)病的新組合物和方法。
文檔編號A61K31/4439GK102844313SQ201180016116
公開日2012年12月26日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權日2010年1月28日
發(fā)明者D·芬利, R·W·金, 李秉憲, 李民杰, T·C·甘曼 申請人:哈佛大學校長及研究員協(xié)會