本申請(qǐng)是2010年01月12日遞交的申請(qǐng)?zhí)枮?01080011779.7，發(fā)明名稱為“修飾抗體組合物及其制備和使用方法”的分案申請(qǐng)。交叉引用本申請(qǐng)要求享有于2009年1月12日提交的第61/144110號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)，2009年1月12日提交的第61/1441105號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)，2009年10月7日提交的第61/249441號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)以及2009年10月7日提交的第61/249416號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益，這些臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用全部并入本文中。
背景技術(shù)：
：以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的療法改變了用藥的面貌，在各種不同的疾病間發(fā)現(xiàn)了各種應(yīng)用。尤其是以抗體為基礎(chǔ)的療法，已經(jīng)證明對(duì)一些疾病能有效治療，但是在某些情況下，由于對(duì)廣泛的靶點(diǎn)表達(dá)的毒性限制了其治療的有效性。然而，對(duì)于任何藥物，改善其靶點(diǎn)特異性和選擇性對(duì)藥物的需要和需求有極大興趣，特別是對(duì)開(kāi)發(fā)以抗體為基礎(chǔ)的結(jié)合具有已知靶點(diǎn)的第二代藥物。提高抗體對(duì)病變的部位靶向性可以減少全身的機(jī)制為基礎(chǔ)的毒性，并導(dǎo)致更廣泛的治療應(yīng)用。在小分子藥物領(lǐng)域，戰(zhàn)略已經(jīng)發(fā)展到提供一個(gè)活性化學(xué)實(shí)體的前體藥物。這些前體藥物是在一中相對(duì)不活潑的(或顯著減少活性)的形式供給。一旦供給，前體藥物在體內(nèi)代謝成為活性的化合物。這種藥物前體的策略，可以對(duì)其預(yù)期靶點(diǎn)提供增加的藥物選擇性并減少不利影響。用于特異性缺氧的腫瘤細(xì)胞的藥物，通過(guò)氧化還原激活的使用，利用存在于缺氧細(xì)胞中的大量還原酶將藥物轉(zhuǎn)化成其細(xì)胞毒素的狀態(tài)，實(shí)質(zhì)上是使其激活。由于在這種激活之前，前提藥物是低毒性的，這顯著降低了損害非癌變細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)，從而降低與藥物相關(guān)的副作用。本領(lǐng)域需要一種為以抗體為基礎(chǔ)的療法提供一種前體藥物特性的戰(zhàn)略需求。發(fā)明簡(jiǎn)述目前披露的規(guī)定修改和激活的抗體治療和診斷的有用成分。激活的抗體成分，表現(xiàn)出更高的生物利用度和生物分布，相比傳統(tǒng)的抗體療法與藥物前體的功能。此外，還提供使用在診斷和治療，以及篩選和建設(shè)等組成的方法。在一方面，本發(fā)明提供了一種修飾過(guò)的抗體，包括一種抗體或一種抗體片段(ab)，能專門(mén)與其靶點(diǎn)結(jié)合，能夠與以中掩蔽基團(tuán)耦合(mm)，其中mm對(duì)ab的耦合降低ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合能力以便使耦合了mm的ab對(duì)靶點(diǎn)的裂解常數(shù)比沒(méi)有耦合mm的ab對(duì)靶點(diǎn)的裂解常數(shù)至少大100倍、至少大1000倍、或者至少大10000倍。在另一方面，本發(fā)明提供了一種修飾抗體，包括一種抗體或一種抗體片段(ab)，能專門(mén)與其靶點(diǎn)結(jié)合，能夠與以中掩蔽基團(tuán)耦合(mm)，其中當(dāng)使用靶點(diǎn)的替代物在體外進(jìn)行測(cè)試時(shí)，對(duì)比沒(méi)有耦合mm的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合能力，耦合了mm的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合能力至少降低90％。這種mm與ab的耦合降低ab與靶點(diǎn)結(jié)合能力的時(shí)間至少為12小時(shí)或至少為24小時(shí)或至少為72小時(shí)。在另一方面，修飾抗體進(jìn)一步耦合到一種雷杰基團(tuán)(cm)。該cm能被酶裂解，或該cm能被一種降低藥劑減少，或該cm能被光溶解。該cm能具體地至少在1x104m1s4、或至少在5x104m1s、或至少在10x104m4s的速率下被裂解、減少或光溶解。在一個(gè)實(shí)施例中，修飾抗體的cm在mm內(nèi)。在本發(fā)明提供的抗體中mm對(duì)ab的離解常數(shù)(kd)通常比ab對(duì)靶點(diǎn)的kd至少大100倍。一般地，mm對(duì)ab的kd低于10nm，或低于5nm，或低于1nm。在一些實(shí)施例中，修飾抗體的mm通過(guò)與ab的抗原結(jié)合域特異性結(jié)合降低ab與其靶點(diǎn)結(jié)合的能力。這種結(jié)合可以是非供價(jià)的。修飾抗體的mm能在allosterically或空間上降低ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合能力。在具體的實(shí)施例中，修飾抗體的mm不能含有多于50％的與ab的天然結(jié)合配體相似的氨基酸序列。在具體的實(shí)施例中，修飾抗體的ab是選自由fab'片段、f(ab')2、scfv、scab、dab、單域重鏈抗體和單域輕鏈抗體構(gòu)成的組中的抗體片段。在相關(guān)的實(shí)施例中，修飾抗體的ab選自表2或ab的來(lái)源是西妥昔單抗、帕木單抗、英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依法珠單抗、伊匹單抗、tremelimumab(ctla-4單抗)、阿德木單抗、hu5c8、阿倫單抗、雷珠單抗、托西莫單抗、替伊莫單抗、利妥昔單抗、英利昔單抗、貝伐珠單抗或figitumumab(igfr-1抑制劑)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，修飾抗體不是阿倫單抗。在相關(guān)的實(shí)施例中，ab的靶點(diǎn)是選自表1中的靶點(diǎn)多構(gòu)成的組。在典型的實(shí)施例中，靶點(diǎn)是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、轉(zhuǎn)鐵蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4、或il4。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，修飾抗體進(jìn)一步包括一個(gè)第二ab，其中該第二ab的靶點(diǎn)是選自表1中的靶點(diǎn)所構(gòu)成的組。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施例中，cm是一種用于選自表3中的酶所構(gòu)成的組中酶的底物。在具體的實(shí)施例中，cm是一種用于半胱氨酸蛋白酶、纖溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的底物。在這樣的實(shí)施例中，其中修飾過(guò)的ab包含一種cm，ab是選自表2中的抗體所構(gòu)成的組，具體地，選自西妥昔單抗、帕木單抗、英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依法珠單抗、伊匹單抗、tremelimumab(ctla-4單抗)、阿德木單抗、hu5c8、阿倫單抗、雷珠單抗、托西莫單抗、替伊莫單抗、利妥昔單抗、英利昔單抗、貝伐珠單抗或figitumumab(igfr-1抑制劑)所構(gòu)成的組。在一個(gè)典型的實(shí)施例中，ab不是阿倫單抗。在一個(gè)實(shí)施例中，其中修飾過(guò)的抗體包括一個(gè)ab，并與一個(gè)cm和一個(gè)mm連接。在一個(gè)實(shí)施例中，靶點(diǎn)是選自表1的靶點(diǎn)所構(gòu)成的組，或靶點(diǎn)是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、轉(zhuǎn)鐵蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4。靶點(diǎn)不是cd52。修飾蛋白可進(jìn)一步于一個(gè)第二裂解基團(tuán)連接，能夠?qū)ｉT(mén)被一種酶修飾。在該實(shí)施例中，該第二裂解蛋白是一種天冬酰胺內(nèi)肽酶、纖溶酶、tmprss-3/4、mmp-9,mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa、或psa的底物。在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，修飾抗體進(jìn)一步包括一種連接肽，其中該連接肽位于ab和mm之間?；蛘咴撔揎椷^(guò)的抗體進(jìn)一步包括一種連接肽，其中該連接肽位于mm和cm之間?；蛘咴撔揎椷^(guò)的抗體進(jìn)一步包括一種連接肽，其中該連接肽位于ab和cm之間。或者該修飾過(guò)的抗體進(jìn)一步包括兩種連接肽，其中第一種連接肽位于ab和cm之間以及第二種連接肽位于mm和cm之間。連接肽是選自一種裂解連接肽、一種非裂解連接肽、一種分支連接肽所構(gòu)成的組。在某些實(shí)施例中，修飾過(guò)的抗體進(jìn)一步包含一種檢測(cè)基團(tuán)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，該檢測(cè)基團(tuán)是一種診斷試劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明所述的修飾過(guò)的抗體進(jìn)一步包含一種與ab結(jié)合的試劑，在一方面，該試劑是一種治療藥物，例如一種抗腫瘤藥。在這中實(shí)施例中試劑與ab的以個(gè)碳水化合物基團(tuán)結(jié)合，其中碳水化合物基團(tuán)位于ab的抗原結(jié)合地區(qū)的外部?；蛘咴噭┡cab的巰基結(jié)合。本發(fā)明提供的修飾過(guò)的抗體供給一個(gè)有機(jī)體時(shí)，表現(xiàn)出了至少有5天的血清半衰期。本發(fā)明提供的一些修飾過(guò)的抗體的mm的共有序列是：cisprgc1c(nzp)h(hvf)(yzt)(fzwztzl)(yzgztzs)(tzszyzh)cgcisprgcg、xcxxyqclxxxxxx,xxqpxpprvxx、pxpgfpycxxxx、xxxxqxxpwpp、gxgxcytilexxcxxxr、gxxxcyxixexxcxxxx、gxxxcyxixexwcxxxx、xxxccxxyxixxccxxx或xxxxxyxilexxxxx。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，該共有序列專門(mén)以一個(gè)抗-vegf抗體、一個(gè)抗-efgr或一個(gè)抗-ctla-4抗體結(jié)合。在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了一種激活的抗體(aa)包括一種能夠特異性與其靶點(diǎn)結(jié)合抗體或一種抗體片段(ab)，一種與ab耦合能夠抑制ab與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合的掩蔽基團(tuán)(mm)，一種與ab耦合能夠被酶專門(mén)裂解的裂解基團(tuán)(cm)。其中，對(duì)比aa處在裂解cm的足夠酶活和mm不抑制ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合的情況，當(dāng)aa不處于裂解cm的足夠酶活下，mm至少降低ab與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合程度的90％。在具體的實(shí)施例中，降低ab與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合的時(shí)間至少為12小時(shí)，或至少為24小時(shí)，或至少為72小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施例中，在aa中，與耦合了mm的ab對(duì)其靶點(diǎn)的離解系數(shù)(kd)比沒(méi)有耦合mm的ab對(duì)其靶點(diǎn)的離解系數(shù)至少大100倍。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施例中，mm對(duì)ab的離解系數(shù)(kd)比ab對(duì)其靶點(diǎn)的離解系數(shù)至少大100倍。一般地，mm對(duì)ab的離解系數(shù)低于10nm，或低于5nm，或低于1nm。在一些aa的實(shí)施例中，mm能與ab的抗原結(jié)合域特異性結(jié)合。在一些aa的實(shí)施例中，cm能大約至少在1x104m1s4、或至少5x104m4s、或至少10x104m4s的速率下被酶特異性裂解。在某些實(shí)施例中，aa中的ab是一種抗體片段，該抗體片段選自fab'片段、一種f(ab')2片段、一種scfv、一種scabadab、一種單域重鏈抗體和一種單域輕鏈抗體所構(gòu)成的組中。在某些實(shí)施例中，aa中的ab選自表2中的抗體所構(gòu)成的組。在具體的實(shí)施例中，ab是西妥昔單抗、帕木單抗、英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依法珠單抗、伊匹單抗、tremelimumab(ctla-4單抗)、阿德木單抗、hu5c8、阿倫單抗、雷珠單抗、托西莫單抗、替伊莫單抗、利妥昔單抗、英利昔單抗、貝伐珠單抗或figitumumab(igfr-1抑制劑)。在某些實(shí)施例中，aa的靶點(diǎn)選自表1中的靶點(diǎn)所構(gòu)成的組。在具體的實(shí)施例中，靶點(diǎn)是notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、轉(zhuǎn)鐵蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4在一個(gè)具體的實(shí)施例中，ab不是阿倫單抗并且靶點(diǎn)不是cd52。在某些實(shí)施例中，aa的cm是一種用于胱氨酸蛋白酶、纖溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的底物。再具體的實(shí)施例中，aa進(jìn)一步與能夠被一種酶特異性修飾的一種第二裂解基團(tuán)(cm)耦合。在該實(shí)施例中，第二cm是一種用于胱氨酸蛋白酶、纖溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的底物。在本發(fā)明的一些aa的實(shí)施例中，cm包含在mm中。在本發(fā)明的一些aa的實(shí)施例中，mm不能包含多于50％的與ab的一個(gè)天然的結(jié)合配體相似的氨基酸序列。在本發(fā)明的一些aa的實(shí)施例中，aa進(jìn)一步包含一個(gè)連接肽，其特征在于連接肽位于mm和cm之間。在具體的實(shí)施例中，連接肽位于mm和cm之間。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的aa進(jìn)一步包含一種檢測(cè)基團(tuán)或一種結(jié)合到ab的試劑。在另一方面，本發(fā)明提供了一種激活抗體的組合物(aac)包括：兩種抗體或抗體片段(ab1和ab2)，每一種都能與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合，至少一種能與ab1和ab2耦合能抑制ab1和ab2與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合的掩蔽基團(tuán)(mm)，以及至少一種能與ab1和ab2耦合，通過(guò)激活aac的成分能被一種酶特異性裂解的裂解基團(tuán)(cm)。其中當(dāng)aac處于未裂解狀態(tài)時(shí)，mm抑制ab1和ab2與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合，以及當(dāng)aac處于裂解狀態(tài)時(shí)，mm不抑制ab1和ab2與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施例中，aac是雙特異性的，其中ab1和ab2連接位于相同靶點(diǎn)的同一抗原表位；或者ab1和ab2連接位于相同靶點(diǎn)的不同抗原表位；ab1和ab2連接位于不同靶點(diǎn)的不同抗原表位。在一個(gè)aac的實(shí)施例中，cm至少以1x104m"1s4速率能構(gòu)被酶特異性裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，其中aac的ab1或ab2是一種抗體片段，該抗體片段選自一種fab'片段、一種f(ab')2片段、一種scfv、一種scabadab、一種單域重鏈抗體和一種單域輕鏈抗體所構(gòu)成的組。在一個(gè)aac的實(shí)施例中，ab1和/或ab2選自表2中的抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，ab1和/或ab2是西妥昔單抗、帕木單抗、英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依法珠單抗、伊匹單抗、tremelimumab(ctla-4單抗)、阿德木單抗、hu5c8、阿倫單抗、雷珠單抗、托西莫單抗、替伊莫單抗、利妥昔單抗、英利昔單抗、貝伐珠單抗或figitumumab(igfr-1抑制劑)。在一個(gè)aac的實(shí)施例中，ab1和或ab2的靶點(diǎn)選自表1中的靶點(diǎn)所構(gòu)成的組。在相關(guān)的實(shí)施例中，ab1和或ab2的靶點(diǎn)是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、轉(zhuǎn)鐵蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4。在一個(gè)相關(guān)aac的抗體中，cm是用于選自表3中的酶所構(gòu)成的組中酶的一種底物。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，cm是用于半胱氨酸蛋白酶、纖溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一種底物。在又一個(gè)具體的實(shí)施例中，aac進(jìn)一步與一個(gè)能被一種酶特異性裂解的第二裂解基團(tuán)耦合并且該第二裂解基團(tuán)是用于半胱氨酸蛋白酶、纖溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一種底物。在aac的具體實(shí)施例中，mm不包含多余50％的氨基酸片段在另一個(gè)有關(guān)aac的實(shí)施例中，aac進(jìn)一步包括一個(gè)測(cè)試基團(tuán)或進(jìn)一步與一種試劑共軛。本發(fā)明提供了一種治療和診斷主體一種疾病的方法，包括供給主體一種組合成分，包括：能構(gòu)專門(mén)與其靶點(diǎn)結(jié)合的一種抗體或一種抗體片段(ab)、能抑制特定的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合的耦合到ab的掩蔽基團(tuán)(mm)、以及能夠?qū)ｉT(mén)被酶裂解的一種耦合到ab裂解基團(tuán)(cm)。其中，根據(jù)對(duì)主體的供給，對(duì)比aa處在裂解cm的足夠酶活和mm不抑制ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合的情況，當(dāng)aa不處于裂解cm的足夠酶活下，mm至少降低ab與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合程度的90％。在該方法中，ab選自一個(gè)fab片段,一個(gè)f(ab)2片段,一個(gè)scfv,一個(gè)scab一個(gè)dab,一個(gè)單域重鏈抗體和異構(gòu)單域輕鏈抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，癥狀是癌。在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，mm不是天然的ab的結(jié)合配體。在本方法的各種實(shí)施例中，ab是選自表2中的抗體所構(gòu)成的組。具體地，在一些實(shí)施例中，ab是西妥昔單抗、帕木單抗、英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依法珠單抗、伊匹單抗、tremelimumab(ctla-4單抗)、阿德木單抗、hu5c8、阿倫單抗、雷珠單抗、托西莫單抗、替伊莫單抗、利妥昔單抗、英利昔單抗、貝伐珠單抗或figitumumab(igfr-1抑制劑)。在本方法的各種實(shí)施例中，靶點(diǎn)選自表1中的靶點(diǎn)所構(gòu)成的組中。在具體的實(shí)施例中，靶點(diǎn)是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、轉(zhuǎn)鐵蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4在本方法的一個(gè)非常具體的實(shí)施例中，ab不是阿侖單抗，并且靶點(diǎn)不是cd52。在本方法的各種實(shí)施例中，cm是選自表3中的酶所構(gòu)成的組中酶的一種底物。在具體的實(shí)施例中，cm是半胱氨酸蛋白酶、纖溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一種底物。本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物主體中抑制血管生成的方法。該方法包括在治療上供給主體所需的足量的藥物成分，包括一種修飾的ab、一種aa、一種aac或一種aacj，其中靶點(diǎn)是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、轉(zhuǎn)鐵蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4、或il4。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，ab是西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、英利昔單抗(infliximab)、阿達(dá)木單抗(adalimumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、tremelimumab、阿德木單抗(adecatumumab)、hu5c8、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、雷珠單抗(ranibizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、利妥昔單抗(rituximab)、英利昔單抗(infliximab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、或figitumumab。cm是半胱氨酸蛋白酶、纖溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一種底物。本發(fā)明提供了在一種制備激活抗體(aa)的組合物成分的方法包括：提供一種能夠與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合的抗體或抗體片段(ab)，一種與ab耦合能抑制ab與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合的掩蔽基團(tuán)(mm)，一種與ab耦合能由酶特異性裂解的裂解基團(tuán)(cm)。其中與mm耦合的ab對(duì)其靶點(diǎn)的離解常數(shù)(kd)比沒(méi)有與mm耦合的ab對(duì)其靶點(diǎn)的離解常數(shù)(kd)至少大100倍。在一個(gè)本方法的實(shí)施例中，ab選自或衍生自表2中的抗體所構(gòu)成的組中的抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，ab是或衍生自西妥昔單抗、帕木單抗、英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依法珠單抗、伊匹單抗、tremelimumab(ctla-4單抗)、阿德木單抗、hu5c8、阿倫單抗、雷珠單抗、托西莫單抗、替伊莫單抗、利妥昔單抗、英利昔單抗、貝伐珠單抗或figitumumab(igfr-1抑制劑)。在一個(gè)非常具體的實(shí)施例中，ab不是alemtuzumab并且靶點(diǎn)不是cd52。在本方法的另一個(gè)實(shí)施例中，cm是選自表3中的酶構(gòu)成的組中的酶的一種底物。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，cm是半胱氨酸蛋白酶、纖溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一種底物。本發(fā)明提也供了一種篩選能確定一種能與抗體或抗體片段結(jié)合的掩蔽基團(tuán)(mm)肽的候選肽的方法，包括提供一種肽支架庫(kù)，其中每一種肽支架包括：一種跨膜蛋白，以及一種候選肽，將一種ab與庫(kù)接觸，確定至少一種能與ab結(jié)合的候選肽，并確定候選肽與ab的離解系數(shù)(kd)是否在1-10nm之間。在本方法的各種實(shí)施例中，該庫(kù)包括病毒胞或孢子。具體地在一個(gè)實(shí)施例中，該庫(kù)中包括大腸桿菌，在另一個(gè)實(shí)施例中，肽支架進(jìn)一步包括一種檢測(cè)基團(tuán)。本發(fā)明也提供了另一種篩選方法，該方法能確定具有最優(yōu)的掩蔽效能的掩蔽抗體或抗體片段的掩蔽基團(tuán)(mm)肽。包括：提供一種包括都中ab的庫(kù)，每一種都與一種候選肽結(jié)合，其中ab能與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合；對(duì)每一個(gè)庫(kù)成員與其靶點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)比每一個(gè)庫(kù)成員與靶點(diǎn)結(jié)合和每一個(gè)庫(kù)成員沒(méi)有耦合候選肽時(shí)與靶點(diǎn)的親和力。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，最優(yōu)掩蔽效能是當(dāng)庫(kù)成員與其靶點(diǎn)結(jié)合的親和力是與沒(méi)有經(jīng)過(guò)修飾的ab與其靶點(diǎn)結(jié)合親和力的10％時(shí)。在一方面，本發(fā)明提供的也是一種提高了生物利用度的抗體療法，其中，當(dāng)對(duì)比治療抗體在第二組織中與其靶點(diǎn)的結(jié)合時(shí)，治療抗體在一種第一組織中與其靶點(diǎn)結(jié)合的親和力較低。在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明提供的也是一種藥物成分包括：一種能與其靶點(diǎn)結(jié)合的抗體或抗體片段(ab)，一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。其中，抗體或抗體片段在第一組織中與其靶點(diǎn)的親和力低于抗體或抗體片段在第二組織中與其靶點(diǎn)的親和力。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，ab與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合能將低ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合，并且ab與裂解基團(tuán)(耦合)能被一種酶特異性裂解。在相關(guān)的實(shí)施例中，靶點(diǎn)是egfr、tnfα、cd11a、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、轉(zhuǎn)鐵蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4。在相關(guān)的實(shí)施例中，cm是用于半胱氨酸蛋白酶、纖溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mtl-mmp、組織蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa一種底物。在相關(guān)的實(shí)施例中，抗體或抗體片段是西妥昔單抗、帕木單抗、英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依法珠單抗、伊匹單抗、tremelimumab(ctla-4單抗)、阿德木單抗、hu5c8、阿倫單抗、雷珠單抗、托西莫單抗、替伊莫單抗、利妥昔單抗、英利昔單抗、貝伐珠單抗或figitumumab(igfr-1抑制劑)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一組織是一種正常組織，第二組織是一種病變組織?；蛘叩谝唤M織是一種早期腫瘤，第二種組織是一種晚期腫瘤。第一種組織是一種良性腫瘤，第二種組織是一種惡性腫瘤?；蛘叩谝环N組織和第二種組織是空間上分開(kāi)的。或第一種組織是上皮組織，第二種組織是乳腺、頭、頸、肺、胰腺、神經(jīng)系統(tǒng)、肝、前列腺、泌尿生殖道或?qū)m頸組織。在一個(gè)實(shí)施例中，在一個(gè)具體的實(shí)施例中，藥劑是一種抗腫瘤藥。本發(fā)明提供的也是一種用于診斷和治療的具體的組合物成分。本發(fā)明提供的組合物包含一種半胱氨酸蛋白酶激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種纖溶酶激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種半胱天冬蛋白酶激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種tmprss-3/4激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種psa激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種組織蛋白酶激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種β-分泌酶激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種upa激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種tmprss-3/4激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種mtl-mmp激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的egfr抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的tnfα抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的cdlia抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的csfr抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的ctla-4抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的epcam抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的cd40l抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的notchl抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的notch3抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的jaggedl抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的jagged2抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的cetuximab抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的vectibix抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的infliximab抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的adalimumab抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的efalizumab抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的ipilimumab抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的tremelimumab(ctla-4單抗)抗體或抗體片段(ab)；一種組合物包含一種激活的與掩蔽基團(tuán)(mm)耦合的adecatumumab抗體或抗體片段(ab)；參考文獻(xiàn)就像每一個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)被專門(mén)及單獨(dú)指出作為文獻(xiàn)納入本發(fā)明一樣，本發(fā)明提到的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)以相同的范圍作為文獻(xiàn)納入本發(fā)明。附圖說(shuō)明本發(fā)明的新特點(diǎn)在專門(mén)所附的權(quán)利要求中闡明。參考如下說(shuō)明性實(shí)例提出的詳細(xì)的描述將對(duì)本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)獲得更好的理解。在實(shí)例中使用了本發(fā)明的原理，并有配圖。圖1顯示了含有一種抗體(一種ab)、一種掩蔽基團(tuán)(mm)、和一種裂解基團(tuán)(cm)的一種蛋白酶激活的aa。圖2顯示了一種典型的aa在體外的活性。圖a顯示了aa不能結(jié)合、副作用可以忽略的正常組織；圖b顯示了病變組織，其中aa被一種特定疾病蛋白/降低允許aa結(jié)合到靶點(diǎn)的試劑激活并起作用。圖3顯示了一種生成蛋白激活的aa的過(guò)程，包括：mm的篩選；cm的篩選；mm、cm和一種ab的組裝；表達(dá)和純化組裝的結(jié)構(gòu)；已經(jīng)分析組裝的結(jié)構(gòu)獲得在體外和體內(nèi)的活性和毒性。圖4提供了一種典型mmp-9裂解掩蔽抗egfscfv的氨基酸序列。圖5提供了elisa數(shù)據(jù)，顯示mmp-9對(duì)mbp激活：抗-vegfscfvaa與mm306和314。樣品用tev處理以出去mbp融合的配體隨后被mmp-9消化激活。圖6提供了elisa數(shù)據(jù)，顯示了依賴mmp-9的vegf與抗vegfscfvhis結(jié)合的結(jié)構(gòu)與306mm。圖7提供了elisa數(shù)據(jù)，顯示了依賴mmp-9的vegf與抗vegfscfv-fcaa結(jié)合與來(lái)自hek細(xì)胞上清液的mm306和314。圖8提供了elisa數(shù)據(jù)，顯示了依賴mmp-9的vegf與抗vegfscfv-fcaa結(jié)合的結(jié)構(gòu)及用蛋白a柱純化的mm306和314。圖9顯示了與抗vegf抗體結(jié)合、具有>600nm親和力的306mm沒(méi)有有效地排除與vegf的結(jié)合。圖10顯示了抗ctla4的輕鏈和重鏈通過(guò)soe-pcr連接，在vhvl和vlvh兩個(gè)方向產(chǎn)生scfv結(jié)構(gòu)。圖11顯示了用pcr增加mm克隆、cm裂解片段、ggs2連接體在抗ctla4scfvvhvlandvlvh結(jié)構(gòu)的n-末端的位點(diǎn)數(shù)。圖12顯示了一種被mmp-9激活的aa。圖13顯示了當(dāng)cm被裂解移除mm，ab的連接被恢復(fù)。圖14一節(jié)aa激活一種蛋白酶，導(dǎo)致抗體結(jié)合未修改抗體難以區(qū)別。圖15顯示了一種包含一種具有與veg特異性結(jié)合親和力ab的aa被抑制，激活的aa與具有皮摩爾親和力的vegf結(jié)合。圖16描繪了一種包含一種具有與veg特異性結(jié)合親和力ab的aa抑制huvec增殖。圖17顯示了培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出原位穩(wěn)健地激活包含一種具有與veg特異性結(jié)合親和力ab的aa。圖18顯示一種在正常和癌患者血漿中沒(méi)有活性的aa。圖19顯示了抗ctla4scfv與小鼠和人ctla4的結(jié)合。圖20顯示了一種蛋白激活的包含一種抗體(含有一種ab)的aacj，一種掩蔽基團(tuán)(mm)，一種裂解基團(tuán)(cm)，以及一種共軛試劑?；赾m的裂解和解掩蔽，共軛的ab被釋放。圖21顯示了在標(biāo)有抗vegf的3種不同的濃度熒光團(tuán)。所有三個(gè)具親合性成熟的肽顯示至少有比js306高倍10的親合性。圖22顯示了一些egfr的親和力成熟的過(guò)程。圖23顯示了c225fab與mm3690、mm3954和mm3957結(jié)合的細(xì)胞親和力測(cè)量的結(jié)合曲線。mm3954和mm3957顯示了至少比mm3690高100倍親和力。圖24顯示了靶點(diǎn)替代物分析和以親代抗體結(jié)合程度百分比表示的平衡結(jié)合程度。圖25顯示了不同于upa對(duì)照，底物sml6、kk1203、204和1214表現(xiàn)出了經(jīng)klk5、klk7和纖溶酶裂解的阻力。圖26顯示了不同于一種非優(yōu)化的底物，優(yōu)化的底物plasl237、plasl29和plas1254表現(xiàn)了經(jīng)klk5、klk7裂解的阻力。圖27圖a顯示了scfvaa的活化，包括天冬酰胺內(nèi)肽酶的底物aanl和ptnl隨后經(jīng)5mg/ml天冬酰胺內(nèi)肽酶處理。圖b顯示了抗vegfiggaa的活化，包括天冬酰胺內(nèi)肽酶的底物ptnl。圖28顯示了天冬酰胺內(nèi)肽酶活化的aa中被活化的aa在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)占總aa的比例。當(dāng)活化7天被纖維酶活化的aa接近活化完全時(shí)，兩種被天冬酰胺內(nèi)肽酶活化的aa僅有最低限度的活化。被天冬酰胺內(nèi)肽酶活化的aa長(zhǎng)達(dá)7天是從血清中分離出來(lái)，隨后注射保持掩蔽。(n＝4)。圖29顯示了掩蔽的單鏈fv-fc融合原抗體表現(xiàn)出提高了的血清半衰期。圖30顯示了在健康小鼠體內(nèi)超過(guò)10天的scfv-fc血藥濃度。aa的濃度7天后的劑量仍維持穩(wěn)定，而親代scfv-fc的濃度3天后降低，10天后幾乎檢測(cè)不到。圖31顯示了與親代scfv-fc在荷瘤小鼠體內(nèi)相比，aascfv-fc在血清中的濃度提高并維持時(shí)間較長(zhǎng)。在3天及3-7天和7天在血清中檢測(cè)到占初始劑量較高百分比的aa。圖32顯示了在對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行的多次劑量的研究中，aascfv-fcs維持在高濃度。在研究過(guò)程中，aa比其親代保持顯著的高血藥濃度。圖33顯示了與沒(méi)有經(jīng)mm修飾的抗體相比，aa在正常小鼠血清中維持在高水平。圖34顯示，由蛋白酶活化的激活抗體復(fù)合物(aac)，包一種或多種抗體或抗體片段(在該圖中，ab被稱為abd)、一種掩蔽基團(tuán)(mm)和一種裂解基團(tuán)(cm)，其中abd1和abd2被任意指定給第一和第二ab。在該實(shí)施例中，mm1和mm2分別與含有abd1和abd2域結(jié)合，作為掩蔽基團(tuán)干擾靶點(diǎn)與一種未裂解的能進(jìn)行雙靶點(diǎn)結(jié)合的aac結(jié)合。結(jié)合ab的靶點(diǎn)可以相同或不同，或相同靶點(diǎn)的不同結(jié)合點(diǎn)。在一些實(shí)施例中(圖ia、id、if)，mm1在相反的分子上與含有abd2的域結(jié)合，形成能夠作為abdl和abd2的掩蔽基團(tuán)的復(fù)合物。圖35顯示，在未裂解狀態(tài)下發(fā)生交叉掩蔽的aac，這樣與兩個(gè)ab結(jié)合的靶點(diǎn)被減弱，并且在一種裂解cm(使復(fù)合物分解)的試劑存在時(shí)，靶點(diǎn)的結(jié)合提高了。在該圖中，ab1和ab2分別被稱為abd1和abd2。圖36顯示，在未裂解狀態(tài)下，一種通過(guò)mm1和abd1(ab1)共價(jià)鍵形成的aac，這樣，由abd2(ab2)連接的靶點(diǎn)被減弱，并且在一種裂解cm(使復(fù)合物分解)的試劑存在時(shí)，靶點(diǎn)的結(jié)合提高了。在該圖中，ab1和ab2分別被稱為abd1和abd2。發(fā)明詳述本發(fā)明提供修飾抗體組成及對(duì)治療和診斷有用的修飾抗體組成。本發(fā)明所述的組成顧及更好的生物分布和提高了生物利用度。修飾的和激活的抗體本發(fā)明所述的修飾抗體組成包含至少一種抗體或及其抗體片段(在整個(gè)本發(fā)明中統(tǒng)稱為ab)，能夠特異性與一種靶點(diǎn)結(jié)合，其中ab是由一種掩蔽基團(tuán)(mm)修飾的。當(dāng)ab用mm修飾并在靶點(diǎn)存在時(shí)，對(duì)比沒(méi)有用mm修飾的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合或親代ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合，ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合被降低或被抑制。用mm修飾的ab對(duì)其靶點(diǎn)的離解常數(shù)可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000或大于、或在5-10、10-100、10-1000、10-10000、10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000之間,或比沒(méi)有用mm修飾的ab對(duì)其靶點(diǎn)或親代ab對(duì)其靶點(diǎn)的kd大100000-10000000倍。相反，用mm修飾的ab對(duì)其靶點(diǎn)的親和力可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000或大于、或在5-10、10-100、10-1000、10-10000、10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000之間,或比沒(méi)有用mm修飾的ab對(duì)其靶點(diǎn)或親代ab對(duì)其靶點(diǎn)的親和力低100000-10000000倍。mm對(duì)ab的離解常數(shù)(kd)一般大于ab對(duì)其靶點(diǎn)的離解常數(shù)。mm對(duì)ab的離解常數(shù)可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、100000、1000000或甚至比ab對(duì)其靶點(diǎn)的離解常數(shù)大10000000倍。相反，mm對(duì)ab的親和力可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、100000、1000000或甚至比ab對(duì)其靶點(diǎn)的親和力低10000000倍。如本發(fā)明所述，當(dāng)ab用mm修飾并在靶點(diǎn)存在時(shí)，對(duì)比沒(méi)有用mm修飾的ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合或親代ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合，ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合被降低或被抑制。當(dāng)對(duì)比沒(méi)有用mm修飾的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合或親代ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合，當(dāng)用mm修飾時(shí)，在體內(nèi)或在體外用靶點(diǎn)替代物進(jìn)行免疫吸附劑分析，ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合能力可以被降低至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及甚至100％至少2,4,6,8,12,28,24,30,36,48,60,72,84,96,小時(shí),或5,10,15,30,45,60,90,120,150,180天,或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12月或更長(zhǎng)。mm能抑制ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。mm能與ab的抗原結(jié)合域結(jié)合從而抑制ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。mm能sterically抑制ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。mm能allosterically抑制ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。在這些實(shí)施例中，當(dāng)ab被修飾即被mm耦合并在靶點(diǎn)存在時(shí)，ab與其靶點(diǎn)沒(méi)有結(jié)合或基本沒(méi)有結(jié)合，或當(dāng)與沒(méi)有經(jīng)mm修飾的ab、親代ab、或沒(méi)有耦合mm的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合對(duì)比時(shí)，ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合不大于0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％，，如本發(fā)明所述，當(dāng)在體內(nèi)或在體外用靶點(diǎn)替代物進(jìn)行免疫吸附劑分析，至少為2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小時(shí)，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或更長(zhǎng)。當(dāng)一種ab被mm耦合即由mm修飾時(shí)，mm能“掩蔽”或降低、或抑制ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合。當(dāng)一種ab被mm耦合即由mm修飾時(shí)，這種耦合或修飾能影響一種降低或抑制ab與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合能力的結(jié)構(gòu)的變化。一種ab與mm耦合或用mm修飾可以用如下式子表示，按順序從一個(gè)氨基(n)端區(qū)域到羰基(c)端區(qū)域：(mm)-(ab)(ab)-(mm)(mm)-l-(ab)(ab)-l-(mm)其中mm是一種掩蔽基團(tuán)，ab是一種抗體或抗體片段，l是一種連接體。在許多實(shí)施例中，可能需要插入一個(gè)或多個(gè)連接體。例如，柔性連接體，插入相應(yīng)位置以便提供柔軟性。在某些實(shí)施例中，mm不是一種aa的天然結(jié)合配體。mm可以是ab的一種修飾的結(jié)合配體，其中aa含有至少輕微間給親和力和或?qū)b的結(jié)合親和力的氨基酸變化。在一些實(shí)施例中，mm不包含或基本不包含同源的ab的天然結(jié)合配體。在一些實(shí)施例中，類似于ab的天然配體，mm不大于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。本發(fā)明也提供了激活的抗體(aas)其中被mm修飾的ab進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)裂解基團(tuán)(cm)。這中aa是表現(xiàn)出與ab的靶點(diǎn)的可激活/可轉(zhuǎn)換的結(jié)合。aas一般包括一種抗體或抗體片段(ab)、被修飾或耦合到一種掩蔽基團(tuán)(mm)以及一種有修飾能力的或裂解的基團(tuán)(cm)。在一些實(shí)施例中，cm包含一種作為目標(biāo)蛋白酶底物的氨基酸或氨基酸序列。在其他實(shí)施例中，cm提供一種通過(guò)還原可裂解的半胱氨酸-半胱氨酸雙硫鍵。在又一個(gè)實(shí)施例中，cm提供一種通過(guò)光解作用激活的光解底物。在圖1中是典型aa的一個(gè)原理圖。如圖所示，aa的部件這樣排列使cm定位在一種裂解狀態(tài)(或相對(duì)激活狀態(tài))并在一個(gè)靶點(diǎn)存在的情況，ab與辦學(xué)目標(biāo)結(jié)合，而在一種未裂解的狀態(tài)(或相對(duì)未激活的狀態(tài))并在一個(gè)靶點(diǎn)存在的情況，由于ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合能力由mm抑制或掩蔽，ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合被降低或被抑制。經(jīng)一種mm和一種cm修飾的ab對(duì)靶點(diǎn)的離解常數(shù)kd可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5000、10000、50000、100000、500,000、1000000、5000000、10000000、50000000或大于、或在5-10、10-100、10-1000、10-10000、10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000之間，或比沒(méi)有經(jīng)mm和cm修飾的ab對(duì)靶點(diǎn)的kd大100000-10000000倍。相反，經(jīng)一種mm和一種cm修飾的ab對(duì)靶點(diǎn)結(jié)合的親和力可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000或大于，或在5-10、10-100、10-1、000、10-10000、10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000之間，或比沒(méi)有經(jīng)mm和cm修飾的ab對(duì)靶點(diǎn)結(jié)合的親和力低100000-10000000倍。如本發(fā)明所述，對(duì)比沒(méi)有被mm和cm修飾的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合，當(dāng)ab被mm和cm修飾并在靶點(diǎn)存在而修飾試劑(如一種酶、蛋白酶、減活劑、光)不存在時(shí)，ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合可被降低或抑制。當(dāng)對(duì)比親代ab或沒(méi)有被mm和cm修飾的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合，在體內(nèi)或在體外用靶點(diǎn)替代物進(jìn)行免疫吸附劑分析，被mm和cm修飾的ab結(jié)合其靶點(diǎn)的能力被降低至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及甚至100％至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小時(shí)，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天,或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或更長(zhǎng)。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語(yǔ)裂解狀態(tài)是指aa伴隨通過(guò)蛋白質(zhì)，和/或一種半胱氨酸-半胱氨酸雙硫鍵、cm鍵、和/或光激活修飾cm的狀態(tài)。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語(yǔ)未裂解狀態(tài)，是指aa不在蛋白質(zhì)裂解cm的狀態(tài)，和/或不在cm的胱氨酸-半胱氨酸雙硫鍵降低的狀態(tài)、和/或不在光存在的狀態(tài)。如上所述，本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)aa是指一種aa在未裂解(原始)狀態(tài)及其裂解狀態(tài)的兩種狀態(tài)。這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是明確的，在一些實(shí)施例中，由于通過(guò)蛋白質(zhì)對(duì)一種cm的裂解，aa可能缺少一種mm，至少導(dǎo)致mm的釋出(其中mm沒(méi)有與通過(guò)共價(jià)鍵(如在半胱氨酸殘基之間的雙硫鍵)結(jié)合)?？杉せ畹幕蚩赊D(zhuǎn)換的意思是當(dāng)在一種被抑制、被掩蔽或未裂解狀態(tài)(即，一種第一結(jié)構(gòu))時(shí)，aa表現(xiàn)出一種與其靶點(diǎn)結(jié)合的第一水平，以及在未被抑制、未被掩蔽和/或裂解狀態(tài)(即，一種第二結(jié)構(gòu))時(shí)aa表現(xiàn)出一種與其靶點(diǎn)結(jié)合的第二水平，其中與其靶點(diǎn)結(jié)合的第二水平大于與其靶點(diǎn)結(jié)合的第一水平。一般地，在能夠裂解cm的裂解劑存在時(shí)靶點(diǎn)到達(dá)aa的ab程度比在裂解劑不存在時(shí)是大。這樣，當(dāng)aa處在未裂解狀態(tài)時(shí)，ab與靶點(diǎn)的結(jié)合被抑制并且其與靶點(diǎn)的結(jié)合被掩蔽(即，地域結(jié)構(gòu)是這樣，ab不能與靶點(diǎn)結(jié)合)，而在裂解狀態(tài)ab未被抑制或未被掩蔽其與靶點(diǎn)的結(jié)合。aa的cm和ab可以選擇成ab代表一種相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)合基團(tuán)，cm代表在一個(gè)主體內(nèi)的治療位置能與靶點(diǎn)共存的蛋白酶的一種底物。此外，cm是一個(gè)半胱氨酸-半胱氨酸雙硫鍵是可裂解的，作為雙硫健減少的結(jié)果。aa另外或?qū)⑦M(jìn)一步包括一種不耐光的底物，可通過(guò)一種光源激活。這里所說(shuō)的aa有特別的用途，其中，例如，能夠裂解cm中的位點(diǎn)的蛋白酶在一個(gè)治療位點(diǎn)(如病變組織，如治療處理或診斷處理的例子)的靶點(diǎn)含有的組織中比未經(jīng)治療位點(diǎn)(如在正常組織中)的組織中處于相對(duì)高的水平，如圖2的示例。這里所說(shuō)的aa也有特別的用途，其中，例如，一種能夠降低cm中的位點(diǎn)降低劑在中比在未經(jīng)治療和診斷位點(diǎn)的組織中處于相對(duì)較高的水平。這里所說(shuō)的aa也有特別的用途，例如，像一種治療或診斷位點(diǎn)的靶點(diǎn)含有的組織引入一種能夠光解cm中的一種位點(diǎn)的光源，例如激光。在一些實(shí)施例中，aa可提供降低毒性和/或不良的副作用，否則，如果ab沒(méi)有被掩蔽或抑制與靶點(diǎn)的結(jié)合，將導(dǎo)致ab在未治療位點(diǎn)的結(jié)合。其中，aa包含被一種易于減少雙硫鍵的降低劑裂解的cm，aa的這種ab可以選擇以利用ab的活化，其中有關(guān)的靶點(diǎn)出現(xiàn)在需要治療的以提高了一種降低劑的水平為特征的位點(diǎn)，這樣的環(huán)境中具有比，例如，未治療位點(diǎn)的環(huán)境中更高的降低潛力。一般地，當(dāng)在構(gòu)象約束下，一種aa可以通過(guò)選擇一種目標(biāo)ab和構(gòu)建aa的剩余部分進(jìn)行設(shè)計(jì)以便mm為ab提供掩蔽或降低ab與其靶點(diǎn)測(cè)定結(jié)合。結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)準(zhǔn)則的采用須考慮提供這種結(jié)構(gòu)特性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了結(jié)合雙靶點(diǎn)的aa。這種結(jié)合雙靶點(diǎn)的aa包含兩個(gè)可以結(jié)合相同或不同靶點(diǎn)的ab，在具體的實(shí)施例中，雙靶點(diǎn)aa包含兩個(gè)具體的抗體或抗體片段。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，aa包含一種il17ab和一種il23ab。在其他具體的實(shí)施例中，aa包含一種il12ab和一種il23ab，或一種egfrab和一種vegfab，或一種igflrab和一種egfrab，或一種cmetab和一種igflrab，或一種egfrab和一種vegfab，或一種notch受體ab和一種egfrab，或一種jagged配體ab和一種egfrab，或一種cmetab和一種vegfab。雙靶點(diǎn)結(jié)合的aa可以設(shè)計(jì)成具有被一種在一個(gè)靶點(diǎn)組織中與一個(gè)或兩個(gè)能夠結(jié)合aa中的ab的靶點(diǎn)共存的裂解劑裂解的cm。具有多于一個(gè)對(duì)相同或不同靶點(diǎn)的雙靶點(diǎn)ab可以設(shè)計(jì)成具有多于一個(gè)cm，其中第一cm是在一個(gè)第一靶點(diǎn)的組織中被一種裂解劑可裂解的。而其中的第二cm是在一個(gè)第二靶點(diǎn)的組織中被一種裂解劑可裂解的，具有能夠與aa中的ab結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)。第一和第二靶點(diǎn)的組織在空間上可以是分開(kāi)的，例如，在有機(jī)體中的不同位點(diǎn)。第一和第二靶點(diǎn)的組織可以是暫時(shí)分開(kāi)的相同組織，例如，在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)相同的組織。例如，第一時(shí)間點(diǎn)是當(dāng)組織是一種健康的腫瘤時(shí)，第二時(shí)間點(diǎn)是當(dāng)組織是一種壞死的腫瘤時(shí)。為在一種被抑制的結(jié)構(gòu)或未被抑制的結(jié)構(gòu)中的靶點(diǎn)的結(jié)合提供了在一個(gè)所需的動(dòng)態(tài)范圍表現(xiàn)出可轉(zhuǎn)換表形的aa。動(dòng)態(tài)范圍一般是指一種比例，具有從(a)在第一套條件下的參數(shù)的最大可檢測(cè)水平到(b)在第二套條件下的參數(shù)的最小可檢測(cè)值。例如，在關(guān)于aa的描述中，動(dòng)態(tài)范圍是是指從(a)在能裂解aa的cm的蛋白酶存在下靶點(diǎn)與aa結(jié)合的最大可檢測(cè)水平到(b)在該蛋白酶不存在時(shí)靶點(diǎn)與aa結(jié)合的最小可檢測(cè)水平。aa的動(dòng)態(tài)范圍可以以aa裂解劑治療(例如，酶)的平衡裂解常數(shù)與aa裂解劑治療(例如，酶)的平衡裂解常數(shù)的比例進(jìn)行計(jì)算。aa的動(dòng)態(tài)分為越大，其可轉(zhuǎn)換表形越好。動(dòng)態(tài)范圍數(shù)值相對(duì)較高的aa(例如，大于1)表現(xiàn)出更好的轉(zhuǎn)換表型，以便在裂解aa的cm的裂解劑(例如，酶)存在時(shí)比裂解劑不存在時(shí)使靶點(diǎn)蛋白與aa的結(jié)合在更大的范圍發(fā)生(例如，顯著地發(fā)生)。aa可以多種結(jié)構(gòu)形式提供。有關(guān)aa的典型的結(jié)構(gòu)式在下文提供。專門(mén)設(shè)想在aa中的ab、mm和cm從n到c端的順序被占據(jù)。也專門(mén)設(shè)想cm和mm可能在氨基酸序列中重疊，例如，cm包含在mm中。例如，可以下面的式子代表aa，按順序從一個(gè)氨基(n)端區(qū)域到羰基(c)端區(qū)域：(mm)-(cm)-(ab)(ab)-(cm)-(mm)其中mm是一種掩蔽基團(tuán)，cm是一種裂解基團(tuán)，以及ab是一種抗體及其片段。應(yīng)該指出，盡管mm和ca在上面的結(jié)構(gòu)式中是不同的組件顯示的，在本發(fā)明所有典型的實(shí)施例中(包括結(jié)構(gòu)式)設(shè)想mm和cm中的氨基酸序列可以重疊，例如，這樣cm可以被全部或部分地包含在mm中。此外，上述結(jié)構(gòu)式為位于aa部件的n端或c端提供了額外的氨基酸序列。在許多實(shí)施例中，可能希望插入一個(gè)或多個(gè)連接體，如柔性連接體，到aa的結(jié)構(gòu)中以便在一個(gè)或多個(gè)mm-cm結(jié)點(diǎn)、cm-ab結(jié)點(diǎn)或其兩者提供柔性。例如，ab、mm和/或cm可能不含足夠數(shù)量的殘基(如giy、ser、asp、asn，特別是giy和ser，尤其是giy)以提供所需的柔性。因此，這種aa結(jié)構(gòu)的可轉(zhuǎn)換表型可以從一個(gè)或多個(gè)氨基酸的引入受益以便提供一種柔性的連接體。此外，如下文所示，其中aa作為一種構(gòu)象約束結(jié)構(gòu)而提供，一種柔性連接體可以被切實(shí)可行地插入以便在為未裂解的aa中易于形成并維持一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。例如，在某些實(shí)施例中，一種aa包括下面的結(jié)構(gòu)式中的一種(其中，在n到c端方向或c到n端方向，下式代表一種氨基酸序列)：(mm)-l1-(cm)-(ab)(mm)-(cm)-l1-(ab)(mm)-l1-(cm)-l2-(ab)cycio[l1-(mm)-l2-(cm)-l3-(ab)]其中mm、cm及ab如上文所定義；其中l(wèi)1、l2和l3各自獨(dú)立及可選則存在或不存在、是相同或不同的連接體，包括至少一種柔性氨基酸(如giy)，其中出現(xiàn)cyclo位置，由于在aa中一對(duì)半胱氨酸之間存在雙硫健aa是一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形式。此外，上式可能在aa基元的n端或c端提供了額外的氨基酸序列。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，在式cycio[l1-(mm)-l2-(cm)-l3-(ab)]中，負(fù)責(zé)提供硫鍵的半胱氨酸可能置于aa中兼顧一個(gè)或兩個(gè)尾端，從而當(dāng)aa處于一個(gè)雙硫健結(jié)構(gòu)中時(shí)產(chǎn)生一個(gè)套索或歐米茄結(jié)構(gòu)(這樣處于構(gòu)象約束狀態(tài))。尾端的氨基酸序列為aa提供了額外的特性，如與靶點(diǎn)的受體結(jié)合使aa易于定位、提高aa的血清半衰期，等等。靶向基團(tuán)(例如，出現(xiàn)在靶點(diǎn)組織中的一個(gè)細(xì)胞受體的配體)和血清半衰期延長(zhǎng)基團(tuán)(如，多呆與血清蛋白結(jié)合的多態(tài)，如免疫球蛋白(例如igg))或血清白蛋白(如人血清白蛋白hsa)。經(jīng)過(guò)修飾并激活的抗體的基元。(a)抗體或抗體片段(統(tǒng)稱為ab)根據(jù)本發(fā)明，ab針對(duì)任何可能使用的抗原或半抗原。本發(fā)明中使用的ab針對(duì)任何行列式，例如，腫瘤、細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)、支原體、組織相容性，差異化和其他細(xì)胞膜抗原、病原體表面抗原、毒素、酶、過(guò)敏原、藥物、細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)、任何生物活性分子。此外，可能使用相對(duì)于不同抗原行列式的ab結(jié)合體。如本發(fā)明所使用的，ab是能結(jié)合特別是特異性與相關(guān)的靶點(diǎn)，特別是相關(guān)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合的全尺寸的抗體或包含一種抗原結(jié)合域的抗體片段。在圖1中提供了aa的一種原理圖。在這樣的實(shí)施例中，ab可以是但不限于一種可變或高度可變的抗體的輕鏈和/或重鏈(vl,vh)的區(qū)域、可變片段(fv)、fab'片段、f(ab')2片段、fab片段、單鏈抗體(scab)、單鏈可變域(scfv)、互補(bǔ)決定域(cdr)、域抗體(dabs)、bhh或bnar類型的單域重鏈免疫球蛋白、單域輕鏈免疫球蛋白、或其他本領(lǐng)域已知的含有一種能與靶點(diǎn)蛋白或在靶點(diǎn)蛋白上的抗原表位結(jié)合的ab的多態(tài)。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，ab可以是含有多于一種ab的嵌合體或雜交組合體，例如一種第一ab和一種第二ab，這樣，每一個(gè)ab能與相同或不同的靶點(diǎn)結(jié)合。在一些實(shí)施例中，ab是雙特異性的抗體或其片段。設(shè)計(jì)成與兩種不同的抗原結(jié)合。在一些實(shí)施例中，存在一種在激活形式的第一mm和cm和/或第二mm和cm分別與第一ab和第二ab耦合。ab的起源可以是一種天然存在的抗體或抗體片段、一種非天然存在的抗體或抗體片段、一種合成的抗體或抗體片段、一種混合抗體或抗體片段、或一種工程抗體或抗體片段。該抗體可以是一種人源化抗體或抗體片段。在某些實(shí)施例中，aa含有不止一種ab。在一些實(shí)施例中，ab可以衍生自雙特異性抗體或抗體片段。在其他抗體中，aa可以是工程合成的以便納入到衍生在兩種不同抗體或抗體片段的ab中。在這種實(shí)施例中，ab可以設(shè)計(jì)成與兩種不同的靶點(diǎn)、兩種不同的抗體、或兩種同一靶點(diǎn)上的不同抗原表位結(jié)合。一種含有多個(gè)ab且能與多于一種靶點(diǎn)位點(diǎn)結(jié)合的ab通常設(shè)計(jì)成與一種靶點(diǎn)或多個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)上的不同的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，這樣，一種aa的第一ab的結(jié)合基本不干擾該aa的第二ab與靶點(diǎn)的結(jié)合。含有多個(gè)ab的aa可以進(jìn)一步包括多個(gè)ab-mm單元，它們可以選擇性地被額外的cm分開(kāi)，這樣，由于暴露于一種修飾劑，ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合不再受到抑制，或是“解掩蔽的”。在一些實(shí)施例中，把抗體片段用于源允許靶點(diǎn)位點(diǎn)在一種提高的速率下滲透。igg免疫球蛋白的fab'片段由抗體與胃蛋白酶[導(dǎo)致一種二價(jià)片段(fab1)2]或木瓜蛋白酶[導(dǎo)致2個(gè)一價(jià)片段(2fab)]裂解獲得。parham,1983,j.immunol.131:2895-2902；lamoyiandnisonoff,1983,j.immunol.meth.56:235-243。二價(jià)(fab1)2片段可以分裂通過(guò)一種或幾種雙硫鍵的緩和減少產(chǎn)生單價(jià)fab'片段。fab和(fab1)2片段比一個(gè)完整抗體小，但仍含有一個(gè)ab，所以當(dāng)用作ab時(shí)可以更容易地滲透到靶點(diǎn)的位點(diǎn)或組織。在某些實(shí)施例中，因?yàn)樵S多這樣的片段不能跨過(guò)胎盤(pán)屏障，這可提供在體內(nèi)傳遞的一種優(yōu)勢(shì)。結(jié)果，使用本發(fā)明的這種實(shí)施例，aa可以在孕婦體內(nèi)位點(diǎn)(如腫瘤)傳遞而避免胎兒的暴露。為一種給定的靶點(diǎn)生成一種抗體(或其片段)的方法為本專業(yè)所熟知?？贵w和抗體片段的結(jié)構(gòu)、一種抗體的輕鏈和重鏈(vhandvl)的可變域、fv、f(ab')2、fab片段、單鏈抗體(scab)、單鏈可變域(scfv)、互補(bǔ)決定域(cdr)和域抗體(dab)都是所熟知的。生成具有所需的靶點(diǎn)抗原的一種抗原結(jié)合域的多肽的方法為本專業(yè)所熟知。修飾抗體或抗體片段與額外的多態(tài)耦合的方法為本專業(yè)所熟知。例如，肽如mm、cm或連接體可以經(jīng)過(guò)耦合以修飾抗體形成本發(fā)明中的修飾ab和aa。如在圖3的原理圖中描述的，使用標(biāo)準(zhǔn)方法可以開(kāi)發(fā)并生產(chǎn)含有蛋白酶激活的ab的aa。該抗體或抗體片段(統(tǒng)稱為ab)能與一種蛋白質(zhì)靶點(diǎn)特異性結(jié)合。本發(fā)明中的一種ab與其靶點(diǎn)在裂解系數(shù)不大于1000nm、100nm、50nm、10nm、5nm、1nm、500pm、400pm、350pm、300pm、250pm、200pm、150pm、100pm、50pm、25pm、l0pm、5pm、1pm、0.5pm或0.1pm時(shí)特異性結(jié)合。有關(guān)ab的靶點(diǎn)的典型類型包括，但不一定限于，細(xì)胞表面受體和分泌的集合蛋白(例如、生長(zhǎng)因子)、水溶性酶、結(jié)構(gòu)蛋白(例如，膠原蛋白、纖維連接蛋白)等。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明預(yù)期的aa是那些具有能連接一種胞外靶點(diǎn)、通常是一種胞外蛋白靶點(diǎn)。在其他實(shí)施例中，aa可以設(shè)計(jì)成細(xì)胞吸收以及設(shè)計(jì)成在細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)換的在典型的實(shí)施例中，沒(méi)有任何方式的限制，ab是用于表一中的任何靶點(diǎn)的一種結(jié)合配體。在具體的典型實(shí)施例中，ab是一種用于egfr、tnfα、cd11a、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、鐵傳遞蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或l4的結(jié)合配體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，ab不是cd52的結(jié)合配體。在典型的實(shí)施例中，沒(méi)有任何方式的限制，ab的典型來(lái)源列于表2中。在具體的典型實(shí)施例中，本發(fā)明中ab的來(lái)源是西妥昔單抗、帕木單抗、英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依法珠單抗、伊匹單抗、tremelimumab(ctla-4單抗)、阿德木單抗、hu5c8、阿倫單抗、雷珠單抗、托西莫單抗、替伊莫單抗、利妥昔單抗、英利昔單抗、貝伐珠單抗或figitumumab(igfr-1抑制劑)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，ab的來(lái)源不是阿侖單抗或不是campathtm。表1：典型靶點(diǎn)表2：ab的典型來(lái)源列于表2中的一些ab的典型來(lái)源在下列文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述，它們對(duì)一個(gè)或多個(gè)參考ab的來(lái)源描述作為文獻(xiàn)納入本發(fā)明。remicadetm(英夫利昔單抗):美國(guó)專利第6,015,557號(hào)，nagahirak,fukuday,oyamay,kuriharat,nasut,kawashimah,noguchic,oikawas,nakanishit.humanizationofamouseneutralizingmonoclonalantibodyagainsttumornecrosisfactor-α(tnf-α).jimmunolmethods.1999janl；222(l-2):83-92.)knightdm,trinhh,lej,siegels,shealyd,mcdonoughm,scallonb,moorema,vilcekj,daddonap,etal.constructionandinitialcharacterizationofamouse-humanchimericanti-tnfantibody.moiimmunol.1993nov；30(16):1443-53.humiratm(阿達(dá)木單抗):美國(guó)專利第6258562號(hào)的序列.raptivatm(依法珠單抗):在wertherwa,gonzaleztn,o'connorsj,mccabes,chanb,hotalingt,champem,foxja,jardieupm,bermanpw,prestalg.humanizationofananti-lymphocytefunction-associatedantigen(lfa)-imonoclonalantibodyandreengineeringofthehumanizedantibodyforbindingtorhesuslfa-i.jimmunol.1996dec1；157(11):4986-95中的序列.mylotargtm(吉妥珠單抗奧唑米星):(在coms,avdalovicnm,caronpc,avdalovicmv,scheinbergda,queenc:chimericandhumanizedantibodieswithspecificityforthecd33antigen.jimmunol148:1149,1991中的序列)(caronpc,schwartzma,coms,queenc,finnrd,grahammc,divgicr,larsonsm,scheinbergda.murineandhumanizedconstructsofmonoclonalantibodym195(anti-cd33)forthetherapyofacutemyelogenousleukemia.cancer.1994feb1；73(3suppl):1049-56).soliristm(伊庫(kù)珠單抗):_hillmenp,youngn,schubertj,brodskyr,socieg,muusp,rotha,szerj,elebutem,nakamurar,brownep,risitanoa,hilla,schrezenmeierh,fuc,maciejewskij,rollinss,mojcikc,rotherr,luzzattol(2006).thecomplementinhibitoreculizumabinparoxysmalnocturnalhemoglobinuria.nengljmed355(12):1233-43.tysabritm(那他珠單抗):在legeroj,yednockta,tannerl,homerhc,hinesdk,keens,saldanhaj,jonesst,fritzlc,bendigmm.humanizationofamouseantibodyagainsthumanα-4integrin:apotentialtherapeuticforthetreatmentofmultiplesclerosis.humantibodies.1997；8(1):3-16中的序列.synagistm(帕利佐單抗):在johnsons,oliverc,princega,hemmingvg,pfarrds,wangsc,dormitzerm,o'gradyj,koenigs,tamurajk,woodsr,bansalg,couchenourd,tsaoe,hallwc,youngjf.developmentofahumanizedmonoclonalantibody(medi-493)withpotentinvitroandinvivoactivityagainstrespiratorysyncytialvirus.jinfectdis.1997nov；176(5):1215-24中的序列.易普利姆瑪:j.immunother:2007；30(8):825-830。ipilimumab(anti-ctla4antibodycausesregressionofmetastaticrenalcellcancerassociatedwithenteritisandhypophysitis；jamesc.yang,marybethhughes,udaikammula,richardroyal,richardm.sherry,suzannel.topalian,kimberlyb.suri,catherinelevy,tamikaallen,sharonmavroukakis,israellowy,donalde.white,andstevena.rosenberg.tremelimumab:oncologist2007；12；153-883；blockingmonoclonalantibodyinclinicaldevelopmentforpatientswithcancer；antoniribas,douglasc.hanson,dennisa.noe,robertmillham,deborahj.guyot,stevenh.bernstein,paulc.canniff,amarnathsharmaandjesusgomez-navarro.(b)掩蔽基團(tuán)(mm)本發(fā)明的掩蔽基團(tuán)(mm)一般是指一種耦合并定位于ab并位于氨基酸序列，這樣，它可以降低ab與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合的能力。在一些情況下，mm通過(guò)一種連接體與ab耦合。對(duì)比沒(méi)有耦合mm的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合或親代ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合，當(dāng)ab被mm修飾并且在靶點(diǎn)存在時(shí)，ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合被降低或抑制。被mm修飾的ab對(duì)其靶點(diǎn)的kd通常大于沒(méi)有被mm修飾的ab或親代ab對(duì)其靶點(diǎn)的kd。相反，被mm修飾的ab對(duì)其靶點(diǎn)的結(jié)合親和力通常小于沒(méi)有被mm修飾的ab或親代ab對(duì)其靶點(diǎn)的結(jié)合親和力。mm對(duì)ab的離解常數(shù)(kd)通常大于ab對(duì)其靶點(diǎn)的kd。相反，mm對(duì)ab結(jié)合親和力通常小于ab對(duì)其靶點(diǎn)的結(jié)合親和力。對(duì)比沒(méi)有耦合mm的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合或親代ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合，當(dāng)ab被mm修飾并且在靶點(diǎn)存在時(shí)，ab與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合被降低或抑制。靶點(diǎn)存在及足夠的酶或酶活裂解cm時(shí)，對(duì)比被cm和mm修飾的ab的特異性結(jié)合，當(dāng)ab被cm和mm修飾并且在靶點(diǎn)存在但沒(méi)有足夠的酶或酶活裂解該cm時(shí)，修飾ab對(duì)其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合被降低或抑制。mm可以抑制ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。mm可以結(jié)合ab的抗原結(jié)合域并抑制ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。mm可以從空間上抑制ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。mm可以從allosterically上抑制ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。如本發(fā)明所述，當(dāng)在體內(nèi)或在體外以必須明白替代物進(jìn)行免疫吸附劑分析，在這些實(shí)施例中，對(duì)比沒(méi)有被mm修飾的ab或親代ab、或沒(méi)有耦合mm的ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合，當(dāng)ab被修飾或與mm耦合并且在其靶點(diǎn)存在時(shí)，ab與靶點(diǎn)沒(méi)有結(jié)合或基本沒(méi)有結(jié)合，或不大于0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、或50％ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合至少為2,4,6,8,12,28,24,30,36,48,60,72,84,96小時(shí)，或5,10,15,30,45,60,90,120,150,180天，或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12月或更長(zhǎng)。在某些實(shí)施例中，mm不是ab的天然結(jié)合配體。mm可以是一種用于ab的包含至少略微降低與ab結(jié)合的親和力的氨基酸變化的修飾結(jié)合配體。在一些實(shí)施例中，mm不含有或基本不含有ab的天然結(jié)合配體的同源體。在其他實(shí)施例中，mm與ab的天然結(jié)合配體的相似性不大于5％、10％、15％、20％、25％、30％,35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。當(dāng)ab處于掩蔽狀態(tài)時(shí)，即使在ab的靶點(diǎn)存在時(shí)，mm干擾或抑制ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。然而，在ab未掩蔽的狀態(tài)線，mm對(duì)ab與靶點(diǎn)結(jié)合掩蔽作用被降低，從而，允許ab更大程度接近靶點(diǎn)并提供靶點(diǎn)的結(jié)合。例如，當(dāng)修飾抗體是一個(gè)aa并含有cm時(shí)，在酶尤其是一種特定疾病的酶存在下，ab可以靠cm的裂解被解掩蔽。因此，當(dāng)aa是為裂解的時(shí)，mm是為來(lái)自與靶點(diǎn)結(jié)合的ab提供掩蔽的。但是，當(dāng)aa是裂解結(jié)構(gòu)時(shí)，不能顯著干擾或競(jìng)爭(zhēng)靶點(diǎn)與ab的結(jié)合。因此，當(dāng)mm是未裂解的時(shí)，隨著mm降低靶點(diǎn)的結(jié)合和由為提高靶點(diǎn)結(jié)合而提供的蛋白酶造成cm的裂解，mm與cm的結(jié)合有利于可轉(zhuǎn)換/可激活的表型。mm的結(jié)構(gòu)性質(zhì)將隨各種因素而變化，這些因素如干擾ab與靶點(diǎn)連接所需要的最小氨基酸片段、目標(biāo)靶點(diǎn)蛋白-ab結(jié)合對(duì)、ab的尺寸大小、cm的長(zhǎng)度、無(wú)論cm位于aa內(nèi)及同時(shí)在為裂解的aa中用來(lái)隱蔽ab、連接體的存在與否、內(nèi)部或側(cè)面帶有提供半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵cm的ab的半胱氨酸是否存在，等等。在aa中掩蔽一個(gè)抗體或其片段(ab)的一種策略是在一個(gè)空間位阻阻礙靶點(diǎn)進(jìn)入到ab的閉環(huán)中提供aa，采用這種策略，半胱氨酸位于或靠近n-末端、c-末端、或aa的ab，這樣，依靠半胱氨酸之間形成的雙硫鍵，ab被掩蔽。在一些實(shí)施例中，mm通過(guò)共價(jià)結(jié)合與aa耦合。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)mm結(jié)合到aa的圖個(gè)n-末端阻止aa組成與其靶點(diǎn)的結(jié)合。在又一個(gè)實(shí)施例中，aa通過(guò)在mm和aa之間的半胱氨酸-半胱氨酸雙硫橋與mm耦合。mm可以以各種不同的方式提供，在某些實(shí)施例中，可選擇mm是一個(gè)已知ab的結(jié)合配體，伴隨mm的裂解，提供mm比設(shè)計(jì)的ab結(jié)合靶點(diǎn)蛋白小的親和力與ab結(jié)合，以便降低mm對(duì)靶點(diǎn)與ab結(jié)合的干擾。換句話說(shuō)，如如上所述，當(dāng)aa是未裂解的時(shí)mm是一種掩蔽ab與靶點(diǎn)結(jié)合的形態(tài)。但是，當(dāng)aa以裂解構(gòu)象狀態(tài)時(shí)，至少ab和mm之一不能大幅或顯著干擾或競(jìng)爭(zhēng)與靶點(diǎn)的連接。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，ab和mm不包含天然存在的結(jié)合配體對(duì)的氨基酸序列，這樣，至少ab和mm之一沒(méi)有天然存在連接配體成員的氨基酸序列。如在本發(fā)明的舉例部分所描述的，使用一種免疫吸附靶點(diǎn)代替物分析，可以通過(guò)掩蔽效率測(cè)量方法可以測(cè)量mm對(duì)耦合的靶點(diǎn)和ab結(jié)合的抑制效率。mm的掩蔽效率可由至少兩個(gè)參數(shù)確定：mm對(duì)抗體或其片段的親和力和mm相對(duì)于ab與其靶點(diǎn)結(jié)合界面的空間關(guān)系。至于親和力，通過(guò)舉例的方式，一個(gè)mm具有高親和力，但對(duì)ab上的結(jié)合位點(diǎn)僅能部分抑制。在短時(shí)間內(nèi)，低親和力的mm可能表現(xiàn)出有效的掩蔽。相反，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間后，同一mm可能被靶點(diǎn)取代(由于對(duì)ab的親和力不足)。以類似的方式，兩個(gè)具有相同親和力的mm可能表現(xiàn)出不同的掩蔽程度，根據(jù)抑制的結(jié)合位點(diǎn)，以及它們?nèi)绾未龠M(jìn)抑制ab上的結(jié)合位點(diǎn)或阻止ab與其靶點(diǎn)的結(jié)合。在在另一個(gè)例子中，具有高親和力的mm可結(jié)合和改變ab的結(jié)構(gòu)，使與其結(jié)合的靶點(diǎn)被完全抑制，而另一種具有高親和力的mm可能只是部分地抑制結(jié)合。因此，發(fā)現(xiàn)一種有效的mm不能只根據(jù)親和力，但可以包括一個(gè)具有掩蔽效率的經(jīng)驗(yàn)方法。在aa中mm的時(shí)間依賴性靶點(diǎn)替代物是可以被測(cè)量以優(yōu)化和選擇mm。為此，本發(fā)明描述了一種新的靶點(diǎn)替代物分析方法。在一些實(shí)施例中，mm可以從具有可變mm的候選aa庫(kù)中通過(guò)一個(gè)篩選程序確定。例如，可以選擇一種ab和cm以供所需的酶/靶點(diǎn)結(jié)合，mm的氨基酸序列可以通過(guò)一個(gè)下述的篩選程序確定，以便確定一種可轉(zhuǎn)換表型的mm。例如，在本發(fā)明提供一個(gè)篩選方法中可能使用一個(gè)隨機(jī)肽庫(kù)(例如，從約2至約40或以上的氨基酸)，以確定一個(gè)合適的mm。在具體的實(shí)施例中，對(duì)抗體或其片段(ab)具有特定親和力的mm可以通過(guò)一個(gè)篩選程序確定，該篩選程序包括一個(gè)含有候選mm的肽支架庫(kù)，其中每一個(gè)支架有關(guān)一種跨膜蛋白和候選mm構(gòu)成。然后使該庫(kù)與一個(gè)ab如全尺寸抗體、一個(gè)天然存在的抗體片段、或一個(gè)非天然存在的含有一個(gè)ab的片段(也能與目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)合)的全部或部分接觸，確定一個(gè)或多個(gè)具有可檢測(cè)性結(jié)合ab的候選mm。篩選可包括一輪或多輪磁激活排序(macs)或熒光激活排序(facs)。篩選也可包括mm對(duì)ab的裂解常數(shù)(kd)的確定以及而后掩蔽效率的確定。在這種方式下，具有一個(gè)抑制ab連接到靶點(diǎn)的mm的aa允許確定ab連接裂解狀態(tài)的靶點(diǎn)。并且能進(jìn)一步提供對(duì)轉(zhuǎn)換表型具有一種最佳動(dòng)態(tài)范圍的aa的選擇。確定具有需要的轉(zhuǎn)換表型的aa的方法在先穩(wěn)中詳細(xì)描述。另外，mm可能不與ab定型連接，而是通過(guò)非特異性相互作用，如空間位阻干擾與ab-靶點(diǎn)之間的結(jié)合。例如，mm可能位于未裂解的aa中，這樣，這種aa的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)允許mm通過(guò)基于電荷的相互作用掩蔽ab，從而將mm束縛干擾靶點(diǎn)接近ab。ab可以以構(gòu)象約束的機(jī)構(gòu)形式提供，如一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以方便形成可轉(zhuǎn)換的表型。這可以通過(guò)包括一個(gè)aa結(jié)構(gòu)中的一個(gè)半胱氨酸對(duì)實(shí)現(xiàn)，這樣在半胱氨酸對(duì)之間形成的雙硫鍵將aa放在一個(gè)環(huán)路或環(huán)狀結(jié)構(gòu)中。這樣在提供抑制靶點(diǎn)與ab結(jié)合的同時(shí)，aa保持由所需的蛋白酶所裂解的狀態(tài)。依賴于cm的裂解，環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)被打開(kāi)允許靶點(diǎn)接近ab。半胱氨酸對(duì)可位于aa的任何位置以提供構(gòu)象約束的aa，但是，隨cm減少，不會(huì)大幅或明顯干擾靶點(diǎn)與ab結(jié)合。例如，半胱氨酸對(duì)的半胱氨酸殘基位于mm和兩側(cè)連有mm和ab的連接體、在一個(gè)兩側(cè)連有mm和ab的連接體或其他合適的結(jié)構(gòu)。例如，mm或側(cè)面?zhèn)z有一個(gè)mm的連接體可以包括一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基，其中，當(dāng)aa處在折疊狀態(tài)是，半胱氨酸殘基與位于mm另一端的胱氨酸殘基形成一個(gè)雙硫鍵橋。通常，希望半胱氨酸對(duì)的半胱氨酸殘基位于ab的外面，以便避免干擾靶點(diǎn)結(jié)合接下來(lái)的aa的裂解物。其中被雙硫鍵鍵合的半胱氨酸對(duì)的一個(gè)半胱氨酸位于ab內(nèi)。這樣的定位是可取的，可以在暴露于還原劑中時(shí)避免干擾ab-靶點(diǎn)的結(jié)合。典型的由半胱氨酸之間的雙硫鍵姓曾環(huán)狀結(jié)構(gòu)的aa具有一般公式：xni-(cysi)-xm-cm-ab-(cys2)-xn2x111-cjczo[ccyso-xn1-cm-ab-(cys2)]-xn2其中xn1和xn2相互獨(dú)立，選擇性地出現(xiàn)或不出現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)時(shí)，獨(dú)立地代表任何氨基酸，并且選擇性地包括一個(gè)靈活連接體的氨基酸序列(例如，至少一個(gè)giy,ser,asn,asp,通常至少以一個(gè)giy或ser,通常至少是一個(gè)giy)，以及n1和n2是獨(dú)立地選自從0到任何整數(shù)，通?；虿欢嘤?,2,3,4,5,6,7,8,9或10。cysi和cys2代表一對(duì)能形成雙硫鍵的第一和第二半胱氨酸。x1n代表掩蔽基團(tuán)(mm)的氨基酸，其中x是任何氨基酸，xm是可選的包括一個(gè)靈活的連接體(例如，至少一個(gè)giy,ser,asn,asp,通常至少以一個(gè)giy或ser,通常至少是一個(gè)giy)，m是一個(gè)大于1的整數(shù)，統(tǒng)稱是2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大(如上所述)。cm代表一種裂解基團(tuán)(如本發(fā)明所述)；以及ab代表一種抗體或抗體片段(如本發(fā)明所述)。如上述公式中所使用的，cyclo表示aa中的雙硫鍵從而為aa提供一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。此外，上述公式考慮了雙靶點(diǎn)連接的aa，其中mm是指一個(gè)ab1，ab是指ab2，其中ab1和ab2任意指定為第一和第二ab，其中與ab結(jié)合的靶點(diǎn)可以是相同或不同的靶點(diǎn)，或?qū)ν话悬c(diǎn)的相同或不同的結(jié)合位點(diǎn)。在這中實(shí)施例中，ab1和/或ab2起掩蔽基團(tuán)的作用干擾未裂解的雙靶結(jié)合aa與靶點(diǎn)的結(jié)合。如上所述，半胱氨酸可以定位在aa允許有一個(gè)或兩個(gè)尾端(用代表xn1及xn2代表)，當(dāng)aa是在一個(gè)雙硫鍵結(jié)構(gòu)中時(shí)(從而處于構(gòu)象約束狀態(tài))，從而產(chǎn)生一個(gè)套索或ω結(jié)構(gòu)。尾部的氨基酸序列(s)可以為aa提供額外的功能，如，便于使aa定位結(jié)合到靶點(diǎn)的受體。在某些具體的實(shí)施例中，mm不抑制aa的細(xì)胞進(jìn)入。(c)裂解基團(tuán)(cm)(c)裂解底物(cm)在一些實(shí)施例中，aa的裂解基團(tuán)(cm)可以包括一種作為蛋白酶底物的氨基酸序列，通常是一種胞外蛋白酶。在其他實(shí)施例中，cm包含一個(gè)能夠形成雙硫鍵的并能被一種還原劑裂解的半胱氨酸-半胱氨酸對(duì)。在其他實(shí)施例中，cm包含一種能被光解作用裂解的底物。cm定位于aa中，這樣，當(dāng)cm被一種裂解劑(例如cm的蛋白酶底物被該蛋白酶裂解，和或半胱氨酸-半胱氨酸雙硫鍵被暴露于一種還原劑時(shí)通過(guò)還原作用被打斷)、光誘導(dǎo)的光解作用裂解，在靶點(diǎn)存在時(shí)，導(dǎo)致一種裂解狀態(tài)，ab與靶點(diǎn)結(jié)合，并且在一種未裂解裝填，在靶點(diǎn)存在時(shí)，ab與靶點(diǎn)的結(jié)合被mm抑制(圖2)。應(yīng)該指出，該cm的氨基酸序列可以重疊或包括在mm中，這樣，當(dāng)aa處于未抑制或未裂解或未掩蔽結(jié)構(gòu)時(shí)，全部或部分的cm易于對(duì)ab進(jìn)行掩蔽。cm可以根根據(jù)一種在組織中與aa中的ab的靶點(diǎn)共存的蛋白酶進(jìn)行選擇。在已知的各種不容的條件下，一種目標(biāo)靶點(diǎn)與蛋白質(zhì)共存，其中蛋白酶的底物是為本領(lǐng)域所熟知的。在癌的例子中，靶點(diǎn)組織可以是一種癌組織，特別是一種實(shí)體瘤的癌組織。有文獻(xiàn)報(bào)道，在許多癌癥，如實(shí)體瘤中提高了已知底物的蛋白酶的水平。see,e.g.,laroccaetal,(2004)britishj.ofcancer90(7):1414-1421。非限制性的疾病的例子包括：所有類型的癌癥(乳腺癌、肺癌、大腸癌、前列腺癌、頭頸部癌、胰腺癌等)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、黑色素瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、心血管損害、缺血等。此外，抗生血管靶點(diǎn)，如vegf眾所周知。因此，其中aa中的ab的選擇須滿足能與一種抗生血管靶點(diǎn)如vegf結(jié)合、一個(gè)合適的cm，它將包含一種能被出現(xiàn)在癌治療位點(diǎn)的一種蛋白酶裂解的肽，特別是與沒(méi)有癌變的組織相比，在提高了蛋白酶水平的癌治療位點(diǎn)。在其他實(shí)施例中，aa中的ab能與一種目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)合并且cm可以是，例如天冬酰胺內(nèi)肽酶，纖溶酶，tmprss-3/4、mtl-mmp、mmp-9、組織蛋白酶、凋亡酶、人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶upa或psa。在其他實(shí)施例中，aa是由其他特定疾病蛋白酶、非癌的其他疾病如多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。通過(guò)將cm限制在ab的范圍，未修飾或未裂解的cm能有效抑制或掩蔽ab。當(dāng)cm被修飾(裂解、還原、光解)后，ab不在被抑制或解掩蔽而能與其靶點(diǎn)結(jié)合。aa可以包含多于一種cm如aa可能包括。例如，一個(gè)第一cm(cm1)和一個(gè)第二cm(cm2)。cm1和cm2可以是同一種酶(例如對(duì)該種酶表現(xiàn)不同結(jié)合親和力)的不同底物、或不同酶的不容底物、或cm1是一種酶的底物而cm2是一種光解底物、或cm1是一種酶的底物而cm2是還原底物、或cm1是一種光解底物而cm2是還原底物等等。cm是能被一種試劑(即，酶、還原劑、光)在約以0.001-1500x104m4s"1或至少在0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500x104m-1s"1.的速率被具體修飾的(裂解、還原或光裂解)。一種酶和cm接觸可以實(shí)現(xiàn)該酶對(duì)cm的特異性裂解。當(dāng)aa包含一個(gè)耦合了mm的ab，以及cm在靶點(diǎn)存在和有足夠酶活的條件先，cm可以被裂解。足夠的酶活可以指酶與cm接觸并對(duì)其有效裂解的能力?？梢院苋菀椎卦O(shè)想，一種酶可在附近的cm，但由于該酶對(duì)其他的細(xì)胞因子或蛋白質(zhì)修飾無(wú)法裂解cm。典型的底物包括但不限于被下列表3中的一種或多種酶或蛋白酶裂解的底物。表3典型的酶/蛋白酶此外，aa中的ab可以是與目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)合的而cm可以包括一個(gè)半胱氨酸對(duì)的雙硫鍵，是可以被一種還原劑例如但不限于細(xì)胞還原劑如谷胱甘肽(gsh)、硫氧還蛋白、nadph、核黃素、抗壞血酸等可裂解的，細(xì)胞還原劑是可以在實(shí)體瘤組織或圍繞實(shí)體瘤組織大量存在的。(d)連接體本發(fā)明所述的在復(fù)合物中適宜使用的連接體一般是提供修飾ab或aa的靈活性以便易于抑制ab與靶點(diǎn)結(jié)合的物質(zhì)。種連接體通常稱為靈活的連接體。適用的連接體，應(yīng)可以很容易地選擇和具有任何適宜的不同長(zhǎng)度，例如，從1氨基酸(例如，giy)到20氨基酸，從2氨基酸到15氨基酸，從3氨基酸到12氨基酸，包括從4氨基酸到10氨基酸，從5氨基酸到9氨基酸，從6氨基酸到8氨基酸，或從7氨基酸到8氨基酸，以及可能是1,2,3,4,5,6,或7氨基酸。典型的靈活連接體包括，甘氨酸聚合物(g)n，甘氨酸-絲氨酸聚合物(包括，例如，(gs)n，(gsggs)n和(gggs)n，其中n是一個(gè)整數(shù)，至少是1)、甘氨酸、丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物、以及其他本領(lǐng)域熟知的靈活的連接體。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物是相對(duì)非結(jié)構(gòu)化的，所以可能作為組件之間的中立的紐帶。甘氨酸甚至比丙氨酸更能進(jìn)入φ-φ空間，并且比帶有較長(zhǎng)側(cè)鏈的殘基所受的限制小的多(seescheraga,rev.computationalchem.11173-142(1992))。典型的靈活連接體包括，但不限于，gly-gly-ser-gly、gly-gly-ser-gly-gly、giy-ser-gly-ser-gly、gly-ser-gly-gly-gly、gly-gly-gly-ser-gly、gly-ser-ser-ser-gly等。本領(lǐng)域一般的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，一個(gè)aa的設(shè)計(jì)可以包括全部或部分是靈活連接體，這樣，該連接體可包括一個(gè)靈活的連接體以及將一個(gè)或多個(gè)部分賦予不太靈活的結(jié)構(gòu)以提供所需的aa的結(jié)構(gòu)。(e)額外基元此外上述基元外，修飾的ab和aa可含有額外的基元，例如，aa的氨基酸序列的n-或c-末端。例如，aa可包括一個(gè)易于傳遞到細(xì)胞或目標(biāo)組織的靶向基團(tuán)。次啊外，在下文進(jìn)一步討論的aa庫(kù)中，可以提供在支架蛋白背景下的aa，以便于細(xì)胞表面上aa的顯示。典型的實(shí)施例本發(fā)明提供的藥物成分和aa對(duì)于包括治療和診斷的多種目的非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗egfr、一種耦合了一種mm的纖溶酶激活的抗egfr、耦合了一種mm的tmprss-3/4激活的抗egfr、耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的西妥昔單抗、耦合了一種mm的纖溶酶激活的西妥昔單抗、耦合了一種一種mm的tmprss-3/4激活的西妥昔單抗、耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的帕尼單抗、合了一種mm的纖溶酶激活的帕尼單抗或耦合了一種mm的tmprss-3/4激活的帕尼單抗。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷頭頸部癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了一種mm的mmp9激活的抗tnfα、耦合了一種mm的mtl-mmp激活的抗tnfα、耦合了一種mm的組織蛋白酶激活的抗tnfα、耦合了mm的mmp9激活的英利昔單抗、耦合了一種mm的mmp9激活的阿達(dá)木單抗、耦合了一種mm的mtl-mmp激活的阿達(dá)木單抗、或耦合了一種mm的組織蛋白酶激活的阿達(dá)木單抗。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化癥非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗cd11a、耦合了一種mm的纖溶酶激活的抗cd11a、耦合了一種mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗cd11a、耦合了一種mm的組織蛋白酶激活的抗cd11a、耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的激活的依法珠單抗、耦合了一種mm的纖溶酶激活的依法珠單抗、耦合了一種mm的半胱天冬蛋白酶激活的依法珠單抗、耦合了一種mm的組織蛋白酶激活的依法珠單抗、耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗csfr、耦合了一種mm的纖溶酶激活的抗csfr、耦合了一種mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗csfr或耦合了一種mm的組織蛋白酶激活的抗csfr。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞癌非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了一種mm的纖溶酶激活的抗ctla-4、耦合了一種mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗ctla-4、耦合一種了mm的mtl-mmp激活的抗ctla-4、耦合了一種mm的纖溶酶激活的伊匹單抗、耦合了mm的半胱天冬蛋白酶激活的伊匹單抗。耦合了mm的mtl-mmp激活的伊匹單抗、耦合了一種mm的纖溶酶激活的tremelimumab(ctla-4單抗)、耦合了一種mm的半胱天冬蛋白酶激活的tremelimumab(ctla-4單抗)或耦合了一種mm的mtl-mmp激活的tremelimumab(ctla-4單抗)。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷惡性黑色素瘤非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了一種mm的psa激活的抗epcam、耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗epcam、耦合了一種mm的psa激活的阿德木單抗或耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的阿德木單抗。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷前列腺癌非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了mm的人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶激活的抗cd40l，或一種人類中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶激活的hu5c8。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷淋巴瘤非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了mm的β-分泌酶激活的抗notchl、耦合了一個(gè)mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗notchl、耦合了一個(gè)mm的upa激活的抗notchl、耦合了一個(gè)mm的β-分泌酶激活的抗notch3、耦合了一個(gè)mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗notch3、耦合了一個(gè)mm的纖溶酶激活的抗notch3、耦合了一個(gè)mm的upa激活的抗notch3、耦合了一個(gè)mm的β-分泌酶激活的抗jaggedl、耦合了一個(gè)mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗jaggedl、耦合了一個(gè)mm的纖溶酶激活的抗jaggedl、耦合了一個(gè)mm的upa激活的抗jaggedl、耦合了一個(gè)mm的β-分泌酶激活的抗jagged2、耦合了一個(gè)mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗jagged2、耦合了一個(gè)mm的纖溶酶激活的抗jagged2或耦合了一個(gè)mm的upa激活的抗jagged2。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷三陰性(er，pr和her2陰性)的乳房、頭部和頸部、結(jié)腸癌和其他癌非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了一個(gè)mm的mmp激活的抗cd52或耦合了一個(gè)mm的mmp激活的抗阿侖單抗。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷多發(fā)性硬化癥非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了一種mm的mmp激活的抗mucl、耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗mucl、耦合了一種mm的纖溶酶激活的抗mucl、或耦合了一種mm的一種upa激活的抗mucl。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷上皮細(xì)胞衍生的腫瘤非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗igflr、耦合了一種mm的纖溶酶激活的抗igflr、耦合了mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗igflr、耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗figitumumab單抗、耦合了一種mm的纖溶酶激活的抗figitumumab單抗或耦合了一種mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗figitumumab單抗。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷非小細(xì)胞肺癌和其他上皮性腫瘤非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、耦合了一種mm的纖溶酶激活的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或耦合了一種mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷固體腫瘤、胰腺腫瘤非常有用。本發(fā)明提供的一種典型的aa可以是一種耦合了一種mm的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗gpl30、耦合了一種mm的纖溶酶激活的抗gpl30、或耦合了一種mm的一種upa激活的抗gpl30。在一些實(shí)施例中，這些氨基酸對(duì)治療或診斷實(shí)體瘤非常有用。在一些其他非限制性的典型實(shí)施例中，激活的抗體組成包括一種專門(mén)用于notch1的天冬酰胺內(nèi)肽酶掩蔽的ab、一種專門(mén)用于jagged1的upa激活的掩蔽ab、一種纖溶酶激活、掩蔽的抗vegfscfv、一種mmp-9激活、掩蔽的抗vcamscfv以及一種mmp-9激活、掩蔽的抗ctla4。如列于表1但不限于表其中提供的這些aa僅作為例子，并且這些酶激活的掩蔽抗體aa可設(shè)計(jì)成對(duì)任何靶點(diǎn)，并且通過(guò)使用列于但不限于表2的任何抗體。激活的抗體復(fù)合物在本發(fā)明的一方面，aa是以含有兩個(gè)或多個(gè)ab的復(fù)合物的形式存在，如圖34-36所描繪的。本發(fā)明提供了激活抗體的復(fù)合物(aacs)，其表現(xiàn)出與一個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)蛋白的激活/可轉(zhuǎn)換結(jié)合。aacs通常包括一個(gè)或多個(gè)抗體或抗體片段(abs)、掩蔽基團(tuán)(mms)以及裂解基團(tuán)(cms)。在一些實(shí)施例中，cm包含一種作為目標(biāo)蛋白酶底物的氨基酸序列。在其他實(shí)施例中，cm提供一種能被還原劑裂解的半胱氨酸-半胱氨酸雙硫鍵。aac表現(xiàn)出一種激活的結(jié)構(gòu)這樣，當(dāng)未修飾和經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)修飾的cm相比，至少有一個(gè)ab不能接近靶點(diǎn)，例如，在一種裂解劑存在(一種確定cm內(nèi)裂解位點(diǎn)的蛋白酶)或一種還原劑(例如，一種還原cm內(nèi)雙硫鍵的還原劑)存在時(shí)。aac中的cm和ab可以這樣選擇：ab代表目標(biāo)靶點(diǎn)中的連接基團(tuán)，而cm代表用于在主體治療位置與靶點(diǎn)共存的一種蛋白酶的底物。在一些實(shí)施例中，aacs可以提供降低毒性和/或不良的副作用，如果他們沒(méi)有被掩蔽，否則可能導(dǎo)致ab在非治療部位結(jié)合的結(jié)果。在一些實(shí)施例中，aac可以進(jìn)一步包含一種檢測(cè)極端或一種診斷劑。在某些實(shí)施例中，aac與一種治療即共軛定位于抗原結(jié)合域的外邊。aacs也被用于診斷和/或成像阿凡能夠發(fā)或在樣品中測(cè)試一種裂解劑是否存在。圖43提供了aac的一種原理圖。如圖所示，aac的基元安排為，cm處于裂解狀態(tài)(或相對(duì)活性狀態(tài))，在靶點(diǎn)存在下，ab與靶點(diǎn)結(jié)合，而在未裂解狀態(tài)(或相對(duì)失活狀態(tài))，在靶點(diǎn)存在下，由于ab在組合物中被mm掩蔽，ab與靶點(diǎn)結(jié)合的被抑制。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語(yǔ)裂解狀態(tài)是指aac伴隨cm被一種酶裂解的狀態(tài)和/或cm的半胱氨酸-半胱氨酸雙硫鍵的還原狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)未裂解狀態(tài)是指aac伴隨cm未出現(xiàn)被一種酶裂解的狀態(tài)和/或未出現(xiàn)cm的半胱氨酸-半胱氨酸雙硫鍵的還原狀態(tài)。如上所述，本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)aac是指在未裂解(原始狀態(tài))和裂解兩種狀態(tài)下的aac。對(duì)本領(lǐng)域一般的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明確的，在一些實(shí)施例中，由于mm被蛋白酶所裂解，故一個(gè)裂解的aac中可能缺少一個(gè)mm，從而至少導(dǎo)致該mm的釋放(例如mm沒(méi)有通過(guò)共價(jià)鍵與aac結(jié)合。)可激活的或可轉(zhuǎn)換的意思是當(dāng)在一種原始或未裂解狀態(tài)(即，一種第一結(jié)構(gòu))時(shí)，aac表現(xiàn)出一種與其靶點(diǎn)結(jié)合的第一水平，以及在裂解狀態(tài)(即，一種第二結(jié)構(gòu))時(shí)aac表現(xiàn)出一種與其靶點(diǎn)結(jié)合的第二水平，其中與其靶點(diǎn)結(jié)合的第二水平大于與其靶點(diǎn)結(jié)合的第一水平。一般地，在能夠裂解cm的裂解劑存在時(shí)靶點(diǎn)到達(dá)aac的ab程度比在裂解劑不存在時(shí)是大。這樣，當(dāng)在原始或未裂解狀態(tài)時(shí)，ab與靶點(diǎn)的結(jié)合被掩蔽(即，第一結(jié)構(gòu)是干擾靶點(diǎn)接近ab)，并且裂解狀態(tài)的ab被解掩蔽，與靶點(diǎn)結(jié)合。一般地，一個(gè)aac可以通過(guò)選擇一種目標(biāo)ab(s)和構(gòu)建aac的剩余部分進(jìn)行設(shè)計(jì)，這樣，當(dāng)存在構(gòu)象約束是，mm為ab提供掩蔽。雙靶點(diǎn)結(jié)合的aacs包含兩個(gè)abs，其可以與相同或不同的靶點(diǎn)結(jié)合。在具體的實(shí)施例中雙靶點(diǎn)aacs包含雙特異性抗體或抗體片段。在某些實(shí)施例中，一種復(fù)合物包含兩個(gè)可激活抗體(aa)，每一個(gè)包含一個(gè)ab、cm或mm，這樣發(fā)生交叉掩蔽，也就是在一個(gè)aa上的mm干擾在另一個(gè)aa上的ab與靶點(diǎn)的結(jié)合(圖34a)。在其他實(shí)施例中，一種組合物博阿含兩個(gè)aa，每一個(gè)aa包含一個(gè)ab并且其中一個(gè)含有一個(gè)cm和一個(gè)mm，這樣，交叉掩蔽將普遍發(fā)生，也就是，mm影響組合物的形成并干擾補(bǔ)體與在兩個(gè)aa上的ab的形成(圖34b)。在其他實(shí)施例中，一種組合物包含兩個(gè)aa，每一個(gè)含有兩個(gè)ab、cm和mm，這樣會(huì)發(fā)生交叉掩蔽，也就是，在一個(gè)aa上的mm干擾在其他aa上的ab與靶點(diǎn)的結(jié)合(圖34c)。在其他實(shí)施例中，一種組合物包含兩個(gè)aa，其中一個(gè)aa含有兩個(gè)ab、cm和mm，這樣，交叉掩蔽將普遍發(fā)生，也就是，mm干擾在兩個(gè)aa上的ab與靶點(diǎn)的結(jié)合(圖34d)。在其他實(shí)施例中，一種組合物包含兩個(gè)雙特異性aa的分子，其中雙特異性aa含有兩個(gè)ab、cm和mm，這樣，交叉掩蔽在該組合物內(nèi)發(fā)生，也就是說(shuō)，mm1干擾在分子另一端的ab1與靶點(diǎn)的結(jié)合，以及mm2干擾在分子另一端的ab2與靶點(diǎn)的結(jié)合(圖34e)。在其他實(shí)施例中，一種組合物包含兩個(gè)雙特異性aa的分子，其中雙特異性aa含有兩個(gè)ab、一個(gè)cm和一個(gè)mm，這樣，交叉掩蔽在該組合物內(nèi)普遍發(fā)生，也就是，mm干擾在兩個(gè)ab與靶點(diǎn)的結(jié)合(圖34f)。一般地，在能裂解cms的裂解劑存在比不存在時(shí)，aac的拆分和靶點(diǎn)接近至少一個(gè)aacs的ab更容易(圖35)。一種復(fù)合物物中的兩個(gè)aa可以包含結(jié)合不同靶點(diǎn)的abs或在同一靶點(diǎn)上的不同表位。該復(fù)合物中的一個(gè)mm/ab對(duì)可用于穩(wěn)定的復(fù)合物的形成并且其本身沒(méi)有需治療的靶點(diǎn)。一種對(duì)非治療ab有高親和力的mm允許一種穩(wěn)定復(fù)合物的形成，甚至對(duì)治療的ab有低親和力的mm。多價(jià)復(fù)何物的背景下，這種對(duì)治療的ab有低親和力的mm將有效掩蔽治療的ab，但是裂解后將更易于離解。為了在裂解狀態(tài)下達(dá)到最大的與靶點(diǎn)的結(jié)合，mm與ab的靶點(diǎn)的親和力的差別應(yīng)該是最大的。在其他實(shí)施例中，ab可與復(fù)合物分子另一端的mm形成一個(gè)共價(jià)鍵連接。在裂解劑存在時(shí)，復(fù)合物離解，這樣將至少有一個(gè)ab與其靶點(diǎn)結(jié)合(圖36)。這樣的共價(jià)鍵連接可在mm中的反應(yīng)性氨基酸的支鏈與ab，如半胱氨酸中間的雙硫鍵之間形成，或者通過(guò)反應(yīng)基團(tuán)與mm和一種催化ab的化學(xué)共軛形成。共價(jià)見(jiàn)連接抗體的例子見(jiàn)chmuraa.j.etal.,procnatlacadsciusa.2001july17,98(15):8480-8484；rader,c.etal.,procnatlacadsciusa.2003april29,100(9):5396-5400；armentano,f.etal.,immunologyletters2006february28,103(1):51-57.應(yīng)該指出，盡管mm和cm被指為不同的組件，但可以設(shè)想mm和cm的氨基酸序列是可以重疊的。例如，這樣cm可以完全或部分包含在mm中。在許多實(shí)施例中，在aac結(jié)構(gòu)中插入一個(gè)或多個(gè)連接體，例如靈活的連接體，以便在一個(gè)或多個(gè)mm-cm的結(jié)合部位、cm-ab結(jié)合部位或兩者提供靈活性可能是需要的。此外，對(duì)上述的基元，aacs可包含額外的基元如，例如氨基酸序列、aac的n-或c-末端?？杉せ畹目贵w軛合物在本發(fā)明的一方面，aa的ab進(jìn)一步與一種制劑如一種治療藥劑共軛，從生成一種可激活的抗體軛合物(aacjs)，即一種特定類型的aa。該制劑或直接或通過(guò)一個(gè)連接體與ab連接。這種制劑或連接體選擇性地與那些abs那些區(qū)域連接。這些區(qū)域不是該分子的抗原連接位點(diǎn)的一部分或沒(méi)有直接包含在該分子的抗原連接位點(diǎn)。典型的aacj見(jiàn)圖20。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，一種制劑可以與一個(gè)ab共軛。當(dāng)需要與ab共軛的制劑傳遞和釋放時(shí)，可使用熟知的免疫球蛋白類激活補(bǔ)體。在其他應(yīng)用中，可能使用不能激活補(bǔ)體的載體免疫球蛋白。這種免疫球蛋白載體可包括：某些抗體類如igm、iga、igd、ige，某些igg的亞類，或某些免疫球蛋白的片段，如，半abs(一種單重鏈：輕鏈對(duì))，或fab、fab'，或(fab1)2片段。典型的aacj是耦合到一種治療及的aa，其中ab是egfr、cd44、notchl、2、3或4，jagged1或2，epcam或igf-ir。本發(fā)明描述的化學(xué)連接方法允許產(chǎn)物aacj維持與抗原結(jié)合并激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的能力(當(dāng)非共軛的aa也具有這種能力時(shí))。所以，當(dāng)aacj供給一個(gè)個(gè)體是，接下來(lái)在體內(nèi)形成的免疫復(fù)合物和靶點(diǎn)抗原一起能激活該個(gè)體的血清補(bǔ)體系統(tǒng)。連接體被設(shè)計(jì)成易于被補(bǔ)體裂解的，這樣該制劑能在靶點(diǎn)位點(diǎn)被一種或多種補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的酶裂解。隨著傳遞到靶點(diǎn)位點(diǎn)，發(fā)生大多數(shù)制劑的釋放。在一個(gè)典型的實(shí)施例中，眾所周知，所有的腫瘤細(xì)胞不是每一個(gè)都擁有靶點(diǎn)抗原決定簇。這樣，需要內(nèi)化到靶點(diǎn)細(xì)胞的傳遞系統(tǒng)將成功地實(shí)現(xiàn)向那些擁有抗原決定簇的腫瘤細(xì)胞的傳遞并能內(nèi)化這個(gè)軛合物。確實(shí)擁有抗原決定簇或不能內(nèi)化的腫瘤細(xì)胞將逃避治療。根據(jù)本發(fā)明的方法，aacjs將制劑傳遞到靶點(diǎn)。然而，更重要的是，一旦與靶點(diǎn)結(jié)合，本發(fā)明所述的方法允許活性或可激活治療制劑的釋放或激活?？杀粋€(gè)體介導(dǎo)的釋放或激活可通過(guò)如下但不限于這些物質(zhì)激活：補(bǔ)體酶、組織型纖溶酶激活因子、尿激酶、纖維蛋白溶酶或另一種有蛋白水解酶活性的、或通過(guò)光敏劑激活或底物修飾的酶。一旦被釋放，制劑就會(huì)自由地滲透到靶點(diǎn)位點(diǎn)，例如，腫塊。結(jié)果，制劑將作用于沒(méi)有抗原決定簇或不能內(nèi)化這種軛合物的腫瘤細(xì)胞。此外，整個(gè)過(guò)程不依賴與軛合物的內(nèi)化。用于共軛劑的方法本發(fā)明使用幾種方法連接試劑到abs(包括抗體和抗體片段)，有兩種典型的方法連接到ab的碳水化合物基團(tuán)、或連接到ab的巰基的方法。在某些實(shí)施例中，連接不能顯著改變ab的基本特征或aa本身，如免疫特征或免疫活性。其他注意事項(xiàng)包括反應(yīng)的簡(jiǎn)潔性和生成的抗體軛合物的穩(wěn)定性。在某些實(shí)施例中，ab首先與一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)試劑軛合然后與mm和cm連接生產(chǎn)一個(gè)aacj。在其他實(shí)施例中，ab首先與一個(gè)mm和cm連接然后與一個(gè)目標(biāo)試劑以進(jìn)一步軛合生成一個(gè)aacj。i.連接到氧化碳水化合物基團(tuán)在某些實(shí)施例中，試劑可能與一個(gè)ab的碳水化合物基團(tuán)連接。一些碳水化合物基團(tuán)位于免疫球蛋白fc區(qū)域，為了與c1連接的發(fā)生這些基團(tuán)是需要的。所述的位于免疫球蛋白fc區(qū)域的碳水化合物基團(tuán)可用于本發(fā)明的實(shí)施例的略圖中，其中ab是至少包含部分fc區(qū)域的一個(gè)抗體或抗體片段。包含碳水化合物基團(tuán)的任何fab或fab'的片段可用于本發(fā)明的反應(yīng)圖中。一個(gè)這種免疫球蛋白的例子是由putnam等(1973,science182:287)排序的人類igm。抗體的碳水化合物側(cè)鏈、fab或fab'片段或其他含有ab的片段可被選擇性地氧化形成醛。有許多氧化劑如高碘酸、仲過(guò)碘酸、偏高碘酸鈉或偏高碘酸鉀可以使用。然后得到的醛可以與胺基(氨衍生物如伯胺、仲胺、羥胺、肼、酰肼、苯肼、氨基脲或硫脲)反應(yīng)生成一個(gè)schiff堿或還原的schiff堿(例如：亞胺、烯胺、肟、腙、苯腙、縮氨基脲、氨基硫脲或其還原形式)。在us4867973中提供了抗體的化學(xué)氧化方法并且本專利的全部?jī)?nèi)容作為文獻(xiàn)納入本發(fā)明。使用這些氧化劑對(duì)抗體氧化可以通過(guò)熟知的方法實(shí)現(xiàn)。在氧化過(guò)程中，ab一般以一種水溶液形式使用，濃度一般低于100mg/ml，首選1到20mg/ml。當(dāng)一種氧酸或其鹽用于氧化劑時(shí)，一般以水溶液的方式使用，濃度一般為0.001到10mm，有時(shí)為1.0到10mm。氧酸或其鹽的量根據(jù)ab的類型確定，但一般過(guò)量使用，例如，可氧化的碳水化合物的二到10倍。然而，最優(yōu)化的用量可由例行試驗(yàn)確定。在用其氧酸或鹽氧化abs的過(guò)程中，可選擇的范圍包括一種ph大約為4～8的區(qū)域，溫度范圍為0～37℃以及反應(yīng)時(shí)間約為15分鐘到12小時(shí)。在用其氧酸或鹽的氧化過(guò)程中，反應(yīng)可以在最小的光照下實(shí)現(xiàn)以便過(guò)度氧化。另外，ab的可以用酶技術(shù)碳水化合物修飾以便能連接到或與其他化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)。一個(gè)這種沒(méi)的例子是半乳糖氧化酶，它能在氧存在的條件下氧化半乳糖形成一種醛。abs中的碳水化物部分的氧化也可以由酶、半乳糖氧化酶實(shí)現(xiàn)(cooperetal.,1959,j.biol.chem.234:445-448)。在水溶液中使用的抗體濃度一般約為5到100單位每毫升溶液，ph范圍約為5.5到8。ph、底物濃度、緩沖劑和緩沖劑的濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響在cooperetal.,supra有報(bào)道。本發(fā)明的ab軛合物、aa軛合物或ab連接中間體可以通過(guò)用連接劑或選自伯胺、二胺、肼，酰肼，羥胺，苯肼，氨基脲和硫脲組所構(gòu)成的組中含有胺的基團(tuán)與氧化的ab進(jìn)行反應(yīng)生成。在一個(gè)典型的方法中，一種濃度約為0.5到20mg/ml的氧化的ab或ab的連接劑與該試劑或連接劑(反應(yīng)氨基與抗體醛的摩爾比約為1到10000)混合并且將該溶液培養(yǎng)約1到18小時(shí)，適宜的溫度為0到37℃，ph為6到8。軛合物形成后，用適宜的還原劑如氰基鈉或硼氫化鈉對(duì)其進(jìn)行選擇性地穩(wěn)定。ii.連接到巰基基團(tuán)當(dāng)ab是一個(gè)完整的抗體或包括至少一部分重量是，從免疫球蛋白的雙硫鍵可生成自由巰基基團(tuán)，這可通過(guò)抗體的輕度還原實(shí)現(xiàn)。易于還原的igg的雙硫鍵一般是那些連接這兩個(gè)重鏈的雙硫鍵?？拷乖Y(jié)合域的雙硫鍵保持相對(duì)不受影響的狀態(tài)。這種還原導(dǎo)致與連接補(bǔ)體能力的喪失但不干擾與抗體-抗原的結(jié)合能力(karushetal,1979,biochem.18:2226-2232)。在內(nèi)重鏈區(qū)域產(chǎn)生的自由巰基基團(tuán)與連接體或試劑的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)形成一個(gè)降低對(duì)免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)干擾的共價(jià)鍵。這些反應(yīng)基團(tuán)包括，但不限于，反應(yīng)性鹵化烷基基團(tuán)(包括，例如，鹵?；鶊F(tuán))、對(duì)汞苯甲酸基團(tuán)和能進(jìn)行michael型加成反應(yīng)的基團(tuán)(包括，例如，mitraandlawton，1979,j.amer.chem.soc.101:3097-3110描述的馬來(lái)酰亞胺和具有這種類的型基團(tuán))，這些鹵化烷基可以是任何被溴、碘、氯取代的烷基基團(tuán)。本發(fā)明一般性描述的適于抗體或抗體片段還原的條件、方法和材料的細(xì)節(jié)可以在stanworthandturner,1973中、handbookofexperimentalimmunology,vol.1,secondedition,weir(ed.),chapter10,blackwellscientificpublications,london,中找到。其中的章節(jié)作為文獻(xiàn)納入本發(fā)明。通過(guò)連接到還原的免疫球蛋白的自由巰基基團(tuán)或還原的抗體片段生成的ab-試劑軛合物(或ab-連接體中間體)不能激活補(bǔ)體或?qū)ρa(bǔ)體的激活可以忽略不計(jì)。這樣，這些軛合物可以用于不希望裂解和釋放試劑的體內(nèi)系統(tǒng)(例如，一種作為特定底物的酶)。這些軛合物也可以在需要無(wú)補(bǔ)體介導(dǎo)的釋放時(shí)使用。在這樣的一個(gè)實(shí)施例中，試劑可能與一個(gè)在還原的ab上的巰基通過(guò)易于由具有蛋白水解活性的酶裂解的連接體連接，包括但不限于胰蛋白酶、尿激酶、纖溶酶，組織型纖溶酶原激活物等等。盡管ab的巰基與一種試劑的連接降低補(bǔ)體結(jié)合的共軛能力，這種方法可用于在補(bǔ)體介導(dǎo)的釋放系統(tǒng)生成需要使用的aa軛合物。在這樣的一個(gè)實(shí)施例中，一種試劑與一種補(bǔ)體敏感的底物連接體結(jié)合可以與還原的abs的一個(gè)巰基連接，并在含有能激活補(bǔ)體的未共軛aa的混合中被傳遞到靶點(diǎn)。后者將激化補(bǔ)體，而補(bǔ)體將裂解來(lái)自前者的試劑。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，為了連接到還原的abs或aas的巰基，通過(guò)連在連接體的一段連接一個(gè)碘烷基基團(tuán)對(duì)底物連接體或試劑進(jìn)行修飾。連接體上未被修飾的位點(diǎn)可能或不可能以共價(jià)鍵方式與一種試劑連接。例如，以酯基或酰胺基連接試劑的底物連接體通過(guò)加入一個(gè)碘烷基基團(tuán)進(jìn)行修飾從而形成一個(gè)碘烷基衍生物。如前所述，連接體可能是易于或抵抗激活的補(bǔ)體、胰蛋白酶、纖溶酶原、組織型纖溶酶原激活物、尿激酶或其他特定的具有蛋白水解酶活性的酶激活的。與ab共軛的制劑abs可以與任何與ab反應(yīng)后保持其潛在性質(zhì)并能使ab大幅度地保持免疫特定劑免疫活性允許aa有適當(dāng)功能的制劑結(jié)合。該試劑包括所有的化學(xué)修飾物和大幅度地保持其生出活性的制劑衍生物。當(dāng)連接一個(gè)ab的糖類氧化部分的醛基到一種制劑時(shí)，該制劑應(yīng)包含一種選自伯胺、仲胺、肼、酰肼、羥胺、苯肼、氨基脲和硫脲基團(tuán)所構(gòu)成的組中的氨基。如果該制劑不含任何這種氨基，則該制劑可以被修飾引入一個(gè)適當(dāng)?shù)哪荞詈系陌被鶊F(tuán)。在aa中使用的連接ab的試劑根據(jù)預(yù)計(jì)的應(yīng)用(即，殺死、阻止細(xì)胞增殖、激素替代療法或基因療法)目的進(jìn)行選擇。這種試劑包括但不限于，例如，藥物制劑、毒素、毒素的片段、烷化劑、酶制劑、抗生素、抗代謝藥物、抗增殖劑，激素、神經(jīng)遞質(zhì)、dna、rna的sirna、寡核苷酸、反義rna、適體、診斷試劑、不透明輻射染料、放射性同位素、熒光化合物、磁標(biāo)簽、納米粒子、標(biāo)記化合物、凝集素、改變細(xì)胞膜透性的化合物、光化學(xué)化合物、小分子、脂質(zhì)體，膠束、基因治療載體、病毒載體等。本發(fā)明所述的可能使用的一些典型的藥劑列于表4，但表4是非限制性的，也并不意味著是一個(gè)詳盡的清單。最后，也可能使用試劑的組合物或不同類型試劑的組合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，光化學(xué)物質(zhì)包括光敏劑和光熱劑可以用作試劑。有效的光敏劑包括但不限于卟啉和修飾卟啉(例如，血卟啉、血卟啉二甲酰肼、亞卟啉二甲酰肼和原卟啉二甲酰肼)、玫瑰紅，吖啶類、噻嗪類、氧雜蒽類、蒽醌類，吖嗪類、黃素和非金屬含有卟啉、卟啉類化合物、亞甲藍(lán)、曙紅、咖啡因等。其他光敏劑包括但不限于，四環(huán)素類藥物(如二甲基氯四環(huán)素)磺胺類藥物(如磺胺類)、灰黃霉素、酚噻嗪類(如氯丙嗪)、噻嗪類、磺酰脲類以及許多其他類型。光化學(xué)物質(zhì)可以設(shè)計(jì)成或合成制備成吸收特定波長(zhǎng)的光?？梢栽谧饔梦稽c(diǎn)被光源激活光熱劑，如天青a(seeandersonandparrish,1983,science220:524-527)可被用作試劑。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，催化底物修飾并伴隨細(xì)胞毒性副產(chǎn)物產(chǎn)生的酶被用作試劑。這種酶的例子包括但不限于葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、氧雜蒽氧化酶等。表4用于共軛的典型藥劑(c)共軛制劑的連接體本發(fā)明使用幾種方法供abs與制劑連接：(a)連接到ab的碳水化合物基團(tuán)，或(b)連接到ab的巰基基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明，abs可以通過(guò)一種中間連接體以共價(jià)鍵與試劑連接，其中的中間連接體有兩個(gè)基團(tuán)，一個(gè)與ab反應(yīng)，一個(gè)與試劑反應(yīng)。該連接體可以包括任何適宜的有機(jī)化合物，可以按照與ab(或試劑)反應(yīng)但不影響ab的反應(yīng)活性與選擇性進(jìn)行選擇。另外，連接體與ab連接是不破壞試劑的活性。適于與氧化抗體或氧化抗體片段反應(yīng)的連接體包括那些含有一個(gè)選自伯胺、仲胺、肼、酰肼、羥胺、苯肼、氨基脲和硫脲基團(tuán)所構(gòu)成的組中的氨基。這些反應(yīng)功能基團(tuán)可能以連接體結(jié)構(gòu)的一部分存在，或通過(guò)對(duì)不含這種基團(tuán)的連接體進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾引入。根據(jù)本發(fā)明，適與連接到還原的ab是的連接體包括那些，能與一個(gè)還原態(tài)抗體或片段的巰基反應(yīng)的具有某種反應(yīng)基團(tuán)的連接體。這種反應(yīng)基團(tuán)包括，但不限于，反應(yīng)性鹵化烷基基團(tuán)(包括，例如，鹵?；鶊F(tuán))、對(duì)汞苯甲酸基團(tuán)和能進(jìn)行michael型加成反應(yīng)的基團(tuán)(包括，例如，mitraandlawton，1979,j.amer.chem.soc.101:3097-3110描述的馬來(lái)酰亞胺和具有這種類的型基團(tuán))。該試劑可以在連接體連接到ab之前或之后與連接體連接。在某些應(yīng)用中，首先生成一種獨(dú)立于相關(guān)的制劑的ab-連接體的中間產(chǎn)物是必要的。根據(jù)特定的應(yīng)用，一個(gè)特定的制劑以共價(jià)連接到一個(gè)連接體。在其他實(shí)施例中，ab首先與mm、cm劑相關(guān)的連接體相連接，然后與連接體連接達(dá)到共軛的目的。(i)支化連接體在具體的實(shí)施例中，使用了具有多個(gè)供制劑連接位點(diǎn)的支化連接體，對(duì)于多位點(diǎn)連接體，一個(gè)與ab的單共價(jià)鍵連接將產(chǎn)生一種能在多個(gè)位點(diǎn)連接制劑的ab-連接體中間產(chǎn)物。這些位點(diǎn)可以是醛或巰基基團(tuán)或任何制劑能被連接的化學(xué)位點(diǎn)。此外，通過(guò)單位點(diǎn)連接體的連接在多個(gè)ab上的位點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)較高的特異性活性(或較高的制劑對(duì)ab的比例)。通過(guò)兩種方法中的任何一種可以將這些為此案引入到ab。首先是在同一ab上產(chǎn)生多個(gè)醛基和/或巰基。其次是在ab的醛基和/或巰基連接上有多個(gè)雙功能位點(diǎn)接下來(lái)用于與連接體連接的一個(gè)支化連接體。支化連接體的這些雙功能位點(diǎn)或多位點(diǎn)連接體可以是醛基或巰基基團(tuán)，或任何與連接體連接的化學(xué)位點(diǎn)。通過(guò)結(jié)合這兩種方法可能會(huì)獲得更高的特異性活性，也就是，在ab的幾個(gè)位點(diǎn)上連接具有多個(gè)位點(diǎn)的連接體。(ii)可裂解連接體在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中可能使用容易被如但不限于尿激酶、組織型纖溶酶原激活物、胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶、或另一種蛋白水解酶活性的酶的補(bǔ)體系統(tǒng)的酶裂解的肽連接體。根據(jù)本發(fā)明的一種方法，一種通過(guò)易于被補(bǔ)體裂解的連接體被連接。這種抗體選自能激活補(bǔ)體的類型。這樣，該抗體劑共軛物激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)并在靶點(diǎn)問(wèn)點(diǎn)釋放這種試劑。根據(jù)本發(fā)明的另一種方法，一種制劑通過(guò)易于被具有蛋白水解酶活性如尿激酶、組織plasimogen激活因子、纖維蛋白溶酶，胰蛋白酶裂解的連接體被連接。非限制性的可裂解的連接體序列的例子列于表5。表5：用于共軛的典型連接劑序列此外，制劑可以通過(guò)雙硫鍵(例如，半胱氨酸分子的雙硫鍵)與ab連接。由于許多腫瘤天然地釋放出高水平的谷胱甘肽(一種還原劑)，這可以還原雙硫鍵，接著在傳遞位點(diǎn)釋放出該制劑。在某些具體的實(shí)施例中，這種能修飾cm還原劑也能修飾共軛aa的連接體。(iii)間隔和可裂解基元在另一個(gè)實(shí)施例中，有必要以這樣的方式構(gòu)件連接體以優(yōu)化制劑與aa中的ab的間隔。這可由使用一般結(jié)構(gòu)的連接體實(shí)現(xiàn)：w-(ch2)n-qwhereinwiseither-nh-ch2-or-ch2-；qisanaminoacid,peptide；andnisanintegerfrom0to20.w-(ch2)n-q其中w是-nh-ch2-或-ch2-，q是一種氨基酸、肽，n是一個(gè)從0到20的整數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施例中，連接體可以包含一個(gè)間隔基元和一個(gè)裂解基元。間隔基元使可裂解基元的位置遠(yuǎn)離ab的核心，這樣使可裂解基元易于接近起裂解作用的酶。上文中描述的某些支化連接體可以作為間隔基元。通過(guò)上述討論，應(yīng)該理解連接體與制劑的連接(或間隔基元與可裂解基元或可裂解基元與制劑)不需要特別的連接或反應(yīng)模式。任何能提供適宜的穩(wěn)定性的產(chǎn)物的反應(yīng)及生物兼容性都是可接受的。(iv)血清補(bǔ)體和連接體的選擇根據(jù)本發(fā)明提供的方法，當(dāng)需要釋放藥劑時(shí)，使用一類抗體ab激活補(bǔ)體。形成的軛合物保持與抗原結(jié)合和激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)兩種能力。這樣，根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施例，一種藥劑與裂解連接體或裂解單元的一段連接，另一端的連接基團(tuán)連接到在ab的一個(gè)具體位點(diǎn)。例如，如果該試劑有一個(gè)羥基或氨基，它可通過(guò)酯或酰胺鍵分別連接到肽、氨基酸或其他選擇適當(dāng)?shù)倪B接體的羧基末端。例如，這類制劑可通過(guò)一個(gè)碳化二亞胺反應(yīng)連接到肽連接體。如果該試劑含有干擾連接到連接體的雙功能基團(tuán)，這些具有干擾作用的雙功能基團(tuán)在連接前被阻礙而一旦作為產(chǎn)物的產(chǎn)物軛合物或中間體形成則被解阻礙。然后連接體的另一端即氨基酸末端或直接或進(jìn)一步經(jīng)過(guò)修飾與一個(gè)能激活補(bǔ)體的ab連接。連接體(或連接體的間隔基元)可以是具有任何需要的長(zhǎng)度、其一端是連接aa的ab上的特異性位點(diǎn)的共價(jià)鍵。連接體或間隔基元的另一端可與一種氨基酸或肽連接體連接。這樣，當(dāng)在補(bǔ)體存在下這些軛合物與抗原連接，連接制劑與連接體的酰胺或酯鍵將被裂解，導(dǎo)致制劑以及活性性質(zhì)釋放。當(dāng)這些軛合物供給一個(gè)主體時(shí)，將在靶點(diǎn)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)制劑的傳遞與釋放。，特別是在體內(nèi)的對(duì)如表4中但不限于此的藥劑、抗生素、抗代謝藥物、抗增殖劑等的有效傳遞。(v)用于無(wú)補(bǔ)體激活釋放的連接劑在其他靶向傳遞的應(yīng)用中，由于補(bǔ)體級(jí)聯(lián)激化將最終裂解靶點(diǎn)細(xì)胞，因此希望補(bǔ)體未激活時(shí)釋放藥劑。所以當(dāng)藥劑的傳遞和釋放在不殺死靶點(diǎn)細(xì)胞的情況下實(shí)現(xiàn)，這種結(jié)合是有用的。當(dāng)需要細(xì)胞介體如激素、酶、糖皮質(zhì)激素、神經(jīng)遞質(zhì)、基因或酶到靶點(diǎn)細(xì)胞的傳遞時(shí)，這就是理想的目標(biāo)。這些軛合物可通過(guò)在藥劑上連接一個(gè)不能由對(duì)血清蛋白酶裂解輕度易感的連接體激活的補(bǔ)體上的ab制得。當(dāng)這種軛合物給一個(gè)個(gè)體時(shí)，抗原抗體復(fù)合物將快速形成而藥劑的裂解將緩慢地發(fā)生。這樣導(dǎo)致化合物在靶點(diǎn)位點(diǎn)釋放。生化交聯(lián)劑在其他實(shí)施例中，使用某些生化交聯(lián)劑aa可與一種或多種藥劑共軛。交聯(lián)劑將兩種不同分子的官能團(tuán)綁在一起形成分子橋。采用一步法連接兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)，可以使用雜雙功能交聯(lián)劑消除不必要的均聚物形成。典型的雜雙功能交聯(lián)劑參見(jiàn)表6.表6典型雜雙功能交聯(lián)劑(vii)非裂解連接劑或直接連接劑在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，軛合物可以設(shè)計(jì)成試劑可以被傳遞到靶點(diǎn)但不釋放。這可以通過(guò)將試劑直連接到或通過(guò)一個(gè)非裂解連接劑連接到ab而達(dá)成。這些非裂解連接劑可包括氨基酸、肽、d-氨基酸或其他能被修飾、含有官能團(tuán)隨后用本發(fā)明的方連接到abs上的有機(jī)化合物。一個(gè)說(shuō)明這種有機(jī)連接劑的一般性的式子可以是w-(ch2)n-q，其中w是-nh-ch2-或-ch2-；q是在一種氨基酸、肽，n是一個(gè)從0到20的整數(shù)。(viii)非裂解的軛合物另外，化合物可能會(huì)連接不激活補(bǔ)體的abs。當(dāng)使用abs不能激活補(bǔ)體，此連接可使用容易被激活的補(bǔ)體裂解的連接體或不容易被激活的補(bǔ)體裂解連接體達(dá)成。(d)使用激活抗體的共軛劑本發(fā)明的aa共軛劑(aacjs)在治療、診斷、底物修飾等方面非常有用。本發(fā)明的aacjs在各種體內(nèi)應(yīng)用的治療非常有用，例如，但不限于，腫瘤的治療，包括癌、腺瘤、增生；某些免疫疾病，包括自身免疫性疾病，移植物抗宿主疾病(如骨髓移植后)，免疫抑制性疾病，如腎臟或骨髓移植后。這些細(xì)胞紊亂等的治療，包括，例如，骨髓移植，可能包括清除(殺死)不需要的細(xì)胞，例如，惡性細(xì)胞或成熟的t淋巴細(xì)胞。治療應(yīng)用一般集中于各種細(xì)胞疾病的治療，包括上文廣泛描述的疾病，通過(guò)供給本發(fā)明的一種足量的抗體藥劑軛合物?？贵w的性質(zhì)是針對(duì)一種特定抗原特異性免疫及與其進(jìn)行免疫反應(yīng)的，使其非常適合于傳遞藥劑到具體的細(xì)胞、組織、有機(jī)體或任何其他具有特定抗原的位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，aacj其傳遞軛合物到靶點(diǎn)位點(diǎn)的作用。根據(jù)傳遞目的選擇abs、連接體以及制備aacjs的試劑。在具體的靶點(diǎn)位點(diǎn)，試劑的傳遞和釋放或激活可導(dǎo)致選擇性地殺死或抑制腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、真菌、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)或病毒的擴(kuò)散。也能實(shí)現(xiàn)激素、酶、或神經(jīng)遞質(zhì)向選定位點(diǎn)的靶向傳遞。本發(fā)明的方法最終可在基因治療方案中應(yīng)用，其中dna或特定的基因可能在體內(nèi)或體外傳遞到存在特定基因缺陷的靶細(xì)胞。此外，軛合物可用于減少或防止原癌基因，如myc基因，ras基因等的激活。在體內(nèi)給藥可以包括在任何適宜的輔助物內(nèi)使用aacjs試劑，其中輔助物包括血清和生理鹽水、或有或沒(méi)有另一種蛋白質(zhì)如人血清白蛋白。軛合物的劑量可容易地由一般專業(yè)人員確定，也可以根據(jù)細(xì)胞紊亂的特點(diǎn)及試劑的使用有所不同。給藥途徑可以是腸外，一般首選靜脈給藥。底物修飾在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，底物活化劑可用于介導(dǎo)純態(tài)氧或過(guò)氧化物的形成，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，活化劑是一種酶。例如，半乳糖氧化酶氧化半乳糖和在c6位置的半乳糖衍生物。在氧化反應(yīng)過(guò)程中中，氧分子轉(zhuǎn)化為對(duì)鄰近細(xì)胞有毒性的過(guò)氧化氫物質(zhì)。酶的葡萄糖氧化酶，一種黃素酶，也可用于本發(fā)明的實(shí)施例。這種酶是對(duì)β-d-葡萄糖具有高度特異性，由于過(guò)氧化物的形成，可以作為一種抗生素。酶可直接或通過(guò)非裂解連接器連接到一個(gè)ab上。為一個(gè)主體供給有效劑量的aacj，然后用底物灌注。通過(guò)上述方法形成的過(guò)氧化物介導(dǎo)細(xì)胞死亡。過(guò)氧化物的毒性作用可能通過(guò)第二個(gè)酶的調(diào)控放大，優(yōu)選的是人源酶，將過(guò)氧化轉(zhuǎn)化成賭性更強(qiáng)的次氯酸。合適的酶的實(shí)施例包括但不僅限于髓過(guò)氧化物酶，乳過(guò)氧化物酶和氯過(guò)氧化物酶。用于識(shí)別和/或優(yōu)化aas的顯示方法和組合物識(shí)別和優(yōu)化aas的方法，以及用于該方法的組合物，介紹如下。(a)在可可復(fù)制生物實(shí)體上顯示的aas或候選aas庫(kù)在一般情況下，用于可切換的表型的識(shí)別和/或優(yōu)化aa的篩選方法，可以包括，其表面上顯示多個(gè)不同的候選aa庫(kù)的可復(fù)制生物實(shí)體的制備。這些庫(kù)，然后可以接受篩選方法，以確定具有一個(gè)或多個(gè)所需氨基酸特征的候選aa。候選aa庫(kù)可以包含由一個(gè)或更多的mm，連接器(這可能是mm的一部分)，cm(這可能是mm的一部分)，和ab不同的候選aa。在一個(gè)實(shí)施例中，庫(kù)中氨基酸是mm和/或連接器的變量，隨預(yù)選的ab和cm變化。aa包括多對(duì)半胱氨酸殘基為aa提供一個(gè)二硫鍵，aa中半胱氨酸的相對(duì)位置可以是多種多樣的。篩選庫(kù)一般是提供一個(gè)可可復(fù)制生物實(shí)體，顯示在不同的候選aa表面。例如，一個(gè)候選aa庫(kù)可以包括多個(gè)顯示一種可可復(fù)制生物實(shí)體的成員的表面的候選aa，其中所述多個(gè)候選aa的每個(gè)成員包括：(a)的抗體或其片段(ab)；(b)裂解基團(tuán)(cm)；(c)候選掩蔽基團(tuán)(候選mm)，其中的ab，cm和候選mm被定位以使候選mm能抑制ab結(jié)合到一個(gè)處于未裂解狀態(tài)的標(biāo)靶上，并使結(jié)合到處于裂解狀態(tài)的標(biāo)靶上的ab可以被確定。合適的可復(fù)制生物實(shí)體，包括細(xì)胞(如，細(xì)菌(如大腸桿菌)，酵母(如s.cerevesiae)，原生動(dòng)物細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，噬菌體，病毒。在抗體顯示技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。(b)候選aa顯示在可復(fù)制生物實(shí)體的表面上各種使用可復(fù)制生物實(shí)體的顯示技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。這些方法和實(shí)體，包括但不僅限于顯示的方法，如mrna和核糖體展示，真核細(xì)胞的病毒顯示，和細(xì)菌，酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面顯示。seewilson,d.s.,etal.2001pnasusa98(7):3750-3755；muller,o.j.,etal.(2003)nat.biotechnol.3:312；bupp,k.andm.j.roth(2002)moi.ther.5(3):3293513；georgiou,g.,etal.,(1997)nat.biotechnol.15(1):293414；andboder,e.t.andk.d.wittrup(1997)naturebiotech.15(6):553557.表面顯示方法是有吸引力的，因?yàn)樗鼈兡軐晒饧せ罴?xì)胞分選(facs)應(yīng)用與庫(kù)的分析和篩選。seedaugherty,p.s.,etal.(2000)j.immuunol.methods243(12):2112716；georgiou,g.(2000)adv.proteinchem.55:293315；daugherty,p.s.,etal.(2000)pnasusa97(5):20293418；olsen,m.j.,etal.(2003)methodsmoi.biol.230:329342；boder,e.t.etal.(2000)pnasusa97(20):1070110705；mattheakis,l.c,etal.(1994)pnasusa91(19):90229026；andshusta,e.v.,etal.(1999)curr.opin.biotech.10(2):117122.其他可用于識(shí)別能夠結(jié)合到目標(biāo)生物標(biāo)靶的肽的顯示方法如美國(guó)專利第7256038號(hào)所述，其披露的內(nèi)容作為參考納入本發(fā)明。顯示支架是指當(dāng)在一個(gè)宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，多肽存在于宿主細(xì)胞的細(xì)胞外可及面，并用于可操作的連接異源多肽。例如，顯示支架用于本發(fā)明所述方法，以方便篩選候選aa的篩選。提供顯示支架可使目標(biāo)異源多肽可以很容易地從顯示支架釋放，例如，蛋白酶的功能是，有利于融合蛋白的裂解，并釋放從顯示支架釋放候選aa。噬菌體展示涉及末端融合到外殼蛋白的肽定位，如，具有噬菌體顆粒的pin，piiv。見(jiàn)scott,j.k.andg.p.smith(1990)science249(4967):386390；andlowman,h.b.,etal.(1991)biochem.30(45):1083210838。一般來(lái)說(shuō)，結(jié)合有一個(gè)特定功能的多肽通過(guò)用一個(gè)標(biāo)靶孵化，洗去未結(jié)合的噬菌體，洗脫結(jié)合的噬菌體進(jìn)行分離，然后通過(guò)細(xì)菌感染新鮮培養(yǎng)物再放大噬菌體群。典型噬菌體展示和細(xì)胞展示組合物和方法如第5223409，5403484，7118159，6979538，7208293，5571698；5837500號(hào)美國(guó)專利所述。其他典型顯示支架和方法，包括2007年3月22日公布的第2007/0065158號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)所述的?；蛘?，顯示支架可以包括一種蛋白酶裂解位點(diǎn)(與cm的蛋白酶裂解位點(diǎn)不同)使來(lái)自宿主細(xì)胞表面的aa或候選aa裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，可復(fù)制生物實(shí)體，是一種細(xì)菌細(xì)胞，合適的顯示支架，包括循環(huán)置換的大腸埃希氏菌外膜蛋白o(hù)mpx(cpx)如賴斯等人所述，proteinscl(2006)15:825-836.seealso,u.s.patentno.7,256,038,issuedaugust14,2007。(c)構(gòu)建編碼aas進(jìn)一步公開(kāi)的內(nèi)容提供了核酸結(jié)構(gòu)，其包括aas和/或候選aa序列編碼。合適的核酸結(jié)構(gòu)包括，但不僅限于，能夠在原核或真核細(xì)胞表達(dá)的構(gòu)造。一般選擇表達(dá)載體，這樣才能與它們要使用的宿主細(xì)胞相容。例如，可以準(zhǔn)備和使用非病毒和/或負(fù)載病毒的載體，包括質(zhì)粒，用于aa-或候選aa編碼dna和/或在宿主細(xì)胞中表達(dá)的復(fù)制。載體的選擇將取決于需要繁殖的細(xì)胞的類型以及繁殖的目的。某些載體用于放大和構(gòu)造所需的大量dna序列。其他載體適合于培養(yǎng)物中細(xì)胞的表達(dá)。選擇合適的載體是本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所熟知的。很多這樣的載體是市售的。產(chǎn)生載體的方法可以通過(guò)本領(lǐng)域的公知技術(shù)實(shí)現(xiàn)。為了在宿主細(xì)胞中的有效表達(dá)，多聚核苷酸編碼aa或者候選aa可操作鏈接到適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，以方便所需的表達(dá)特性。這些調(diào)控序列可以包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，終止劑，操縱子，阻遏子，沉默子，誘導(dǎo)劑，以及3'或5'utrs。表達(dá)載體一般還提供可能需要或想要的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)，這可能是可誘導(dǎo)或構(gòu)造的，編碼區(qū)在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)的控制下是可操作連接的。這些控制區(qū)域可能來(lái)源于可獲得核酸的人體，或源自外源性來(lái)源的物種。啟動(dòng)子既可以構(gòu)造也可以規(guī)則化。在某些情況下，有條件地使用活性啟動(dòng)子是可行的，如可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，例如，對(duì)溫度敏感的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)基元是與啟動(dòng)子協(xié)同作用，并可以結(jié)合阻遏子(如大腸桿菌中的laco/laciq阻遏子系統(tǒng))或誘導(dǎo)劑(如酵母菌中的gall/gal4誘導(dǎo)系統(tǒng))的dna序列基元。在這種情況下，轉(zhuǎn)錄實(shí)際上是關(guān)閉的，直到啟動(dòng)子被解阻遏或者是被誘導(dǎo)，在該位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄被開(kāi)啟。載體，包括表達(dá)載體，也可以包括在宿主體內(nèi)可操作的選擇性標(biāo)記物，例如，包含目標(biāo)載體的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)。這種選擇性標(biāo)記基因，可以為轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇提供一個(gè)表型特征，如二氫葉酸還原酶或真核細(xì)胞培養(yǎng)物新霉素抗性表達(dá)載體可以包括供插入和去除核酸序列編碼aa和/或候選aa便捷的酶切位點(diǎn)。另外或此外，表達(dá)載體可以包括側(cè)翼序列，可以作為堿基用于引物，有助于促進(jìn)目標(biāo)aa的編碼序列的核酸擴(kuò)增(例如，基于pcr的擴(kuò)增)。上述表達(dá)系統(tǒng)可按照傳統(tǒng)方式與原核生物或真核生物一起使用，這取決于表達(dá)的目的。在一些實(shí)施例，一種單細(xì)胞微生物，如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，釀酒酵母，昆蟲(chóng)細(xì)胞與桿狀病毒載體或更高級(jí)有機(jī)體，如脊椎動(dòng)物的細(xì)胞(如cos7細(xì)胞，hek293，cho細(xì)胞，爪蟾卵母細(xì)胞等)組合，可以用來(lái)表達(dá)宿主細(xì)胞。這些類和類型的宿主細(xì)胞中的表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域眾所周知的。構(gòu)建在可復(fù)制生物實(shí)體上顯示的aas/候選aas庫(kù)的方法本申請(qǐng)所述構(gòu)建aas和/或候選aas庫(kù)設(shè)想方法。在一個(gè)實(shí)施例中，構(gòu)建aas和/或候選aas庫(kù)的方法包括：(a)根據(jù)本發(fā)明所述構(gòu)建編碼多個(gè)aas和/或候選aas的重組dna載體，(b)采用步驟(a)中的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及(c)在適合表達(dá)和顯示融合多肽的的條件下培養(yǎng)步驟(b)中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。(e)制備編碼候選aas的核酸序列制備用于篩選方法的候選aas可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。多肽顯示，單鏈抗體顯示，抗體顯示和抗體片段顯示都是本領(lǐng)域眾所周知的方法。在一般情況下，aa中的一種基元，例如，mm，在aa庫(kù)中的變化是隨機(jī)選擇。庫(kù)中的候選aa，可完全隨機(jī)或者偏向于隨機(jī)，例如，一般在核苷酸/殘基的頻率或者是在一種基元內(nèi)氨基酸(s)的位置。篩選aa的方法本發(fā)明提供了識(shí)別aa的方法，可以是酶激活的aa、對(duì)aa敏感的還原劑或者一種被酶或還原劑激活或被兩者都能激活的aa。一般地，該方法包括接觸多個(gè)帶有能夠結(jié)合到aa的ab上的靶點(diǎn)的候選aa，以及能裂解aa的一個(gè)cm的蛋白酶，從在接觸到蛋白酶情況下結(jié)合到靶點(diǎn)上的多個(gè)成員中選出首批成員，在沒(méi)有蛋白酶的情況下使第一批成員與靶點(diǎn)接觸，并通過(guò)消耗在沒(méi)有蛋白酶的情況下結(jié)合到靶點(diǎn)上的第一批成員來(lái)從第一批成員中選擇第二批成員，其中所述方法用于候選aa的選擇，其顯示出與在沒(méi)有蛋白酶存在的情況下與靶點(diǎn)的結(jié)合相比，在有蛋白酶存在的情況下與靶點(diǎn)結(jié)合的下降。在一般情況下，用于篩選帶所需的切換表型的候選aa的方法，是通過(guò)正篩選步驟實(shí)現(xiàn)的(以鑒定接觸蛋白酶的結(jié)合靶點(diǎn)成員)和負(fù)篩選步驟(以鑒定不接觸蛋白酶的情況下不結(jié)合靶點(diǎn)成員)。負(fù)篩選步驟可以通過(guò)，例如，消耗在不接觸蛋白酶的情況下結(jié)合的群體成員來(lái)實(shí)現(xiàn)。應(yīng)該指出的是，本發(fā)明所述的庫(kù)篩選方法，可以通過(guò)誘導(dǎo)負(fù)篩選開(kāi)始啟動(dòng)在沒(méi)有蛋白酶的情況下沒(méi)有結(jié)合到標(biāo)記靶點(diǎn)的候選者的選擇(即在未裂解時(shí)沒(méi)有結(jié)合到標(biāo)記靶點(diǎn))，然后誘導(dǎo)正篩選(即用酶處理，并選擇未裂解的情況下結(jié)合到標(biāo)記靶點(diǎn)的成員)。然而，為方便起見(jiàn)，篩查方法按照第一步正篩選如下文所述。正和負(fù)的篩選步驟，使用流式細(xì)胞儀對(duì)結(jié)合于可識(shí)別標(biāo)記靶點(diǎn)上的候選aas可以很容易進(jìn)行排序。一個(gè)完整的或周期的篩選程序，同時(shí)包括正選擇步驟和負(fù)選擇步驟。該方法可重復(fù)用于庫(kù)以實(shí)現(xiàn)多個(gè)周期(包括完整的和局部的周期，例如，1.5個(gè)周期，2.5個(gè)周期等)。在這種方式下，表現(xiàn)一個(gè)aa的開(kāi)關(guān)特性的多個(gè)候選aas成員可在所產(chǎn)生的成員中富集。在一般情況下，篩選方法通過(guò)第一次產(chǎn)生核酸庫(kù)編碼顯示支架的多個(gè)候選aas進(jìn)行，是依次插入顯示支架以在可復(fù)制生物實(shí)體的表面上表達(dá)。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)，多個(gè)候選aa是指帶有編碼復(fù)數(shù)的候選aas的多個(gè)多肽，其多個(gè)成員是至少一個(gè)aa組合物的氨基酸序列的變量，例如，多數(shù)是mm，cm或ab，通常是mm的氨基酸序列變量。例如，候選aas的ab和cm被固定，并且?guī)熘械暮蜻xaa是mm的氨基酸序列的變量。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以構(gòu)建一個(gè)庫(kù)，包括候選aa，優(yōu)選帶有一個(gè)被設(shè)計(jì)定位于一個(gè)半胱氨酸殘基以與另一候選aa中半胱氨酸形成二硫化鍵的mm的候選aa(選擇其他殘基以提供一個(gè)帶有氨基酸序列的mm，否則完全或至少部分隨機(jī))。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以構(gòu)建一個(gè)庫(kù)，包括候選aa，其中的mm包含一個(gè)完全隨機(jī)的氨基酸序列。這些庫(kù)可以包含一個(gè)或多個(gè)根據(jù)這種規(guī)則設(shè)計(jì)的候選aas。根據(jù)本發(fā)明方法，通過(guò)篩選多個(gè)所述成員，帶有提供所需切換表型的成員可以被識(shí)別。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例中，多個(gè)候選aas的每個(gè)成員顯示在可復(fù)制的生物實(shí)體表面上(例證細(xì)菌細(xì)胞)。多個(gè)成員都暴露于可裂解候選aas中的cm的蛋白酶，并與作為候選aas中ab的結(jié)合受體的靶點(diǎn)接觸。包含在接觸蛋白酶后結(jié)合靶點(diǎn)的abs細(xì)菌細(xì)胞顯示成員，通過(guò)檢測(cè)靶點(diǎn)結(jié)合進(jìn)行識(shí)別和/或分離(例如，靶點(diǎn)-ab復(fù)合物檢測(cè))。含有在蛋白酶暴露后結(jié)合在靶點(diǎn)上(這可能會(huì)導(dǎo)致cm的裂解)的abs的成員，然后在沒(méi)有蛋白酶的情況下與靶點(diǎn)接觸。顯示含有表現(xiàn)出下降或測(cè)不到的結(jié)合到未裂解的靶點(diǎn)上的ab的成員的細(xì)菌細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)沒(méi)有結(jié)合靶點(diǎn)的細(xì)胞被識(shí)別和/或分離。在這種方式下，多個(gè)結(jié)合到處于裂解狀態(tài)的靶點(diǎn)的，以及表現(xiàn)出降低或檢測(cè)不到的未裂解狀態(tài)靶點(diǎn)結(jié)合的候選aas的成員，被識(shí)別和/或選擇。如上所述，構(gòu)建候選aa庫(kù)，以便篩選aa載體的一個(gè)或多個(gè)方面，例如，提供用于優(yōu)化一個(gè)或更多的mm，cm，和ab的切換表型。aa的一個(gè)或多個(gè)其他基元可以是多種多樣的，以方便優(yōu)化。例如：改變mm，包括在沒(méi)有裂解劑(例如，酶)的情況下能提供aa的不同的構(gòu)象特征的半胱氨酸或其他殘留物的編碼和位置：改變cm以識(shí)別優(yōu)化一個(gè)或多個(gè)所需的特征的底物(例如，酶裂解特異性，等等)；和/或改變ab用于優(yōu)化切換靶點(diǎn)結(jié)合。在一般情況下，候選aa庫(kù)中的基元是根據(jù)目標(biāo)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行選擇的，其中aa是被激活，用于在裂解cm的裂解劑存在條件下增強(qiáng)靶點(diǎn)結(jié)合。例如，cm和ab被固定在庫(kù)成員之間，選擇cm，以使其被與目標(biāo)靶點(diǎn)共存的裂解劑(如酶)裂解，目標(biāo)靶點(diǎn)是ab的結(jié)合受體。在這種方式下，選擇aa，從而使其在適當(dāng)?shù)纳飾l件下，在一個(gè)適當(dāng)?shù)纳镂恢帽贿x擇性激活。例如，它需要構(gòu)建一個(gè)aa用作抗血管生成化合物，并表現(xiàn)出用于vegf結(jié)合的切換表型，候選aa的cm被選定為與vegf共存的酶和/或還原劑的底物(例如，cm可被基質(zhì)金屬蛋白酶裂解)。作為另外一個(gè)實(shí)施例，需要構(gòu)建一個(gè)作為抗血管增生化合物，并表現(xiàn)出用于notch受體結(jié)合、鐵血配體結(jié)合，或表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合的可切換的表型的aa，候選aa的cm被選定為與notch受體，配體鐵血，或表皮生長(zhǎng)因子受體共存的酶和/或還原劑的底物(例如，cm可由upa或纖溶酶裂解)。如上所述，ab一般是根據(jù)目標(biāo)靶點(diǎn)選擇。很多靶點(diǎn)是本領(lǐng)域公知的。目標(biāo)生物靶點(diǎn)包括已被確定在疾病中起作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。這些指標(biāo)包括但不限于細(xì)胞表面受體以及分泌的結(jié)合蛋白(如生長(zhǎng)因子)，可溶性酶，結(jié)構(gòu)蛋白(如膠原蛋白，纖維連接蛋白)，細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)，等等。典型的非限制性的靶點(diǎn)列在表1中，但其他合適的靶點(diǎn)將很容易通過(guò)本領(lǐng)域的普通技術(shù)識(shí)別。此外，許多與目標(biāo)靶點(diǎn)共存的蛋白酶是本領(lǐng)域公知的。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠很容易地使用上述方法識(shí)別相應(yīng)的酶和酶底物。(a)在aa篩選前細(xì)胞表面顯示的選擇性富集篩選方法之前，富集表達(dá)細(xì)胞表面適當(dāng)?shù)碾娘@示支架的細(xì)胞是可行的。選擇性富集可用于從(1)不在細(xì)胞外膜表達(dá)肽或(2)在細(xì)胞外膜上表達(dá)非功能性肽的顯示支架的細(xì)胞庫(kù)除去細(xì)胞。非功能性肽顯示器支架不正確地顯示一個(gè)候選aa，例如，作為一個(gè)終止密碼子或缺失突變的結(jié)果。富集細(xì)胞群可以通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞群，并誘導(dǎo)肽顯示器支架的表達(dá)的富集。然后細(xì)胞，基于進(jìn)行排序，例如，檢測(cè)可檢測(cè)信號(hào)或者并入支架部分或使用結(jié)合到一個(gè)顯示支架或aa的共享部分的可檢測(cè)一標(biāo)記抗體。這些方法在2007年3月22日公布的美國(guó)專利申請(qǐng)第2007/0065158號(hào)有比較詳細(xì)的介紹。(b)通過(guò)裂解的aa篩選靶點(diǎn)結(jié)合篩查之前，候選aa庫(kù)可進(jìn)行擴(kuò)展(例如，在適當(dāng)?shù)臈l件下在合適的底物內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)物)?？蛇x擇性擴(kuò)展后，或作為第一步，該庫(kù)是受到第一次篩選以確定暴露于蛋白酶之后結(jié)合靶點(diǎn)的候選aas。因此，這一步通常被稱為正篩選步驟。為了在蛋白酶裂解后識(shí)別結(jié)合靶點(diǎn)成員，候選aa庫(kù)與顯示候選aa中的可裂解cm的蛋白酶相結(jié)合以便有大量充足的時(shí)間和適宜的條件用于cm的蛋白酶底物的裂解。大量蛋白酶-cm制品通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)就可以很容易找到，其m，并在與目標(biāo)靶點(diǎn)共存的酶(是ab的結(jié)合受體)。例如，目標(biāo)靶點(diǎn)一種與靶點(diǎn)相關(guān)的實(shí)體瘤(如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，vegf)，合適的酶，包括，例如，基質(zhì)金屬蛋白酶(如mmp-2)，一種血小板反應(yīng)蛋白樣的圖案(adamts)解整合和金屬蛋白酶(s)(adams)/adam，組織蛋白酶和激肽釋放酶。本發(fā)明所述的用作aa中的cm的底物的氨基酸序列是本領(lǐng)域公知的，并在需要的時(shí)候，可以采用本發(fā)明所述方法進(jìn)行篩選，以識(shí)別適于用作cm的最優(yōu)序列。典型的底物可以包括但不限于可被表3中所列的酶裂解的底物。候選aa庫(kù)也暴露于靶點(diǎn)一個(gè)足夠的時(shí)間，并在一定條件下適用于靶點(diǎn)結(jié)合，其條件可以根據(jù)預(yù)期結(jié)合到ab的靶點(diǎn)條件進(jìn)行選擇。在暴露于靶點(diǎn)或與暴露靶點(diǎn)結(jié)合前，候選aa庫(kù)暴露于蛋白酶(例如，提供一個(gè)包括裂解aa的候選aas組)，通常是后者，以預(yù)期處于體內(nèi)最佳模式的蛋白酶和靶點(diǎn)能夠存在于在相同的環(huán)境條件下。蛋白酶和靶點(diǎn)暴露后，對(duì)庫(kù)進(jìn)行篩選，以選擇具有結(jié)合靶點(diǎn)成員，其中包括靶點(diǎn)-ab復(fù)合物中的候選aas。靶點(diǎn)結(jié)合的候選aas的檢測(cè)，可以有多種實(shí)現(xiàn)方式。例如，靶點(diǎn)可能是可檢測(cè)標(biāo)記，并且靶點(diǎn)結(jié)合候選aas第一組可以通過(guò)可檢測(cè)標(biāo)記檢測(cè)，以產(chǎn)生具有結(jié)合靶點(diǎn)的第二組(例如，用于靶點(diǎn)結(jié)合候選aas的正選擇)。(c)篩選在無(wú)蛋白酶裂解的情況下不結(jié)合靶點(diǎn)的候選aa在暴露于蛋白酶后，選擇用于靶點(diǎn)結(jié)合的候選aa組可以擴(kuò)增(例如，通過(guò)在適當(dāng)?shù)臈l件下在培養(yǎng)物中培養(yǎng)合適的介質(zhì))，并擴(kuò)展庫(kù)以進(jìn)行第二次篩選，以識(shí)別在沒(méi)有蛋白酶暴露的情況下表現(xiàn)出表現(xiàn)出下降或沒(méi)有檢測(cè)到結(jié)合到靶點(diǎn)成員。從第二次篩選產(chǎn)生的組將包括候選aa，未裂解時(shí)，不會(huì)明確結(jié)合到靶點(diǎn)，或可檢測(cè)水平。因此，這一步往往被認(rèn)為是負(fù)篩選步驟。從第一次篩選產(chǎn)生的組在沒(méi)有蛋白酶的情況下并在一定適于靶點(diǎn)結(jié)合的條件下與靶點(diǎn)接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，該條件可以根據(jù)希望靶點(diǎn)結(jié)合到ab的條件進(jìn)行選擇。進(jìn)行負(fù)篩選以識(shí)別與靶點(diǎn)結(jié)合相對(duì)下降的候選aas，包括那些表現(xiàn)出物可檢測(cè)靶點(diǎn)結(jié)合的候選aa。這可以通過(guò)選擇，例如，這種選擇可以通過(guò)使用一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)，并采用流式細(xì)胞儀分析靶點(diǎn)暴露組，以將其進(jìn)一步分為不同的次級(jí)組，其細(xì)胞顯示候選aa表現(xiàn)出不可檢出靶點(diǎn)結(jié)合和/或表現(xiàn)出相對(duì)較低的檢測(cè)信號(hào)。該次級(jí)組富集帶有在無(wú)裂解條件下表現(xiàn)出下降或檢測(cè)不到與靶點(diǎn)結(jié)合的候選aa的細(xì)胞。(d)可檢出標(biāo)記可交替使用的可檢出標(biāo)記和可檢出基團(tuán)是指能夠檢測(cè)的分子，包括但不僅限于，放射性同位素，熒光劑，化學(xué)發(fā)光劑，發(fā)色團(tuán)，酶制劑，酶底物，酶的輔助因子，酶抑制劑，發(fā)色團(tuán)，染料，金屬離子，金屬溶膠，配體(如生物素，抗生物素蛋白，鏈霉和素或半抗原)之類的。術(shù)語(yǔ)熒光劑是指一種能夠在可檢測(cè)范圍內(nèi)表現(xiàn)出熒光性的物質(zhì)或其中的一部分。典型適用于靶點(diǎn)標(biāo)記的可檢測(cè)基團(tuán)，包括親和標(biāo)記和熒光蛋白。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)親和標(biāo)記表示可以連接到一個(gè)使用結(jié)合親和標(biāo)記的分子可檢測(cè)的靶點(diǎn)的肽段，并提供一個(gè)可檢測(cè)信號(hào)(例如，一個(gè)熒光化合物或蛋白質(zhì))。本質(zhì)上，任何一種抗體或其他特定的結(jié)合劑的肽或蛋白質(zhì)都可以用作一個(gè)親和標(biāo)記。適用的典型親和標(biāo)記包括但不限于單核細(xì)胞的接頭蛋白結(jié)合肽，t7結(jié)合肽，一個(gè)鏈霉親和素結(jié)合肽，一個(gè)多聚組氨酸道，蛋白a(mona)(nilssonetal.,emboj.4:1075(1985)；nilssonetal.,methodsenzymol.198:3(1991)),谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(smithandjohnson,gene67:31(1988)),谷氨酸-谷氨酸的親和標(biāo)記(grussenmeyeretal.,proc.natl.acad.sci.usa82:7952(1985)),substancep,flagpeptide(hoppetal.,biotechnology6:1204(1988)),底物p,flag肽(hoppetal.,biotechnology6:1204(1988)),或其他抗原表位或結(jié)合域.一般，見(jiàn)fordetal.,proteinexpressionandpurification2:95(1991).dna分子編碼親和標(biāo)記可通過(guò)供應(yīng)商獲得(e.g.,pharmaciabiotech,piscataway,nj.).本領(lǐng)域眾所周知的任何熒光多肽(本發(fā)明也稱為熒光標(biāo)記)，適用于可檢測(cè)基團(tuán)或與本發(fā)明所述的肽顯示支架的親和標(biāo)記一起使用。一個(gè)合適的熒光多肽將是一個(gè)可以在所需的宿主細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，并會(huì)隨時(shí)提供一個(gè)可以定性評(píng)估(正/負(fù))和定量(比較熒光度)的檢測(cè)信號(hào)。典型熒光多肽包括但不限于，黃色熒光蛋白(yfp)，青色熒光蛋白(cfp)，綠色熒光蛋白，mrfp,rfp(tdimer2)，hcred等，或任何突變體(如，熒光蛋白被修飾用于增強(qiáng)熒光或移位發(fā)射光譜)，類似物，或其衍生物。另一適當(dāng)?shù)臒晒舛嚯模约氨景l(fā)明所列出具體的實(shí)施例，可用于在本領(lǐng)域，并是眾所周知的。生物素基標(biāo)記可用于本發(fā)明方法。目標(biāo)分子與底物的生物素是眾所周知的，例如，大量的生物素化劑是已知的，包括胺反應(yīng)和巰基反應(yīng)劑，蛋白質(zhì)，核酸，碳水化合物，羧酸的生物素；見(jiàn)，例如，分子探針目錄，第4章，格蘭，第6版，1996年，現(xiàn)納入?yún)⒖?。生物素?biāo)記的底物，可以通過(guò)結(jié)合一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記生物素結(jié)合受體進(jìn)行檢測(cè)，諸如抗生物素蛋白或鏈霉親和素。同樣，大量的haptenylation試劑也是眾所周知的。(e)篩選方法任何用于目標(biāo)aas的分離和回收的適當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎衫?。例如，一個(gè)顯示目標(biāo)aa的細(xì)胞可以通過(guò)流式細(xì)胞儀(facs)，免疫層析法分離，或其可檢測(cè)標(biāo)記是磁性的，則可以通過(guò)磁分離進(jìn)行分離。作為一個(gè)分離的結(jié)果，所富集的細(xì)胞群表現(xiàn)出預(yù)期的特征，例如，在裂解后或在沒(méi)有裂解情況下已減少或無(wú)法檢測(cè)到靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出的靶點(diǎn)結(jié)合。例如，已經(jīng)結(jié)合可檢測(cè)靶點(diǎn)的候選aa的選擇可以通過(guò)使用各種本領(lǐng)域公知技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，流式細(xì)胞儀(例如，)方法可以用來(lái)將來(lái)自未標(biāo)記的候選aas的可檢測(cè)標(biāo)記的候選aas進(jìn)行排序。流式細(xì)胞儀方法可以操作用于在分離候選(aas)群時(shí)的或多或少嚴(yán)格要求，通過(guò)修改開(kāi)口，以便用于調(diào)光器或需要明亮的細(xì)胞群，以進(jìn)一步篩選分離第二組。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫親和色譜，可用于從未結(jié)合靶點(diǎn)分離靶點(diǎn)結(jié)合候選aas。例如，一種已結(jié)合了反-靶點(diǎn)抗體的支撐物(例如，柱子，磁珠)可與暴露于蛋白酶和靶點(diǎn)的候選aas接觸。候選aa已經(jīng)結(jié)合到反-靶點(diǎn)抗體，從而有利于從候選人缺乏約束目標(biāo)的氨基酸的分離。篩選步驟用于富集具有相對(duì)下降的靶點(diǎn)結(jié)合或沒(méi)有檢測(cè)到的靶點(diǎn)結(jié)合的未裂解候選aa富集群(例如，相對(duì)于其他候選aa)，目標(biāo)亞群是那些缺乏或具有相對(duì)下降的結(jié)合靶點(diǎn)的可檢測(cè)信號(hào)。例如，將免疫親和技術(shù)用于結(jié)合靶點(diǎn)的負(fù)選擇，目標(biāo)亞群未結(jié)合通過(guò)反-靶點(diǎn)支持物的。(f)雙重靶向結(jié)合aa的篩選本發(fā)明所公開(kāi)的篩選方法，可隨時(shí)調(diào)整，以識(shí)別具有兩個(gè)ab雙重靶點(diǎn)結(jié)合aa。在一般情況下，該方法包括包含多個(gè)候選aa的庫(kù)，其中所述多個(gè)中每個(gè)成員，多個(gè)包括第一ab，第二ab，第一個(gè)cm和/或第二個(gè)cm，第一個(gè)mm，和/或第二個(gè)mm。該庫(kù)與能夠結(jié)合至少第一ab和能夠裂解第一cm的裂解劑(例如，用于cm的蛋白酶)的靶點(diǎn)接觸。對(duì)這樣選定的群體進(jìn)行負(fù)篩選，在沒(méi)有裂解劑存在條件下，結(jié)合到所屬靶點(diǎn)的亞群成員可以進(jìn)行核定。然后通過(guò)消耗在沒(méi)有裂解劑的情況下結(jié)合到所述靶點(diǎn)的亞群成員產(chǎn)生第二群體成員選定的成員。這可以通過(guò)，例如，對(duì)于遠(yuǎn)離結(jié)合到靶點(diǎn)的未結(jié)合靶點(diǎn)成員進(jìn)行分類，這可通過(guò)可檢測(cè)標(biāo)記靶點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。因此，這種方法用于候選aa的選擇，其與有裂解劑存在時(shí)對(duì)所述靶點(diǎn)的結(jié)合相比，在沒(méi)有裂解劑存在的情況下表現(xiàn)出下降與靶點(diǎn)結(jié)合減弱。這種方法可以重復(fù)這兩個(gè)靶點(diǎn)。篩選方法的典型變化以選擇候選aa上述方法可能會(huì)被修改以選擇表現(xiàn)出所需特性的群和庫(kù)的成員。(a)mm掩蔽效率的確定mms的掩蔽效率至少由兩個(gè)參數(shù)確定：mm對(duì)抗體或其片段的親和力，以及mm相對(duì)于ab與其靶點(diǎn)結(jié)合界面的空間關(guān)系。關(guān)于親和力，通過(guò)舉例的方式，mm可能有很高的親和力，但只可以在一定程度上抑制對(duì)ab的結(jié)合位點(diǎn)，而另一個(gè)mm，可能具有對(duì)ab較低的親和力，但完全抑制靶點(diǎn)結(jié)合。短時(shí)間內(nèi)，較低親和力的mm可能會(huì)表現(xiàn)出足夠的掩蔽；相反，隨著時(shí)間的推移，同樣的mm可能會(huì)被靶點(diǎn)取代(由于對(duì)ab沒(méi)有足夠的親和力)。兩個(gè)具有相同的親和力的mms以類似的方式，基于它們?cè)鰪?qiáng)抑制ab上結(jié)合位點(diǎn)以及防止ab與靶點(diǎn)結(jié)合的強(qiáng)度，可能會(huì)他們出現(xiàn)不同程度的掩蔽。在另一個(gè)實(shí)施例中，具有高親和力的mm可結(jié)合和改變結(jié)構(gòu)的ab，以使結(jié)合到其靶點(diǎn)被完全抑制，而另一種具有高親和力的mm可能只是部分抑制結(jié)合。因此，發(fā)現(xiàn)一種有效的mm不能只依賴親和力，但可以包括一個(gè)掩蔽效率的實(shí)證措施。位于aa的mm的時(shí)間依賴性靶點(diǎn)置換可以被測(cè)量，以優(yōu)化和選擇mm。為此，本發(fā)明提供了一種新的靶點(diǎn)置換試驗(yàn)(tda)。可用于發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證有效掩蔽的aa的tda法包括的掩蔽效率的實(shí)證檢測(cè)，將靶點(diǎn)存在條件下掩蔽ab與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，與靶點(diǎn)存在條件下未掩蔽的和/或親代ab與靶點(diǎn)結(jié)合的能力進(jìn)行比較。結(jié)合效率可表示為平衡結(jié)合的a％，未掩蔽的和/或親代ab結(jié)合比較。當(dāng)ab用mm修飾后，并在靶點(diǎn)存在下，與ab特異性結(jié)合未用mm或親代ab修飾的靶點(diǎn)相比，ab特異性結(jié)合到其靶點(diǎn)會(huì)減少或被抑制。當(dāng)與ab結(jié)合未用mm或親代ab修飾的靶點(diǎn)相比，用mm修飾后ab結(jié)合靶點(diǎn)的能力，可以減少至少50％，60％，70％，80％，90％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，甚至達(dá)到100％，至少2，4，6，8，12，28，24，30，36，48，60，72，84，96小時(shí)，或5，10，15，30，45，60，90，120，150，180天，或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12個(gè)月或更大，在體內(nèi)或在體外免疫吸附法檢測(cè)的靶點(diǎn)置換，如本發(fā)明所述。(b)識(shí)別和/或優(yōu)化aa基元的迭代篩選本發(fā)明所述的方法和候選aa庫(kù)可以很容易地適用于識(shí)別和/或優(yōu)化aa的一個(gè)或多個(gè)基元。例如，隨任何一個(gè)或更多個(gè)ab變化的候選aas，cm，連接器，等等，可以產(chǎn)生，并使用本發(fā)明所述的篩選方法。(c)還原劑激活的aa雖然述方法描述了用于識(shí)別aa的篩查方法，但是應(yīng)該了解，aa或候選aa，其cm可以易于在aa中形成半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵，也可以采用本發(fā)明所述篩選方法。這些aa可以進(jìn)一步包括或可以不包括cm(可以是相同或不同的cm)，而cm可以包括或可以不包括蛋白酶底物。在這些實(shí)施例中，上述正篩選可以通過(guò)aa或候選aa暴露于能夠裂解aa中半胱氨酸的-半胱氨酸對(duì)的二硫鍵的還原劑(如還原條件下)進(jìn)行。負(fù)篩選，然后可以在無(wú)還原條件下進(jìn)行。因此，由此產(chǎn)生一種具有可以富集aas的庫(kù)，可以通過(guò)暴露于還原條件下的二硫鍵激活。(d)光激活aa雖然上面描述了用于識(shí)別氨基酸的篩選方法，但是了解，具有cm的aa或候選aa是光敏性的，并且可以光解激活。在這些實(shí)施例中，上述正篩選可以將aa或候選aa暴露在光源進(jìn)行。然后負(fù)篩選可以在沒(méi)有光的情況下進(jìn)行。由此產(chǎn)生一種具有可以富集aas的庫(kù)，可以通過(guò)暴露光源激活。(e)篩除aa的周期和支架數(shù)通過(guò)增加上述方法周期數(shù)，表現(xiàn)出更好的開(kāi)關(guān)特性群體和庫(kù)成員可以被識(shí)別。任意數(shù)目的篩選周期可以實(shí)現(xiàn)。此外，個(gè)別候選aas克隆可以被隔離篩選，以確定候選aa的動(dòng)態(tài)范圍。候選aa也可以測(cè)試用于將所需的切換表型從支架分開(kāi)，換言之，候選aa可以被表達(dá)，抑或是與顯示支架分開(kāi)產(chǎn)生，并且候選aa的切換表型在支架存在下評(píng)估，在需要的地方，在無(wú)細(xì)胞體系(例如，使用溶解aa)中。(f)aa組成與轉(zhuǎn)換活性的優(yōu)化上述方法可以改進(jìn)，以優(yōu)化aa性能，例如，以本發(fā)明所述的篩選方法確定為aa。例如，需要優(yōu)化掩蔽基團(tuán)性能，如，為更好地抑制靶點(diǎn)在未裂解狀態(tài)與ab結(jié)合，ab和cm的氨基酸序列可固定在候選aa庫(kù)，和mm不同，庫(kù)成員變量與mm彼此互為變量。mm可以各種方式優(yōu)化，包括在改變構(gòu)成mm的氨基酸的數(shù)量或類型。例如，多個(gè)候選aa的每個(gè)成員可能包括候選mm，其中候選mm包括至少一個(gè)半胱氨酸的氨基酸殘基，其余的氨基酸殘基在多個(gè)成員之間變化。在又一實(shí)施例中，多個(gè)候選aa的每個(gè)成員可能包括候選mm，其中候選mm包括一個(gè)半胱氨酸的氨基酸殘基，和氨基酸殘基的一個(gè)隨機(jī)序列，例如，5個(gè)氨基酸的一個(gè)隨機(jī)序列。(g)擴(kuò)展動(dòng)態(tài)范圍的選擇如上所述，對(duì)于處于無(wú)掩蔽/裂解與掩蔽/無(wú)裂解狀態(tài)靶點(diǎn)結(jié)合，具有所需的動(dòng)態(tài)范圍的aas也是目標(biāo)。這些aas是這些，例如，在處于主體的治療和非治療位點(diǎn)生理水平的靶點(diǎn)存在下沒(méi)有可檢測(cè)結(jié)合，但是，一旦被蛋白酶裂解，就表現(xiàn)出結(jié)合靶點(diǎn)較高的親和性和/或高親和力。aa的動(dòng)態(tài)范圍越大，aa切換表型越好。因此氨基酸可以優(yōu)化選擇以擴(kuò)展在有和無(wú)裂解劑存在下，靶點(diǎn)結(jié)合的動(dòng)態(tài)范圍。本發(fā)明所述篩選方法可以修改以提高具有所需的和/或優(yōu)化的動(dòng)態(tài)范圍的aas的選擇。在一般情況下，可以通過(guò)改變本方法的正選擇和負(fù)選擇步驟中靶點(diǎn)濃度實(shí)現(xiàn)，由此與未裂解aa的靶點(diǎn)結(jié)合篩選相比，采用較低的靶點(diǎn)濃度，暴露于蛋白酶的aa靶點(diǎn)結(jié)合篩選就可以進(jìn)行(即，篩選群體包括裂解aa)。因此，靶點(diǎn)濃度在步驟之間變化，以便提供一個(gè)趨向于切換表型的選擇壓力。如有需要，用于正和負(fù)選擇步驟中靶點(diǎn)濃度差可以隨著周期次數(shù)的增加而增加。正和負(fù)選擇步驟中使用較低的靶點(diǎn)濃度，可以用于促進(jìn)在裂解狀態(tài)已經(jīng)改進(jìn)了靶點(diǎn)結(jié)合的aa成員的選擇。例如，涉及蛋白酶暴露aas的篩選可以在比ab-靶點(diǎn)相互作用的kd降低約2～100倍，降低約2～50倍，降低約2～20倍，降低約2～10倍，降低約2～5倍的靶點(diǎn)濃度下進(jìn)行。因此，選擇靶點(diǎn)結(jié)合aa的群體后，選定的群體將富集與群體中的其他aa相比表現(xiàn)出較高的親和性和/或親和力的aa。在負(fù)選擇步驟中使用相對(duì)較高的靶點(diǎn)濃度，可以用于促進(jìn)未裂解狀態(tài)時(shí)減少或無(wú)可檢測(cè)靶點(diǎn)結(jié)合的aa成員的選擇。例如，涉及尚未暴露于蛋白酶(負(fù)選擇步驟)的aa的篩選可以在比ab-靶點(diǎn)相互作用的kd高約2～100倍，高約2～50倍，高約2～20倍，高約2～10倍，高約2～5倍的靶點(diǎn)濃度下進(jìn)行。因此，選擇不可檢測(cè)的靶點(diǎn)結(jié)合aa的群體后，選定的群體將富集與群體中的其他未裂解aa相比表現(xiàn)出在未裂解狀態(tài)較低的親和性和/或親和力的aa。換句話說(shuō)，不可檢測(cè)的結(jié)合靶點(diǎn)的aas群選擇后，選定的群體將富集其靶點(diǎn)結(jié)合ab受到抑制的aa，例如，將靶點(diǎn)結(jié)合的ab掩蔽。aa是雙重靶點(diǎn)結(jié)合aa，上述篩查方法可適于提供具有能夠結(jié)合ab的第一個(gè)靶點(diǎn)，以及能夠結(jié)合ab的第二個(gè)靶點(diǎn)所需動(dòng)態(tài)范圍的aa。結(jié)合到定位于從出現(xiàn)在顯示支架上的aa裂解的部分aa的ab的靶點(diǎn)，可以檢測(cè)溶液(例如，在底物中)中靶點(diǎn)-ab復(fù)合物的形成進(jìn)行評(píng)價(jià)，例如，免疫層析色譜捕反aa片段抗體的裂解片段，然后檢測(cè)柱中捕獲的結(jié)合的，不可檢測(cè)標(biāo)記的靶點(diǎn)。(h)可溶性aa的測(cè)試候選aa，可以在溶解狀態(tài)測(cè)試其保持一個(gè)可切換表型的能力。其中一種方法涉及到固定靶點(diǎn)用以支持(例如，數(shù)組，例如，biacoretmcm5傳感芯片表面)。目標(biāo)靶點(diǎn)的固定可以使用任何合適的技術(shù)(例如，標(biāo)準(zhǔn)胺耦合)進(jìn)行。支架表面可以封閉，以減少非特異性結(jié)合?？蛇x擇性地，該方法可以包括空白樣的使用(例如，支架不包含固定的靶點(diǎn)(例如，評(píng)價(jià)結(jié)合支架的背景)和/或含有一種用作陰性對(duì)照的化合物(例如，評(píng)價(jià)候選aa特異性結(jié)合到靶點(diǎn)與非靶點(diǎn))。靶點(diǎn)通過(guò)共價(jià)鍵固定后，候選aa在適合允許特異性結(jié)合到固定靶點(diǎn)的條件下與支架相連。候選aa可在合適的裂解劑存在與否條件下與支架固定靶點(diǎn)相連，以評(píng)估切換表型。與無(wú)裂解劑存在相比，或者是，與陰性對(duì)照相比，在有裂解劑存在條件下，評(píng)價(jià)結(jié)合候選aa提供了一個(gè)結(jié)合的反應(yīng)，這反過(guò)來(lái)又指示了切換表型。(i)用于候選aa的個(gè)別基團(tuán)的篩選可能需要對(duì)一個(gè)或多個(gè)候選aa的基團(tuán)分別進(jìn)行篩選，例如，在測(cè)試切換表型的候選aa前的ab、mm或cm。例如，可以利用鑒定由特定的蛋白酶裂解肽底物的已知的方法，以確定cms用于這種蛋白酶激活設(shè)計(jì)中的aa。此外，多種方法可用于確定結(jié)合到目標(biāo)靶點(diǎn)的多肽序列。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明所采用的這些方法可用于識(shí)別abs結(jié)合到一個(gè)特定的靶點(diǎn)或確定結(jié)合到一個(gè)特定的ab的一個(gè)mm。上述方法包括，例如，方法中候選aa的一個(gè)基團(tuán)，例如，一個(gè)ab，mm或cm的基團(tuán)，使用復(fù)制的生物實(shí)體顯示。(j)自動(dòng)篩選方法本發(fā)明所述實(shí)施例中的某些篩查方法，均為可用于切換活動(dòng)所需aa庫(kù)的自動(dòng)化，提供方便，實(shí)時(shí)性，高容量的篩選方法。自動(dòng)化的方法，可以設(shè)計(jì)提供正和負(fù)選擇迭代進(jìn)行，選定的群體被分開(kāi)，并自動(dòng)到下一個(gè)所需周期數(shù)篩選。評(píng)估群體中的候選aas的可以隨著時(shí)間的推移反復(fù)進(jìn)行，正選擇步驟完成后，跟著負(fù)選擇步驟，或是兩者同時(shí)。此外，對(duì)于處于正和負(fù)選擇步驟中選定的靶點(diǎn)濃度的候選aa群的平均動(dòng)態(tài)范圍的信息，可以進(jìn)行監(jiān)控和存儲(chǔ)以供日后分析，如用以評(píng)價(jià)不同的靶點(diǎn)濃度的選擇性壓力的效果。在一些實(shí)施例中，一個(gè)可執(zhí)行文件平臺(tái)，如計(jì)算機(jī)軟件產(chǎn)品可以控制的檢測(cè)和/或測(cè)量手段的操作，可以執(zhí)行與上述步驟相關(guān)的數(shù)值運(yùn)算，并生成所需的輸出(例如，流式細(xì)胞儀分析等。)。計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括具有計(jì)算機(jī)可讀的程序代碼的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，是指在介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)。適用于自動(dòng)化設(shè)備的硬件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的，并可以包括計(jì)算機(jī)控制器，自動(dòng)化樣品處理，熒光測(cè)量工具，打印機(jī)和光學(xué)顯示。測(cè)量工具可以包含一個(gè)或多個(gè)用于測(cè)量來(lái)自其具有熒光可檢測(cè)分子的樣品的熒光信號(hào)的光探測(cè)器。測(cè)量工具還可以包含一個(gè)計(jì)算機(jī)控制的步進(jìn)電機(jī)，使每個(gè)對(duì)照和/或測(cè)試樣品可以被排成樣品陣列，并在測(cè)量熒光強(qiáng)度的步驟中自動(dòng)重復(fù)定位在對(duì)面的光電探測(cè)器。測(cè)量工具(例如，流式細(xì)胞儀)，可以可操作的加上一般用途或特定應(yīng)用的計(jì)算機(jī)控制器。該控制器可以包括產(chǎn)生計(jì)算機(jī)程序，以控制測(cè)量工具的操作和執(zhí)行有關(guān)上述步驟的數(shù)值運(yùn)算。該控制器可以接受通過(guò)一個(gè)文件、磁盤(pán)輸入或數(shù)據(jù)總線設(shè)置和其他相關(guān)數(shù)據(jù)。顯示和打印機(jī)也可以直觀地顯示控制器所執(zhí)行的操作。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，通過(guò)控制器所執(zhí)行的功能作為一種通用的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上運(yùn)行的軟件模塊，可全部或部分實(shí)現(xiàn)。此外，可采用一個(gè)執(zhí)行上述功能和操作的具有專用集成電路的專門(mén)的獨(dú)立系統(tǒng)。在治療中使用aa的方法aa可以被納入藥品組合物成分，例如，治療有效量的目標(biāo)aa，而載體是藥學(xué)上可接受的賦形劑(也稱為藥學(xué)上可接受的載體)。藥學(xué)上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域眾所周知的，一般都根據(jù)給藥途徑進(jìn)行選擇，治療條件，以及其他一些變量都是本領(lǐng)域公知的。藥學(xué)上可接受的賦形劑在各種出版物都得到了充分的描述，其中包括，例如，a.gennaro(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy,20thedition,lippincott,williams,&wilkins；pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(1999)h.c.anseletal.,eds.,7thed.,lippincott,williams,&wilkins；andhandbookofpharmaceuticalexcipients(2000)a.h.kibbeetal.,eds.,3rded.amer.pharmaceuticalassoc。藥物組合物，還可以包括其他成分如ph值調(diào)節(jié)和緩沖劑，強(qiáng)壯調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑，潤(rùn)濕劑等等。在一些實(shí)施例中，納米粒子或脂質(zhì)體裝載藥物組成，包括aa。aa的藥物組合物的恰當(dāng)?shù)陌被岢煞?，可以通過(guò)已用于aa的ab的藥物組合引導(dǎo)。例如，其中，aa包括egfr,tnfα,cdlia,csfr,ctla-4,epcam,vegf,cd40,cd20,notch1,notch2,notch3,notch4,jagged1,jagged2,cd52,mucl,igflr,鐵傳遞蛋白,gpl30,vcam-1,cd44,dll4,oril4的抗體，例如，如aas，可根據(jù)適用于抗體的藥物復(fù)配方法和組成形成藥劑配方。一般情況下，通過(guò)將均有所需純度的aa可選擇性的與處于凍干制劑或水溶液的形式的生理上可接受的載體、輔料或穩(wěn)定劑混合以形成一個(gè)或多個(gè)aa的藥劑配方用于存儲(chǔ)(remington'spharmaceuticalsciences16thedition,osol,a.ed.(1980))?？山邮艿妮d體，輔料，或穩(wěn)定劑在所服用劑量和濃度條件下對(duì)受體無(wú)毒，包括緩沖溶液，如磷酸鹽，檸檬酸等有機(jī)酸，抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(如氯化銨十八烷基二甲基苯甲基；六烴季銨氯化物；苯扎氯銨，benzethonium氯苯酚，丁基苯甲醇烷基苯甲酸酯類，如甲基或丙基苯甲酸酯，鄰苯二酚，間苯二酚；環(huán)己醇，3-戊醇；間甲酚)；低分子量(約少于10個(gè)殘基)的多肽，蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天門(mén)冬酰胺，組氨酸，精氨酸或賴氨酸，單糖，雙糖，包括葡萄糖，甘露糖，糊精或其他碳水化合物，包括蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇糖；螯合劑如edta；成鹽的抗衡離子如鈉；金屬配合物(例如，鋅蛋白復(fù)合物)，和/或非離子型表面活性劑如tweentm,pluronicstm或聚乙二醇(peg)。用于體內(nèi)給藥的配方必須是無(wú)菌的。通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾，這是很容易實(shí)現(xiàn)。藥劑配方，還可能包含不止一個(gè)必要的活性化合物，特別是正在接受治療，附加的活性化合物通常是那些與aa活動(dòng)互補(bǔ)的。這類化合物經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)慕M合，對(duì)預(yù)期的目標(biāo)很有效。藥劑配方，可提供多種劑型，如一個(gè)全身或局部注射制劑。這些成分可以裝載于一種載體，如微膠囊，例如，如采用界面聚合通過(guò)凝聚技術(shù)制備，例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微膠囊，分別用于膠體給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球，微乳，納米粒子和納米膠囊)，或用于濃乳劑。這種技術(shù)是在雷明頓的醫(yī)藥科學(xué)第16版中有描述，osol,a.ed.(1980)。緩釋制劑也在aa含配方的范圍內(nèi)。典型緩釋制劑可以包括含有aa的堅(jiān)實(shí)的疏水性聚合物半透基質(zhì)，基質(zhì)可以具有的形態(tài)，膜，或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實(shí)施例包括聚酯，凝膠(例如，聚(2-羥乙基丙烯酸甲酯)，或聚乙烯醇)，聚乳酸(美國(guó)專利號(hào)3773919)，l-谷氨酸共聚物和γ-乙基l-谷氨酸，不可降解的乙烯-醋酸乙烯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如luprondepottm(乳酸-乙醇酸聚合物和亮丙瑞林醋酸組成的注射微球)，以及聚d-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯-醋酸乙烯，乳酸-乙醇酸能釋放分子超過(guò)100天，某些凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)封裝的aa在體內(nèi)停留很長(zhǎng)一段時(shí)間，在生理溫度條件下，他們可能會(huì)變性或聚集并暴露在潮濕環(huán)境中，造成生物活性降低，及免疫原性的可能性變化?；趶?fù)雜的機(jī)理可以制定出合理穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是由于通過(guò)硫代二硫化的相互轉(zhuǎn)化在分子間構(gòu)成不良ss鍵形成，則可通過(guò)修改巰基殘基，酸性溶液凍干，控制水分含量，使用適當(dāng)?shù)奶砑觿约爸贫ㄌ囟ǖ木酆衔锘|(zhì)組合物進(jìn)行穩(wěn)定化。aa可與載體軛合以實(shí)現(xiàn)活性劑的靶向輸送達(dá)到治療目的。例如，aa與將藥物封裝其中或與其相結(jié)合的納米粒子或脂質(zhì)體軛合。以這種方式，可以實(shí)現(xiàn)藥物特定的，靶向給藥。連接多肽脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，這種方法可用于將aa鏈接到脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體及其封裝藥物的靶向或選擇性傳遞。例如，多肽可以以硫醚鍵的形式通過(guò)共價(jià)鍵連接到脂質(zhì)體。聚乙二醇化的明膠納米粒子和聚乙二醇化脂質(zhì)體也被用作多肽附件的支架，例如，單鏈抗體。見(jiàn)，例如,immordinoetal.(2006)intjnanomedicine.september；1(3):297-315,，其所公開(kāi)的將多肽，例如，抗體片段，共軛連接到脂質(zhì)體的方法作為參考文獻(xiàn)列于此。(a)治療方法本發(fā)明所述aa可以根據(jù)適于aa的cm–ab結(jié)合，選擇用于合適主體的治療方法。aa可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆绞浇o藥，包括口服，注射，皮下，腹腔，肺內(nèi)，以及經(jīng)鼻，并且，如果需要，可局部注射(例如，在實(shí)體瘤的部位)。腸外給藥途徑包括肌肉注射，靜脈，動(dòng)脈，腹腔或皮下給藥。長(zhǎng)期治療位點(diǎn)或病變位點(diǎn)，根據(jù)本發(fā)明所述是指，aa被設(shè)計(jì)成可切換的位點(diǎn)，例如，在一個(gè)位點(diǎn)，靶點(diǎn)用于其中aa的一個(gè)或兩個(gè)abs和一個(gè)能夠裂解aa中cm的裂解劑共存，其示意圖見(jiàn)圖2。治療位點(diǎn)包括可以局部給藥的通道(如注射，輸液(例如，通過(guò)導(dǎo)管)等)或全身給藥(例如，從遠(yuǎn)離治療位點(diǎn)的位點(diǎn)遠(yuǎn)程給藥)。治療位點(diǎn)，包括那些相對(duì)生物性封閉的位點(diǎn)(例如，器官，液囊，腫瘤部位，等)。適當(dāng)?shù)膭┝康腶a將取決于需要治療的疾病的類型，疾病的嚴(yán)重程度和病程，患者的臨床病史以及對(duì)aa的反應(yīng)，和主治醫(yī)生的自由裁量權(quán)。aa可通過(guò)一次性或一系列的治療適當(dāng)?shù)慕o藥于患者。aa可與其他治療方法，其他藥劑等一起施用。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，aa對(duì)于患者的初次給藥劑量大約為1微克/千克～15毫克/公斤(例如，0.1～20毫克/公斤)，例如，不管是一次性還是分多次給藥，或連續(xù)滴注。一個(gè)典型的每日劑量范圍可以從約1微克/公斤～100毫克/公斤或更多，取決于本發(fā)明所述的那些因素。對(duì)于超過(guò)數(shù)天或更長(zhǎng)的時(shí)間重復(fù)給藥，取決于病癥，持續(xù)治療，直到達(dá)到對(duì)疾病癥狀所需的抑制。然而，也可使用其他給藥方案。aa配方，劑量，給藥方式應(yīng)很好的與治療實(shí)踐相一致。在這方面考慮的因素包括正在接受治療特定疾病，特別是正在接受治療的哺乳動(dòng)物，個(gè)別患者的臨床癥狀，病患的原因，aa的專遞位點(diǎn)，給藥方式，給藥日程安排，以及執(zhí)業(yè)醫(yī)生所知道的其他因素。aa給藥的治療有效量將通過(guò)這樣的考慮，以及防止，減輕或治療疾病或病患所需的最低劑量。一般情況下，減輕或治療的疾病或病患涉及一個(gè)或多個(gè)癥狀，或與疾病或病患相關(guān)的醫(yī)療問(wèn)題。例如，對(duì)于癌癥，藥物治療有效量可以通過(guò)一個(gè)或以下的組合實(shí)現(xiàn)：減少癌細(xì)胞數(shù)量；減少腫瘤的大??；抑制(即，在一定程度減少上和/或停止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散到周邊器官；抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，在一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)和/或減輕在一定程度上的一個(gè)或多個(gè)與癌癥相關(guān)的癥狀。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合，可用于防止在一個(gè)主體或哺乳動(dòng)物的疾病或病患的發(fā)生或再次發(fā)生。aa可與一個(gè)或更多的治療藥物或治療方法結(jié)合使用(聯(lián)合治療)(例如，以相同的配方或不同的配方)。aa可與其他治療劑中混合給藥或可以以一個(gè)單獨(dú)的配方給藥。治療藥物和/或治療方法可以與aa共同進(jìn)行，并根據(jù)要治療的病癥選擇，包括手術(shù)，放射治療(如手術(shù)切除癌組織)，骨髓移植，化療治療，上述某些組合，等等。(a)疾病組織與正常組織中aa的使用本發(fā)明中的氨基酸，當(dāng)正常組織共存時(shí)，顯示極少或沒(méi)有激活，而ab仍然處于“掩蔽”狀態(tài)，抑或是以其他方式顯示極少或沒(méi)有結(jié)合到靶點(diǎn)。然而，在病變組織中，在一個(gè)特定疾病蛋白酶存在條件下，例如，能夠裂解aa的cm，ab成為“非掩蔽”，或者可以特異性結(jié)合到靶點(diǎn)。正常組織，是指產(chǎn)生很少或沒(méi)有疾病特定的劑，能夠?qū)ｉT(mén)裂解或以其他方式修改aa的cm的組織，例如，一個(gè)疾病特定的蛋白酶，一種疾病特定的酶，或一種疾病特定的還原劑。病變的組織是指一種可產(chǎn)生一種疾病特定的劑，專門(mén)切割或以其他方式修改aa的cm，例如，一種疾病特定的蛋白酶，一種疾病特定的酶，或一種特定疾病的還原劑。(b)aa以一種疾病不同的劑量給藥于病變組織在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述的aa耦合到多個(gè)cm。這樣一個(gè)aa可以在一種疾病的不同階段被激活，或在病變組織不同的區(qū)間內(nèi)被激活。例如，連接到mmp–9可裂解cm和組織蛋白酶d可裂解cm的一個(gè)ab可以被激活，在腫瘤早期，后期以及腫瘤惡化階段被激活。在腫瘤早期階段，aa未掩蔽，cm可以被mmp–9裂解。在中晚期腫瘤階段，aa未掩蔽，cm可以被晚期腫瘤消亡中心不規(guī)則的組織蛋白酶d裂解。在另一個(gè)典型實(shí)施例中，連接到一個(gè)mm，一個(gè)mmp–9可激活的cm，和一個(gè)蛋白酶可激活的cm上的ab可以在腫瘤早期和晚期被激活。在另一個(gè)處于血管生成(早期腫瘤)活性位點(diǎn)的纖溶酶可以裂解病變組織中的一個(gè)纖溶酶可裂解cm和豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶(legumain)，其巨噬細(xì)胞擴(kuò)散可以裂解中晚期腫瘤豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶的一個(gè)特定的cm。(c)aa用于抗血管增生治療在一個(gè)典型的實(shí)施例中，aa包含結(jié)合到血管再生術(shù)受體的ab，如egfr,tnfα,cdlia,csfr,ctla-4,epcam,vegf,cd40,cd20,notch1,notch2,notch3,notch4,jagged1,jagged2,cd52,mucl,igflr,鐵傳遞蛋白,gpl30,vcam-i,cd44,dll4,oril4，aa需要用于抑制血管生成病癥的治療，特別是病癥中的vegf抑制是目標(biāo)。結(jié)合到aa的vegf可以包括雙重靶點(diǎn)結(jié)合的帶有結(jié)合到vegf的ab，以及結(jié)合到第二個(gè)生長(zhǎng)因子的ab的aa，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如，fgf-2)，抑制fgf活性。這種結(jié)合到aa的雙重靶點(diǎn)，因此可以被設(shè)計(jì)用于抑制被共同存在于異常血管生成位點(diǎn)的裂解劑(如酶，諸如mmp或其他酶，如表3中所示的一個(gè))激活兩個(gè)血管生成促進(jìn)因素。抑制血管生成的aa用于治療主體(如人類)的實(shí)體腫瘤，特別是那些有一個(gè)相關(guān)的血管床供給腫瘤的，抑制血管生成可以用于抑制腫瘤的生長(zhǎng)。以抗vegf為基礎(chǔ)的抗血管生成氨基酸，用于其他有一個(gè)或多個(gè)異常血管生成的病癥，通過(guò)抑制異常血管生成進(jìn)行治療。一般情況下，當(dāng)新的血管生長(zhǎng)過(guò)度，不足或不恰當(dāng)?shù)?，出現(xiàn)疾病狀態(tài)或，它會(huì)導(dǎo)致疾病狀態(tài)(例如，從醫(yī)療的角度來(lái)看不受歡迎的血管生成的位置，時(shí)間或發(fā)病)發(fā)生異常血管生成。過(guò)量，不當(dāng)或失控的血管生成發(fā)生時(shí)，有新的血管生長(zhǎng)，會(huì)促使疾病狀態(tài)惡化或?qū)е录膊顟B(tài)，例如癌癥，特別是血管化實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤(包括結(jié)腸癌，肺癌(尤其是小細(xì)胞肺癌)，或前列腺癌)，造成眼部新生血管，尤其是糖尿病患者失明，視網(wǎng)膜病變，主要是糖尿病性視網(wǎng)膜病變或年齡引起的黃斑變性和虹膜疾??；牛皮癬，銀屑病，如血管母細(xì)胞瘤血管瘤，關(guān)節(jié)炎；炎癥性腎臟疾病，如腎小球腎炎，尤其是系膜增生性腎小球腎炎，溶血尿毒綜合癥，糖尿病腎病或高血壓性腎硬化；各種炎癥性疾病，如關(guān)節(jié)炎，尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，炎性腸病，牛皮癬，結(jié)節(jié)病，動(dòng)脈硬化動(dòng)脈移植手術(shù)，子宮內(nèi)膜異位癥或慢性哮喘和其他病癥，將容易本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員確認(rèn)。新生血管供給病變組織，破壞正常組織，并在癌癥的情況下，新的血管只可以使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)和駐留于其他器官(腫瘤轉(zhuǎn)移)?；赼a的抗血管生成治療還可以用于治療移植排異反應(yīng)，肺部炎癥，腎病綜合征，先兆子癇，心包積液，諸如心包炎關(guān)聯(lián)，胸腔積液，疾病和以不良的血管通透性為特點(diǎn)的病變，如，與腦腫瘤相關(guān)的水腫，與惡性腫瘤相關(guān)的腹水，梅格斯綜合征，肺部炎癥，腎病綜合癥，心包積液，胸腔積液，與心肌梗死、中風(fēng)和心血管疾病等病情相關(guān)的滲透性。如本發(fā)明所述，其他血管生成依賴性疾病，可以使用抗血管生成的aa治療，包括纖維血管瘤(異常的血液血管，很容易出血)，新生血管性青光眼(在眼部血管的生長(zhǎng))，動(dòng)靜脈畸形(動(dòng)脈和靜脈之間的異常通信)，不愈合骨折(骨折不愈合)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(血管硬化)，化膿性肉芽腫(常見(jiàn)的皮膚病灶的血管組成)，硬皮病(一種結(jié)締組織病)，血管瘤(腫瘤組成血管)，沙眼(失明的主要原因，在第三世界)，血友病關(guān)節(jié)，血管粘連和增生性瘢痕(瘢痕形成異常)。aa的治療有效給藥劑量根據(jù)上面討論的多個(gè)因素而變化。在一般情況下，在癌癥治療的背景下，治療有效量的aa，是血管生成的有效抑制劑量，從而有利于減少，例如，當(dāng)與一個(gè)合適的對(duì)照樣相比，主體的腫瘤負(fù)荷，動(dòng)脈粥樣硬化降低，至少約5％，至少約10％，至少約20％，至少約25％，至少約50％，至少約75％，至少約85％，或至少約90％，直到徹底根除腫瘤。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，一個(gè)合適的對(duì)照樣，可能是基因相同的動(dòng)物，不用藥劑治療。在非實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，一個(gè)合適對(duì)照樣，可以是會(huì)在藥劑給藥之前的腫瘤負(fù)荷。其他適當(dāng)?shù)膶?duì)照樣，可以是安慰劑對(duì)照。腫塊負(fù)荷是否已經(jīng)下降可以使用任何已知的方法檢測(cè)，包括但不限于測(cè)量固體腫塊體；使用細(xì)胞檢測(cè)法對(duì)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量計(jì)數(shù)；采用熒光激活細(xì)胞分選(例如，使用一個(gè)特定的抗體，可確定腫瘤的相關(guān)抗原)，以確定一個(gè)給定的腫瘤抗原的細(xì)胞數(shù)量；采用計(jì)算機(jī)斷層掃描，磁共振成像，和/或腫瘤x射線成像技術(shù)來(lái)估算和/或監(jiān)測(cè)腫瘤的大小，測(cè)量生物樣品中腫瘤相關(guān)抗原的數(shù)量，如血液或血清；等等。在一些實(shí)施例中，與合適的對(duì)照樣相比，該方法可有效的減少腫瘤的增長(zhǎng)率至少約5％，至少約10％，至少約20％，至少約25％，至少約50％，至少約75％，至少約85％，或至少在90％左右，直到完全抑制腫瘤的生長(zhǎng)，比較合適的控制。因此，在這些實(shí)施例，有效金額為aa金額足以至少約5％，以減少腫瘤的生長(zhǎng)速度，至少有10％左右，至少約20％，至少約25％，至少約50％，至少約75％，至少約85％，或至少在90％左右，總抑制腫瘤的生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物系統(tǒng)中，一個(gè)合適的對(duì)照樣，可以是一個(gè)未用藥劑治療的基因相同的動(dòng)物的腫瘤的生長(zhǎng)速度。在非實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，一個(gè)合適的對(duì)照樣，可以是藥劑給藥之前的腫瘤負(fù)荷或腫瘤的生長(zhǎng)率。其他適當(dāng)?shù)膶?duì)照樣可以是安慰劑對(duì)照。腫瘤生長(zhǎng)是否被抑制可以用任何已知的方法檢測(cè)，包括但不限于在體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，在體外增殖實(shí)驗(yàn)；h-胸苷攝取檢測(cè)；等。(e)消炎治療中使用氨基酸在另一個(gè)典型的實(shí)施例中，aa包含一個(gè)結(jié)合到炎癥中介物的ab，如白細(xì)胞介素，aa用于治療有關(guān)病癥。白細(xì)胞介素結(jié)合的aa可以包括結(jié)合ab的雙重靶點(diǎn)，結(jié)合到例如，白細(xì)胞介素12的ab，以及結(jié)合到il23的ab，或第一個(gè)ab結(jié)合白細(xì)胞介素17和第二個(gè)ab的結(jié)合到il23的aa。這種雙重靶點(diǎn)結(jié)合的aa，因此可以被設(shè)計(jì)為緩解炎癥，起到一個(gè)共存于炎癥位點(diǎn)的裂解劑的作用(如酶，諸如mmp或其他酶，如表3所示)。采用aa的非治療方法aas也可用于診斷和/或成像方法。例如，具有酶裂解cm的aas，可以用來(lái)檢測(cè)一種能夠裂解cm酶的存在與否。這種氨基酸可用于診斷，其可以包括在體內(nèi)酶的活性檢測(cè)(例如，定性或定量)(或在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增可能性減少的環(huán)境，如可以用于減少二硫鍵)，以及同時(shí)存在的目標(biāo)靶點(diǎn)的活性，通過(guò)測(cè)量在一個(gè)給定的宿主生物體的特定組織中激活的氨基酸積累。例如，在cm可以選擇成為一種蛋白酶底物，在腫瘤部位發(fā)現(xiàn)的一種蛋白酶，在生物局限性位點(diǎn)一種病毒或細(xì)菌感染的位點(diǎn)(例如，如膿腫，器官，等)，等等。ab可以結(jié)合到靶點(diǎn)抗原。使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)方法，可檢測(cè)的標(biāo)記(例如，一個(gè)熒光標(biāo)記)可以與aa中的ab或其他地區(qū)偶合。下面提供了上述篩選方法和其他的具體實(shí)施例中所討論的合適的可檢測(cè)標(biāo)記。使用疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)或肽特定的ab，與在目標(biāo)疾病組織中的活性升高的蛋白酶一同，與不存在可檢測(cè)水平的或以比病變組織低的水平存在的cm特異性酶相比，aa將表現(xiàn)出與疾病組織結(jié)合率增加。由于小分子蛋白質(zhì)和多肽迅速由腎臟過(guò)濾系統(tǒng)從血液中清除，并因?yàn)閏m特異性酶是以不可檢測(cè)水平存在(或者說(shuō)是在非病變組織以較低水平存在)，在病變組織中激活aa的積累大于非病變組織。在另一個(gè)實(shí)施例中，aas可用于檢測(cè)樣品中是否存在裂解劑。例如，其中aa包含容易被酶裂解的cm，aa可用于檢測(cè)(定性或定量)樣品中酶的存在。在另一個(gè)實(shí)施例中，aa包含易被還原劑裂解的cm，aa可用于檢測(cè)(定性或定量)樣品中是否存在還原條件。為了方便在這些方法中的分析，aa可以是可檢測(cè)的標(biāo)記，并可以結(jié)合到一個(gè)載體(例如，固體載體，諸如薄片或小珠)。可檢測(cè)標(biāo)記可定位于aa裂解后分解的部分。該實(shí)驗(yàn)法可以通過(guò)與，例如，固定化的，其樣品被懷疑含有一種有足夠的時(shí)間發(fā)生裂解的酶和/或還原劑的可檢測(cè)標(biāo)記的aa接觸，然后清洗，以除去多余的的樣品和污染物進(jìn)行。樣品中裂解劑(如酶或還原劑)的存在與否，是在與樣品接觸前通過(guò)aa檢測(cè)信號(hào)的變化進(jìn)行檢測(cè)(例如，可檢測(cè)信號(hào)因aa被樣品中的裂解劑裂解降低，清除附加了檢測(cè)標(biāo)記的aa片段的是裂解的結(jié)果)。這種檢測(cè)方法也適用于檢測(cè)能夠結(jié)合aa的ab的靶點(diǎn)是存在還是不存在。因此，在體外試驗(yàn)中可用于評(píng)價(jià)裂解劑存在還是不存在，以及目標(biāo)靶點(diǎn)存在還是不存在。如上所述，裂解劑存在還是不存在可通過(guò)aa中可檢測(cè)標(biāo)記的減少檢測(cè)，而靶點(diǎn)的存在還是不存在可通過(guò)靶點(diǎn)-ab復(fù)合物檢測(cè)，如通過(guò)使用可檢測(cè)的標(biāo)記的反-靶點(diǎn)抗體檢測(cè)。如上所述，本發(fā)明所公開(kāi)的aa可以包括可檢測(cè)的標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施例中，aa包括一種可作為診斷劑使用的可檢測(cè)的標(biāo)記。可作為診斷劑使用的可檢測(cè)的標(biāo)記非限制的實(shí)施例包括含有放射性同位素，如銦或锝的顯像劑；mri和其他應(yīng)用的含碘、釓或氧化鐵的對(duì)比劑；酶，如辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶酶，或β-半乳糖苷酶；諸如如gfp，銪衍生物的熒光物質(zhì)，熒光團(tuán)；如n-甲基丙烯酸鹽(或酯)衍生等的發(fā)光的物質(zhì)。易損斑塊的破裂和隨后血塊的形成，被認(rèn)為可導(dǎo)致絕大多數(shù)心臟病的發(fā)作。易損斑塊的有效靶向性可以提供穩(wěn)定的治療，以減少破裂的可能性。vcam-1無(wú)論是在易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)段，還是在病變邊緣區(qū)都有所增加。iiyama,etal.(1999)circulationresearch,amheartassoc.85:199-207。膠原酶，如mmp-immp-8和mmp-13在人類動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)度表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂。fricker,j.(2002)drugdiscovtoday7(2):86-88。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明公開(kāi)的用于診斷和/或成像方法的aas被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)和/或標(biāo)記動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，如，脆弱的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的。通過(guò)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊相關(guān)的靶向蛋白，aas可用于檢測(cè)和/或標(biāo)記這種斑塊。例如，本發(fā)明方法所使用含有反-vcam-1ab和可檢測(cè)標(biāo)記的aa，被設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)和/或標(biāo)記動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。這些aa可以在動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)試，如apoe基因小鼠。生物分布的注意事項(xiàng)本發(fā)明所述組合物的治療潛力使修改后的ab或aa有更大的生物分布與生物利用度。本發(fā)明所述的組合物提供的抗體治療，提高了生物利用度，其中正常組織中將抗體治療結(jié)合到靶點(diǎn)的親和力低于病變組織。病變組織中包括耦合到mm的ab的藥物組合物，可以顯示出對(duì)靶點(diǎn)的親和力大于正常組織的。在優(yōu)選實(shí)施例中，病變組織的親和力比正常組織的親和力大5-10,000,000倍。一般說(shuō)，本發(fā)明提供了一種提高生物利用度的抗體治療，其中第一個(gè)組織中將抗體治療結(jié)合到靶點(diǎn)親和力小于第二組織中抗體治療結(jié)合到靶點(diǎn)的親和力。對(duì)于不同的實(shí)施例的例子，第一組織是一個(gè)正常組織，而第二個(gè)組織是病變組織；或者，第一個(gè)組織處于是早期腫瘤階段，而第二個(gè)組織處于晚期腫瘤階段；或者，第一組織是一種良性腫瘤，而第二個(gè)組織是一種惡性腫瘤組織；或者第一組織和第二個(gè)組織是在空間上分離的；或在一個(gè)具體的實(shí)施例中，第一個(gè)組織是上皮組織，而第二個(gè)組織是乳腺，頭，頸，肺，胰腺，神經(jīng)系統(tǒng)，肝臟，前列腺癌，泌尿生殖道或?qū)m頸組織。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：篩選候選掩蔽基團(tuán)(mm)為了生產(chǎn)含有抗體和其片段(ab)耦合具有所需的最佳結(jié)合和裂解特性的mm，篩選了候選mm的庫(kù)。生成了具有不同可變氨基酸序列、不同半胱氨酸位置、不同長(zhǎng)度等的mm。對(duì)候選mm與目標(biāo)ab的結(jié)合親和力進(jìn)行了試驗(yàn)。最好，mms不包含本機(jī)的氨基酸序列具有約束力的合作伙伴的ab選擇修改后的抗體的建設(shè)。最好為修飾抗體的構(gòu)造選擇ab結(jié)合配體不含原生氨基酸序列的mm。進(jìn)行了用于目標(biāo)ab的mm親和力成熟選擇具有約1-10nm的親和力的mm。實(shí)施例2：修飾抗體和可激活抗體(aa)庫(kù)的篩選為了確定修飾抗體和具有需要的可轉(zhuǎn)換特性的aas(即，相對(duì)于在掩蔽和/或裂解結(jié)構(gòu)狀態(tài)時(shí)在掩蔽和/或未裂解結(jié)構(gòu)狀態(tài)靶點(diǎn)連接的降低)，生成了候選修飾抗體和在掩蔽基團(tuán)(mms)中具有不同可變氨基酸序列的候選aa庫(kù)、mm中的半胱氨酸的可變位置、各種鏈接體長(zhǎng)度以及親代ab的各種連接點(diǎn)。本發(fā)明提供了一個(gè)篩選/排序的方法的原理圖，以確定顯示可轉(zhuǎn)換表型的候選aa。通過(guò)表達(dá)向量顯示在細(xì)菌細(xì)胞表面的aa引入的了庫(kù)。通過(guò)培養(yǎng)擴(kuò)大庫(kù)后，然后用適當(dāng)?shù)挠捎诹呀饣蜻€原cm的酶或還原劑處理顯示aa多肽的細(xì)胞。然后將進(jìn)過(guò)處理的細(xì)胞與熒光標(biāo)記的靶點(diǎn)接觸，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行排序以分離顯示與裂解/還原的靶點(diǎn)結(jié)合的aa的細(xì)胞。對(duì)顯示靶點(diǎn)結(jié)合結(jié)構(gòu)的細(xì)胞通過(guò)培養(yǎng)擴(kuò)增。然后將細(xì)胞與標(biāo)記靶點(diǎn)接觸并通過(guò)facs排序以流式細(xì)胞儀分離顯示在酶/還原劑不存在時(shí)不能與靶點(diǎn)結(jié)合的aa的細(xì)胞。這些步驟代表一個(gè)周期甄別程序。細(xì)胞可以接受額外的周期通過(guò)培養(yǎng)擴(kuò)增，并再次全部或部分接受篩選步驟的培養(yǎng)。庫(kù)篩選和排序也可以通過(guò)不用酶/還原劑處理時(shí)，候選物不與標(biāo)記靶點(diǎn)結(jié)合的第一輪篩選啟動(dòng)(即，當(dāng)不裂解/還原時(shí)不與靶點(diǎn)結(jié)合)。實(shí)施例3：以修飾抗體的體外的篩選確定mm掩蔽效率為了篩選修飾抗體和掩蔽后表現(xiàn)出最佳特性的aas，例如，生成了當(dāng)在掩蔽狀態(tài)和一中靶點(diǎn)存在時(shí)，只有10％與靶點(diǎn)結(jié)合，abs與不同的mms或abs與相同的mms在不同連接點(diǎn)耦合，或abs通過(guò)不同長(zhǎng)度和/或序列鏈接體與相同的mm結(jié)合。mm掩蔽效率可以通過(guò)mm對(duì)ab的親和力和mm相對(duì)于靶點(diǎn)與ab結(jié)合界面的相對(duì)空間關(guān)系確定。高效mm的反應(yīng)是基于親和力和可選擇地使用一種掩蔽效率的盡管測(cè)量方法。在修飾抗體或aa中，可以測(cè)量時(shí)間依賴性的mm的靶點(diǎn)替換以便優(yōu)化和選擇mm。為了有效掩蔽抗體的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，本發(fā)明描述了一種免疫吸附靶點(diǎn)替換分析(tda)方法。在tda分析中，在與質(zhì)量相關(guān)的濃度和時(shí)間下，測(cè)量了mm抑制ab與靶點(diǎn)結(jié)合的能力。該分析允許的mm隨時(shí)間變化的靶點(diǎn)替換測(cè)量。簡(jiǎn)言之，在約4℃將抗體靶點(diǎn)在elisa板的孔內(nèi)吸附過(guò)夜。該板塊用約150μl2％的在pbs中脫脂奶粉(nfdm)、約0.5％(v/v)tween20(pbst)覆蓋，并在室溫下孵育1小時(shí)左右。然后用pbst將該板洗滌大約3次。加入約50μl超級(jí)塊(thermoscientific)并補(bǔ)充蛋白酶抑制劑(complete,roche)。將約50μl耦合了mm的ab溶解在含有蛋白酶放抑制劑的超級(jí)塊中(complete,roche)并在37℃孵育不同的時(shí)間。用pbst將該板洗滌約3次。將約100ml抗hulgg–hrp加入約2％nfdm/pbst中并在室溫孵育1小時(shí)左右。用pbst將該板洗滌約4次及用pbs洗滌約2次。使用作為每個(gè)制造商的指導(dǎo)的tmb(thermoscientific的)開(kāi)發(fā)了該分析方法。實(shí)施例4：包含一種scfv作為ab的aas本發(fā)明描述了包含一種抗-jagged1scfv的aa的實(shí)施例。由于連接了mm，這些aas在正常情況下沒(méi)有活性(掩蔽)。然而，當(dāng)scfv達(dá)到疾病位點(diǎn)時(shí)，一種針對(duì)特定疾病的酶如adam17將裂解一個(gè)連接肽抑制劑到允許其與jaggedl結(jié)合的scfv的底物鏈接體。jaggedl用于發(fā)現(xiàn)對(duì)與抗jaggedlscfv的適宜的mm。在這個(gè)實(shí)施例中，選定的mm與用作激發(fā)劑酶底物結(jié)合。該底物被蛋白酶激活后形成競(jìng)爭(zhēng)靶向結(jié)合的scfv結(jié)構(gòu)體。蛋白酶激活抗體的構(gòu)建基因編碼的包含一種以單鏈形式存在的jagged1抗體的aas通過(guò)重疊延伸的pcr或全部基因合成并結(jié)合入一種類似的消化表達(dá)質(zhì)?；蛉魏纹渌m宜的細(xì)菌、酵母菌、或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體而生成。另外，全尺寸抗體可應(yīng)使用商售的納入半衰期養(yǎng)成基團(tuán)的表達(dá)載體生成，而生成方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員富所熟知。然后表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到一個(gè)合適的表達(dá)宿主，如對(duì)大腸桿菌的bl21或hek293t細(xì)胞。用一種質(zhì)部分提取試劑盒(pierce)從過(guò)夜培養(yǎng)物中收獲單鏈抗體并用固定化金屬離子親和層析柱和體積排阻色譜純化?？贵w開(kāi)關(guān)活性體外監(jiān)測(cè)蛋白酶激活抗體的等分，在1pm-1μm的濃度下在緩沖水溶液中，分別與0和50nm的酶培養(yǎng)3小時(shí)。然后用elisa或或表面等離子體共振固定抗原jagged1對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行結(jié)合分析，當(dāng)使用biacoretmspr分析儀通過(guò)增加共振單位顯示經(jīng)過(guò)蛋白酶處理后對(duì)aa的結(jié)合活性增加了。然后作為裂解結(jié)果的表觀解離常數(shù)(kd)的變化可以根據(jù)儀器制造商的說(shuō)明進(jìn)行計(jì)算(biacore，gehealthcare)。實(shí)施例5：抗-vegfscfvab的克隆aa在這個(gè)和下面的實(shí)施例中，構(gòu)建了一種包含一個(gè)掩蔽的可裂解抗vegfscfv的mmp-9(靶點(diǎn)＝vegf；ab＝抗-vegf單鏈fv)的aa。生成這種aa的第一步，生成含有抗-vegfscfv的一種結(jié)構(gòu)體(ab)，一種抗-vegfscfvab(vl-鏈接體l-vn)從已發(fā)表的蘭尼單抗序列盡心設(shè)計(jì)(genentech,chen,y.,wiesmann,c,fuh,g.,li,b.,christinger,h.,mckay,p.,devos,a.m.,lowman,h.b.(1999)selectionandanalysisofanoptimized抗-vegf抗body:crystalstructureofanaffinity-maturedfabincomplexwith抗genj.moi.biol.293,865-881)andsynthesizedbycodondevices(cambridge,ma).。蘭尼單抗是一種衍生于相同的父鼠源抗體貝伐單抗的單克隆抗體fab片段，(prestalg,chenh,o'connorsj,etalhumanizationofan抗-vascularendothelialgrowthfactormonoclonalantibodyforthetherapyofsolidtumorsandotherdisorders.cancerres,57:4593-9,1997)。它比親代分子小并經(jīng)過(guò)親和力成熟以提供與vegf-a提供更強(qiáng)的結(jié)合。蘭尼單抗結(jié)合并抑制所有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子亞型a(vegf-a)。在n–末端的一個(gè)his6標(biāo)記和tev蛋白酶裂解位點(diǎn)可包含到設(shè)計(jì)中。tev蛋白酶是從煙草蝕紋病毒中分離出一種蛋白酶，是非常具體的，并用來(lái)分離融合蛋白質(zhì)并進(jìn)行凈化。在下文的表7和表8提供了抗-vegfscfv核苷酸和氨基酸序列。表7：抗-vegfscfvab核苷酸序列表8：抗-vegfscfvab氨基酸序列實(shí)施例6：對(duì)抗-vegfscfv篩選和確定mms蘭尼單抗用于篩選匯集的隨機(jī)肽庫(kù)，包括的肽是x15(8.3xl09)、x4cx7cx4(3.6xl09)、或x12cx3(l.lxl09)，其中x為任何氨基酸，數(shù)字代表庫(kù)總的多樣性。匯集庫(kù)的總多樣性是1.3x1010。篩選包括一輪macs和兩輪流式細(xì)胞儀排序。在第一輪macs篩選中，用150nm生物素化的蘭尼單抗探測(cè)了1×1011個(gè)細(xì)胞，有5.5xl07結(jié)合細(xì)胞被分離。第一輪facs篩選中，在macs中篩選中分離的陽(yáng)性細(xì)胞用500nm生物素化的蘭尼單抗探測(cè)，并用neutravidin-pe(分子探針，eugene,or)進(jìn)行可視化。第二輪和第三輪的facs篩選在20umigg抗體存在下，用500nm和100nmalexa標(biāo)記的蘭尼單抗。利用facs分析，對(duì)單個(gè)克隆體進(jìn)行測(cè)序，隨后驗(yàn)證其與抗-vegfscfv的結(jié)合能力。針對(duì)抗-vegfscfv的mm氨基酸序列在表9中提供。(這些序列將以下簡(jiǎn)稱為283mm、292mm、306mm等等)。表9：抗-vegfscfv的mm一個(gè)cm(mmp-9的底物)被融合到掩蔽的抗vegfscfv從而一個(gè)構(gòu)建提供裂解、掩蔽的aa。圖4中提供了一個(gè)典型的構(gòu)造。下面詳細(xì)描述了幾個(gè)典型的aa結(jié)構(gòu)體和含有不同cms的序列。用于構(gòu)件典型結(jié)構(gòu)的引物列于下文表10。表10：用于構(gòu)建mmp-9可裂解、掩蔽-抗-vegf的引物cx02335’gaattcatgggccatcaccatcaccatcacggtgggg3’cx02495’gtgagtaagcttttattacgacactgtaaccagagtaccctgg3’cx02705’gtggcatgtgcacttggccaccttggcccactcgagctggccagactggccctgaaaatacagattttccc3’cx02715’gagtgggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcc3’cx02885’ttcgagctcgaacaacaacaacaataacaataacaacaac3’cx02895’gctttcaccgcaggtacttccgtagctggccagtctggcc3’cx02905’cgctccatgggccaccttggccgctgccaccagaaccgcc3’cx03085’gcccagccggccatggccggccagtctggccagctcgagt3’cx03105’ccagtgccaagcttttagtggtgatggtgatgatgcgacactgtaaccagagtaccctggcc3’cx03125’cttgtcacgaattcgggccagtctggccagctcgagt3’cxo3145’cagatctaaccatggcgccgctaccgcccgacactgtaaccagagtaccctg3’aa的克隆和表達(dá)：一個(gè)可裂解mmp-9，掩蔽的抗vegfscfv作為mbp的融合體克?。嚎寺×艘环Nmbp：抗-vegfscfvab融合體。mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)在大腸桿菌中表達(dá)，作為融合蛋白，并在麥芽糖柱中凈化，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的制備合蛋白的方法。在這個(gè)實(shí)施例中，mbp用于分離掩蔽的scfv。his6標(biāo)記的抗-標(biāo)記的vegfscfvab被克隆到pmal-c4x載體(neb)作為一個(gè)c-末端與mbp融合。在多個(gè)克隆位點(diǎn)(mcs)使用ecori和hindiii對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行限制。引物cx0233和cx0249(表10)，用于擴(kuò)增抗-vegfscfvab并分別引入ecori和hindiii酶切位點(diǎn)。對(duì)aa(肽mm、抗-vegfscfvab和mmp-9cm)接受載體進(jìn)行了合成，使用聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)技術(shù)，對(duì)為了獲得肽mm、鏈接體序列以及在tev蛋白位點(diǎn)和抗-vegfscfvab之間的mmp-9cm蛋白位點(diǎn)而置于克隆位點(diǎn)的引物cx0271和cx0270重疊。引物cx0271和cx0249(表10)用于擴(kuò)增結(jié)構(gòu)體中的c-末端部分，而引物cx0270和cx0288(表10)用于擴(kuò)增結(jié)構(gòu)體中的n-末端部分，使用外引物cx0249和cx0288(表10)，并克隆進(jìn)入pmal載體作為mpb的融合體并使用sad和hindiii酶切位點(diǎn)，對(duì)上述兩個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)合從而獲得最后總的pcr反應(yīng)。表11：mbp/mm接受位點(diǎn)/mmp-9cm/抗-vegfscfvab載體核苷酸序列使用引物cx0289和cx0290(表10)的載體，使用的sfil酶切位點(diǎn)，306mm和314mm(表9)從ecpx顯示載體擴(kuò)增并特異性克隆到n末端掩蔽的載體。下文的表12提供了相應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列。表12:306或314mm/mmp-9cm/抗-vegfscfvab序列表達(dá)：mbp的表達(dá)：在大腸桿k12tbl菌株中完成aa的融合，使用一種含有需要的結(jié)構(gòu)的耐氨芐青霉素的菌落接種5毫升過(guò)夜的含有l(wèi)b底物輔以50μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)物。使用全部的過(guò)夜培養(yǎng)培養(yǎng)物接種500ml新鮮lb底物輔以50μg/ml氨芐青霉素和0.2％葡萄糖并允許在37℃培養(yǎng)，以250rpm搖晃直到0.5o.d.。然后加入異丙基-β-d-半乳糖苷酶，最終濃度達(dá)到0.3mm，并允許培養(yǎng)物在相同的條件下進(jìn)一步培養(yǎng)3小時(shí)，之后用離心機(jī)在3000xg收獲細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)方法純化包涵體。簡(jiǎn)言之，10mlbperii細(xì)胞裂解試劑(皮爾斯)。用離心機(jī)在14000xg收集不溶物，并丟棄水溶性蛋白。將不溶物在5mlbperii輔以lmg/ml溶菌酶重懸浮，并在冰浴中孵育10分鐘，之后將用水按1：20稀釋的5mlbperii加入，在14000xg下旋轉(zhuǎn)試樣。除去上清液，用1：20的bperii清洗微粒兩次。經(jīng)該純化的包涵體溶解在pbs8murea,10mmbme,ph7.4。將mbp融合蛋白稀釋到約1毫克/毫升的濃度，并在ph7.4的pbs中，從8到0m尿素經(jīng)過(guò)6，4，2，0.5，0m尿素進(jìn)行復(fù)性逐步透析。在4、2和0.5m尿素溶液步驟，加入0.2m精氨酸，2mm還原型谷胱甘肽和0.5mm氧化型谷胱甘肽。0m尿素透析包括0.2m精氨酸，去除的尿素后，蛋白質(zhì)透析用0.05m精氨酸和ph7.4的pbs深度透析，所有透析在4℃進(jìn)行并過(guò)夜。為出去聚集物，每個(gè)蛋白質(zhì)在sephacryls-200柱中接受體積排阻色譜純化。對(duì)包含正確折疊的蛋白質(zhì)的組分用amicon超離心式過(guò)濾器濃縮。aa:ammp-9可裂解,掩蔽抗-vegfscfvchistag的克隆和表達(dá)克?。阂颿x0308和cx0310(表10)是用于擴(kuò)增，分別向載體(mm接受位點(diǎn)/mmp-9cm/ab)的5'端添加一個(gè)ncol酶切位點(diǎn)和載體的3'端添加一個(gè)hindiii酶切位點(diǎn)和his6標(biāo)簽，之后克隆到一個(gè)包含pelb信號(hào)肽的載體?？?vegfscfvmms如前面所述進(jìn)行克隆。表13提供了相應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列。表13:306or314mm/mmp-9cm/抗-vegfscfvchisab序列表達(dá)：在大腸桿k12tbl菌株中完成aa的融合，使用一種含有需要的結(jié)構(gòu)的耐氨芐青霉素的菌落接種5毫升過(guò)夜的含有l(wèi)b底物輔以50μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)物。2.5毫升過(guò)夜培養(yǎng)物用于接種250毫升新鮮lb底物輔以50μg/ml氨芐青霉素和0.2％的葡萄糖，并允許在37℃下培養(yǎng)，以250rpm搖晃至達(dá)到1.0o.d.。然后加入異丙基-β-d-半乳糖苷酶，最終濃度達(dá)到0.3mm，并允許培養(yǎng)物在30℃進(jìn)一步培養(yǎng)5小時(shí)，之后用離心機(jī)在3000xg收獲細(xì)胞。用溶菌酶/滲透壓沖擊法立即純化周質(zhì)組分。簡(jiǎn)言之細(xì)胞沉淀在3ml的50mmtris,200mmnacl,10mmedta,20％的蔗糖,ph7.4溶液中充懸，加入2ul/ml備用的溶菌酶溶液。15分鐘后。，加入1.5體積的水(4.5mls)并再在冰上孵育15分鐘，在冰上。用14000xg離心回收可溶性胞質(zhì)組分。使用ni-nta樹(shù)脂對(duì)抗-vegfscfvhis蛋白部分純化。粗周質(zhì)提取物被裝到0.5毫升ni-nta樹(shù)脂，用50mm磷酸300毫米氯化鈉洗滌至ph7.4。his標(biāo)記的蛋白質(zhì)用50mm磷酸鹽300mm氯化鈉、200mm亞胺洗脫，ph值6.0。使用amicon超級(jí)離心機(jī)將蛋白濃縮至約600μl并將緩沖液換成pbs。aa的克隆和表達(dá):一種mmp-9可裂解,掩蔽抗-vegfscfvas人源fc融合克隆：引物cx0312和cxo314(表10)用于擴(kuò)增mmp–9cm/抗-vegfscfv的編碼序列。該引物還包括為5'ecori酶切位點(diǎn)和3'ncol酶切位點(diǎn)的序列和鏈接體序列。用ecori和ncol切割pcr擴(kuò)增序列，隨后克隆進(jìn)入pfuse-higgl-fc2載體從而為fc融合蛋白的表達(dá)生成載體。如前所述，將抗-vegfscfvabmms插入這些載體，構(gòu)建了含有306mm,313mm,314mm,315mm,非結(jié)合的mm(100mm),以及沒(méi)有mm的結(jié)構(gòu)體以及驗(yàn)證的序列。下文的表14提供了相應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列。表14:306mm/mmp-9cm/抗-vegfscfv-fcab序列表達(dá)：使用作為制造商的協(xié)議(invitrogen,ca)的轉(zhuǎn)染胺2000通過(guò)轉(zhuǎn)染向306mm/mmp-9cm/抗-vegfscfv-fc,314mm/mmp-9cm/抗-vegfscfv-fc或抗-vegfscfv-fc的10μg表達(dá)載體中引入107的hek-293自由型細(xì)胞(invitrogen,ca)。細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)。孵化后，收獲經(jīng)調(diào)整處理的底物并通過(guò)離心清除細(xì)胞和碎片。用elisa法檢測(cè)經(jīng)調(diào)整處理的底物。實(shí)施例8:掩蔽mmp-9可裂解aa的活化測(cè)量為了測(cè)定掩蔽的mmp-9裂解的抗-vegfaa由mmp–9的激活，100μl2μg/mlpbs的vegf溶液加入到微孔中(96孔，容易洗凈；corning)，在4℃孵育過(guò)夜。然后，用超級(jí)塊(pierce)封堵微孔3×15分鐘。一百微升aa(每個(gè)構(gòu)造有關(guān)的詳細(xì)信息，見(jiàn)下文)，經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)mmp-9處理，然后向微孔計(jì)入pbst、10％的超級(jí)塊，并在室溫(rt)孵育1小時(shí)。所有洗滌步驟使用300μlpbst進(jìn)行三次。然后加入一百微升二次檢測(cè)試劑，并允許在室溫下孵育1小時(shí)。使用100μltmb1(pierce)溶液完成對(duì)hrp的檢測(cè)。用100μl1n的鹽酸終止反并在450nm處測(cè)定吸光度。包含mbp/mm/mmp-9cm/抗-vegfscfvab的aa載體的elisa分析兩百微升生物素化的aa在濃度為200nm的mmp-9的消化緩沖液(50毫米tris，氯化鈣2毫米，20毫米氯化鈉，100μmol氯化鋅，ph值6.8)中用20utev蛋白酶在4℃消化過(guò)夜以除去mbp融合配體。然后，使用或不用mmp–9將樣品在37℃孵育3小時(shí)。在pbst中以1：1稀釋到最終濃度為100nm，向elis孔中加入10％的超級(jí)塊。使用一種以1：7500稀釋的avidin-hrp軛合物完成aa的測(cè)試。mmp-9裂解的掩蔽mbp:抗-vegfscfvaa中的mmp-9的激活見(jiàn)圖5.包含mm/mmp-9cm/抗-vegfscfvhis的aa結(jié)構(gòu)體的elisa分析在mmp-9的消化緩沖液(150μl)透析粗周質(zhì)提取物在使用或不用mmp–9時(shí)37℃孵育3小時(shí)。然后樣品用pbst稀釋至400μl，將10％的超級(jí)塊鍵入elisa孔中。使用按1：5000稀釋的抗-his6–hrp軛合物完成aa的檢測(cè)。mmp-9的激活mmp-9裂解的掩蔽抗-vegfscfvhisaa見(jiàn)圖6。包含mm/mmp-9cm7抗-vegfscfv-fc的aa結(jié)構(gòu)體的elisa分析50微升的hek細(xì)胞上清液加入到200μl的mmp-9的消化緩沖液，并在37℃使用或不用mmp-9培養(yǎng)2小時(shí)。然后用pbst按1：1稀釋樣品，分別入向elisa孔加100μl10％的超級(jí)塊。用按1：2500稀釋的抗-人類fc–hrp軛合物完成aa的檢測(cè)。mmp-9的激活mmp-9裂解掩蔽抗-vegfscfv-fc見(jiàn)圖7。含有mm7mmp-9cm7抗-vegfscfv-fc的aa載體的純化和檢測(cè)用蛋白a柱色譜純化抗-vegfscfvfcaas。簡(jiǎn)單地說(shuō)，10mlhek細(xì)胞上清液用pbs按1：1稀釋，加入0.5毫升在pbs中預(yù)平衡的蛋白a樹(shù)脂。先用10倍于柱體積的pbs洗柱子，接著用170mm，300毫升氯化鈉洗脫結(jié)合蛋白，ph2.5，并立即用200μl的2mtrisph值8.0中和1ml組分。然后用amicon超離心機(jī)濃縮含有蛋白質(zhì)的組分。用elisa法進(jìn)行分析如對(duì)hek細(xì)胞上清洗液進(jìn)行的。elisa檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示依賴mmp–9的vegf與抗-vegfscfvfcaa結(jié)合與mms306和314用蛋白質(zhì)a柱得到純化，見(jiàn)圖8。實(shí)施例9：靶點(diǎn)替代物分析發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證有效掩蔽的治療蛋白96孔微滴度板吸附vegf，洗凈，用牛奶蛋白封堵。加入25ml含有抗-vegf抗體或包含mmjs306的抗-vegfaa的底物到涂孔中并孵育1，2，4，8或24小時(shí)。經(jīng)過(guò)孵化后，對(duì)孔進(jìn)行洗滌，用抗-hulgg免疫檢測(cè)測(cè)試aa的結(jié)合程度。圖9顯示了掩蔽物306完全在1小時(shí)內(nèi)抑可以制vegf的集合，然而，在16個(gè)小時(shí)，>50％的306抗-vegfaa與其抗原vegf結(jié)合。306掩蔽物，以>600tim的親和力與抗-vegf抗體結(jié)合，不能有效地排除與vegf的結(jié)合。實(shí)施例10：庫(kù)篩選和抗-ctla4mms的分離根據(jù)bessette(bessette,p.h.,rice,jjanddaugherty,p.s.rapidisolationofhigh-affinityproteinbindingpeptidesusingbacterialdisplay.proteineng.design&selection.17:10,731-739,2004)等人的方法，ctla4抗體屏蔽基團(tuán)(mms)從一個(gè)1010隨機(jī)15mer大腸桿菌表面上顯示的肽組合庫(kù)中分離出來(lái)，生物素標(biāo)記的鼠抗-ctla4抗體(克隆uc4f10-11，25nm)用庫(kù)孵育，表示推測(cè)的結(jié)合肽的抗體結(jié)合的細(xì)菌用鏈霉親磁性納米磁珠從沒(méi)有結(jié)合的細(xì)菌中進(jìn)行磁性排序。隨后幾輪使用facs流式細(xì)胞儀進(jìn)行富集。最初一輪的facs操作，使用生物素化的靶點(diǎn)5nm)對(duì)細(xì)菌排序，第二輪標(biāo)記步驟用鏈霉親和素藻紅蛋白。在隨后的幾輪facs，分類進(jìn)行dylight標(biāo)記抗體濃度的目標(biāo)是減少(1納米，然后為0.1nm)，以避免二級(jí)標(biāo)簽步驟親和力的影響，并選擇最高的親和力粘合劑。一輪的mac和三個(gè)輪流式細(xì)胞儀導(dǎo)致了粘結(jié)劑的池從單個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。相對(duì)親和力和個(gè)體克隆的關(guān)閉率篩選使用一個(gè)ficin消化dylight標(biāo)記的fab抗體片段，以減少雙價(jià)抗體的親和力影響到細(xì)菌表面表達(dá)多種肽。作為一個(gè)額外的測(cè)試目標(biāo)的特殊性，個(gè)別克隆進(jìn)行了篩選，在20ume.coii耗盡igg為競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的存在具有約束力。mm的優(yōu)化選擇的4個(gè)克隆的氨基酸和核苷酸序列表15所示。這些序列將互換簡(jiǎn)稱為115mm，184mm，182mm，和175mm。候選人被選為mm一系列的關(guān)閉率，確定后裂解關(guān)閉率的影響在mm分解。mm的，沒(méi)有約束力抗-ctla4被用來(lái)作為陰性對(duì)照。表15：對(duì)于掩蔽抗-ctla4的mms的氨基酸和核苷酸序列kk115mmmillcaagrtwveacangratgattttgttgtgcgcggcgggtcggacgtgggtggaggcttgcgctaatggtaggkk184mmaerlcawagrfcgsgctgagcggttgtgcgcgtgggcggggcggttctgtggcagckk182mmwadvmpgsgvlpwtstgggcggatgttatgcctgggtcgggtgtgttgccgtggacgtcgkk175mmsdgrmgslelcalwgrfcgsagtgatggtcgtatggggagtttggagctttgtgcgttgtgggggcggttctgtggcagcnegativecontrol(doesnotbindanti-ctla4)pcsewqsmvqprcyygccgtgttctgagtggcagtcgatggtgcagccgcgttgctatta實(shí)施例11：cloningof抗-ctla4scfv根據(jù)gilliland等人(gillilandl.k.,n.a.norris,h.marquardt,t.t.tsu,m.s.hayden,m.g.neubauer,d.e.yelton,r.s.mittler,andj.a.ledbetter..rapidandreliablecloningof抗bodyvariableregionsandgenerationofrecombinantsinglechain抗bodyfragments.tissue抗gens47:1,1-20,1996)的方法，從分泌uc4f10-11倉(cāng)鼠抗-小鼠ctla4抗體的雜交瘤細(xì)胞系克隆了抗-ctla4scfv。這種協(xié)議的詳細(xì)版本可在位于http://www.infrontof.ibms.sinica.edu.tw/～sroff/protocols/scfv.htm.的網(wǎng)站上找到。簡(jiǎn)言之，用rneasy全rna分離試劑盒(qiagen)從雜交瘤中分離全部rna。引物igkl(gtyttrtgngtnacytcrca)和ighl(acdatyttyttrtcnacyttngt)(gillilandetal.參考上文)分別用于第一縷可變輕鏈和重鏈的合成。一個(gè)聚g示蹤劑與末端轉(zhuǎn)移酶一起加入，之后加入pcr5'anctail引物(gilliland等。上面提到的)(cgtcgatgagctctagaattcgcatgtgcaagtccgatggtcccccccccccccc)含有ecori,sad和xbal位點(diǎn)輕鏈和重鏈(聚合g末端特異性)和3'hbs-hlgk(cgtcatgtcgacggatccaagcttacyttccayttnacrttdatrtc)和hbs-hlgh(cgtcatgtcgacggatccaagcttrcangcnggngcnarnggrtanac)源自倉(cāng)鼠抗體恒定區(qū)序列和含有hindlll,bamhi和分別用于輕鏈和重鏈擴(kuò)增的靶向位點(diǎn)(gilliland等。上面提到的).加入一個(gè)帶有末端轉(zhuǎn)移酶的多g尾部，接下來(lái)使用含有用于輕鏈和重鏈的ecori、sad和xbal位點(diǎn)的5'anctail引物(gillilandetal.參考上文)(cgtcgatgagctctagaattcgcatgtgcaagtccgatggtcccccccccccccc)進(jìn)行pcr以及衍生于鼠抗體恒定區(qū)序列，并含有輕，重鏈分別擴(kuò)增需要的hindlll，bamhi和sail的位點(diǎn)(gillilandetal.參考上文)的hbs-hlgh(cgtcatgtcgacggatccaagcttrcangcnggngcnarnggrtanac)。用hindlll和sad設(shè)計(jì)了結(jié)構(gòu)和載體，結(jié)合并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌。對(duì)單個(gè)克隆體測(cè)序并通過(guò)與已經(jīng)存在的小鼠和倉(cāng)鼠抗體進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證vl和vh(分別見(jiàn)表16和表)的正確序列。前導(dǎo)序列，如在已存在序列中對(duì)抗-ctla4的描述，也通常被稱為一個(gè)信號(hào)序列或分泌前導(dǎo)序列，也是抗體指示分泌的氨基酸序列。這個(gè)序列在分泌期間由細(xì)胞切割，不包括成熟的蛋白質(zhì)。此外，這里介紹的由tuve等克隆的相同的scfv是等同的序列(tuve,s.chen,b.m.,liu,y.,cheng,t-l.,toure,p.,sow,p.s.,feng,q.,kiviat,n.,strauss,r.,ni,s.,li,z.,roffler,s.r.andlieber,a.combinationoftumorsite-locatedctl-associated抗gen-4blockadeandsystemicregulatoryt-ceildepletioninducestumordestructiveimmuneresponses.cancerres.67:12,5929-5939,2007)。表16：倉(cāng)鼠抗-小鼠ctla4vl先導(dǎo)序列表17:倉(cāng)鼠抗-小鼠ctla4vh為了確定最佳的用于表達(dá)和功能的抗-ctla4scfv的方向，設(shè)計(jì)引物用于分別pcr擴(kuò)增可變輕、重鏈，半個(gè)(gggs)3鏈接體位于n-或c-末端以便接著“拼接重疊延伸的pcr(soe-pcr；horton,r.m.,hunt,h.d.,ho,s.n.,pullen,j.k.andpease,l.r.(1989)engineeringhybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymes:genesplicingbyoverlapextension.gene77,61-68)，vl或vl在n-末端。設(shè)計(jì)在n-末端的ndel酶切位點(diǎn)在核苷酸序列的起始位置產(chǎn)生一個(gè)在框中的起始密碼子和his標(biāo)記，終止密碼子加入c-末端。然后通過(guò)縫制pcr，使用在vhvl和vlvh產(chǎn)生scfvs的外引物將輕，重鏈加入(圖10)。引物見(jiàn)下文的表18。表18:產(chǎn)生scfvsvhvl和vlvh的引物接下來(lái)，一套用于mm克隆的重疊引物設(shè)計(jì)添加sfi和xhol的位點(diǎn)，接下來(lái)是mmp-9的裂解序列和在n-末端的(ggs)2鏈接體結(jié)構(gòu)。這些引物見(jiàn)表19和圖10所示的示意圖。表19:用于ic的引物mm和cm克隆包含scfvs的鏈接體經(jīng)pcr擴(kuò)增，用ndel和ecorl(一個(gè)vh的內(nèi)部酶切位點(diǎn))消化劑膠體純化。pcr產(chǎn)物連接到載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，核苷酸和氨基酸序列于表20。表20：mm鏈接體-cm-抗ctla4scfv鏈接體mm的序列用pcr擴(kuò)增，在sfil和xhol位點(diǎn)消化，結(jié)合入成鏈接體抗-ctla4scfv的構(gòu)造，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌并測(cè)序。mm115-cm-ab的完整的核苷酸和氨基酸氨基酸序列分別如下表21和22所示。表21:氨基酸序列ofmm115-抗-ctla4scfvab為了生成mm-cm-抗-ctla4scfv-fc融合體，設(shè)計(jì)下文列于表23的引物用于擴(kuò)增通過(guò)在融合系統(tǒng)(clontech)克隆進(jìn)入pfusefc載體的結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，并將單個(gè)克隆的序列進(jìn)行了驗(yàn)證。表23:產(chǎn)生mm-cm-抗-ctla4scfv-fc融合的引物實(shí)施例13：在hek-293細(xì)胞中，掩蔽/mmp-9/抗-ctla4scfv-fc的表達(dá)和分析作為生產(chǎn)商的協(xié)議(invitrogen)通過(guò)使用轉(zhuǎn)染胺2000轉(zhuǎn)染，向10μg用于pl75ctla4pfuse、p182ctla4pfuse，p184ctla4pfuse，pi15ctla4pfuse，或pnegctla4pfuse的表達(dá)載體引入107的hek-293自由型細(xì)胞(invitrogen)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞額外培養(yǎng)72小時(shí)。孵化后，收獲經(jīng)過(guò)調(diào)整處理底物，通過(guò)離心清除細(xì)胞和碎片。如下文所述，用elisa法測(cè)定經(jīng)過(guò)調(diào)整處理底物活性。50微升經(jīng)過(guò)調(diào)整處理的來(lái)自hek–293表達(dá)mm175-抗-ctla4scfv、mm182-抗-ctla4scfv、mm184-抗-ctla4scfv、mml15-抗-ctla4scfv，或mmneg-抗-ctla4scfv底物添加到200μlmmp-9的消化緩沖液中并使用或不用mmp–9在37℃孵育2小時(shí)。樣品用pbs、4％非脫脂牛奶(nfdm)按1：1稀釋。用競(jìng)爭(zhēng)elisa法測(cè)定結(jié)合活性。在pbs(r&d系統(tǒng))中的100μl濃度為0.5mg/ml的小鼠ctla4-fc融合蛋白加入96孔易洗板(corning)，并在4℃孵育過(guò)夜，然后用在pbs中的100μl2％非脫脂奶粉將孔在室溫(rt)封堵一小時(shí)，然后用pbs、0.05％吐溫20(pbst)沖洗3次。50μl調(diào)整處理的轉(zhuǎn)染hek-293細(xì)胞的底物，表達(dá)未經(jīng)或經(jīng)mmp-9處理的mm175抗-ctla4scfv、mm182-抗-ctla4scfv、mm184-抗-ctla4scfv、mm115-抗-ctla4scfv或mmneg-抗-ctla4scfv培養(yǎng)物加入孔中并在室溫下孵育15分鐘。孵育之后將50μl含有含0.5μg/ml的生物素化鼠b71-fc(r&d系統(tǒng))的pbs加入每個(gè)孔中。接著在室溫下進(jìn)一步孵化30分鐘，然后用150μlpbst洗孔5次。加入100μl含1：3000稀釋的抗生物素蛋白hrp的pbs并將該孔板在室溫下孵育45分鐘，然后用150μlpbst洗7次。用100μltmb(pierce)進(jìn)行elisa，用100μl1n鹽酸終止反應(yīng)，并在450nm處測(cè)定吸光度。實(shí)施例14：一種抗-ctla4的構(gòu)建表24和25分別顯示抗-人-ctla–4scfv的核苷酸和氨基酸序列。提供(根據(jù)合同,bycreativebiolabs,21brookhavenblvd.,portjeffersonstation,ny11776)了能夠結(jié)合人類ctla3的m13噬菌體。在大腸桿菌tg–1中生成噬菌體，并用聚乙二醇純化，用氯化鈉沉淀。表24:抗-人源ctla4scfvab核苷酸序列表25:抗-人源ctla4scfvab氨基酸序列噬菌體elisa法測(cè)量ctla–4的結(jié)合：為了測(cè)量抗-ctla-4scfv-c2的結(jié)合，將在pbs中的100μl0.5μg/ml的人ctla-4-igg或小鼠ctla-4-igg(r&dsystems)添加到微孔(96孔易洗，corning)并在4℃孵育過(guò)夜，然后用在pbst(pbs,ph7.4,0.5％tween-20)，然后用300μlpbst洗孔3次，清洗后，將在pbst中純化的抗-ctla-4scfv噬菌體加入微孔，一式三份并在室溫下孵育1小時(shí)。然后用300μlpbst洗孔3次。加入100μl抗-m13hrp共軛的抗體并在室溫孵育1小時(shí)。用100μltmb1溶液完成hrp的檢測(cè)。用100μl1n的鹽酸終止反應(yīng)并在450nm測(cè)定吸光度。圖19顯示了抗-ctla4與小鼠和人ctla4的結(jié)合。包含一個(gè)igg作為ab的aas在一下部分描述了一種在人igg中含有一種抗-egfr和抗-vegf的aa的例子。在正常情況下，這些氨基酸被屏蔽處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)aa到達(dá)病變組織，它們被特定的病變蛋白酶裂解，然后與其靶點(diǎn)結(jié)合。細(xì)菌顯示用于研究適合于抗-egfr和抗-vegf抗體的mm。在本實(shí)施例中，選定的mm與酶的底物一起用作引發(fā)劑以生成aa，成為根據(jù)蛋白酶激活性特異性結(jié)合到靶點(diǎn)的成分。此外，細(xì)菌顯示是用來(lái)改變發(fā)現(xiàn)的肽，以增加ab親和力，并加強(qiáng)對(duì)未裂解狀態(tài)靶向結(jié)合的抑制力。增加mm的親和力和增強(qiáng)抑制對(duì)于適當(dāng)?shù)腶a功能是很重要的。實(shí)施例15一種抗-vegfiggaa的構(gòu)建抗-vegfigg抗體的構(gòu)建使用抗-vegfmmp-9306scfv(如上所述)作為為模板，用引物cx0311和cx0702經(jīng)pcr擴(kuò)增抗-vegf輕鏈可變區(qū)，然后使用ecori和bsiwi酶切位點(diǎn)(pfil2-vegf-lc)，克隆到pfil2-cl-hk的載體。使用抗-vegfmmp-9scfv作為模板，用引物cx0325和cx0702經(jīng)pcr擴(kuò)增306mmp-9輕鏈并克隆到如上述的(pfil2-306mvegf-lc)。使用306mm/mmp-9cm/抗-vegfscfv(如上所述)作為模板，用引物cx0700和cx0701將pcr擴(kuò)增抗-vegf重鏈可變區(qū)并用ecori和nhel酶切位點(diǎn)(pfil-vegf-hc)克隆到pfil-chig-hgl載體。下表26中提供了引物。如上所述，屏蔽306，用于抗vegfaa發(fā)展并在長(zhǎng)時(shí)間的暴露于靶點(diǎn)時(shí)，沒(méi)有有效地掩蓋靶點(diǎn)結(jié)合，由于mm為ab低親和力的目標(biāo)。增加親和力的mm的方法之一，是受肽親和力成熟，如下所述。親和力成熟的庫(kù)構(gòu)建物306抗vegf的mm是用柔軟的隨機(jī)方法親和力成熟。一個(gè)ecpx細(xì)胞庫(kù)建于表28所示的核苷酸比率。最后庫(kù)多樣性(306sr)約為2.45×108。表28306sr庫(kù)篩選采用蛋白-a標(biāo)記的磁珠大于庫(kù)中100x過(guò)量采樣量的細(xì)胞開(kāi)始macs循環(huán)。在磁性選擇之前，100nm抗-vegfigg和10μm306肽(306p,pcsewqsmvqprcyyg)孵化細(xì)胞，以減少具有與原306序列相同或更低的親和力的變體結(jié)合。磁性選擇來(lái)自2x107細(xì)胞分離。對(duì)于用1nmdylight(fluor530nm)抗vegf標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀排序的第一輪循環(huán)。采用選擇性群體壓力，對(duì)于在100nm、306p的存在下，采用1nmdylight抗vegf標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀排序的第二和第三輪循環(huán)。選擇開(kāi)口以便只有5％具有最強(qiáng)結(jié)合的細(xì)胞被收集。在第三輪循環(huán)被排序的細(xì)胞群首次采用10nmdylight-抗-vegf孵育，接著加入306p使其最終濃度為100nm，在37℃孵育20分鐘。收集最亮的2％的陽(yáng)性群體，表示306p結(jié)合不完全。流式細(xì)胞儀按照下述方式循環(huán)5～7周；群體采用10nmdylight標(biāo)記的抗-vegf標(biāo)記，的人口被打成10nmdylight標(biāo)記的抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，然后與未標(biāo)記的vegf(100nm)在37℃分別競(jìng)爭(zhēng)7，10和15分鐘。最亮的1％在流式細(xì)胞儀進(jìn)行了5至7周排序。表29306sr親和力成熟胎分析對(duì)3種不同的熒光標(biāo)記的抗-vegf濃度，在facs分析ecpx3.0克隆體306、js1825、js1827和js1829的結(jié)合。結(jié)合曲線如圖21所示。所有三個(gè)親和力成熟肽顯示比306p高至少10倍的親和力?？?vegfaas的構(gòu)建用引物cx0289和cx0687通過(guò)pcr擴(kuò)增親和力成熟的ecpx3.0克隆體(js1825，js1827，js1829)并用sfil酶切位點(diǎn)克隆到pfil2-306mvegf-lc產(chǎn)生載體pfil2-1825mvegf-lc、pfil2-1827mvegf-lc和pfil2-1829mvegf-lc。在下表中提供了核苷酸和氨基酸序列，括號(hào)劃定了各種序列域之間的界限：(鏈接體)(毫米)(鏈接體)(cm)(鏈接體)(ab)?？?vegf抗體和aa的表達(dá)和純化根據(jù)制造商協(xié)議(invitrogen公司)使用脂質(zhì)體200(invitrogen公司)將3μgpfilvegf-c和3μgpfil2-vegf-lc共轉(zhuǎn)染到cho-s細(xì)胞(invitrogen)。在自由型培養(yǎng)基(invitrogen公司)中培養(yǎng)并選用于阻礙博萊霉素和殺稻瘟。用有限稀釋法分離出單個(gè)克隆體并通過(guò)elisa法選擇用于表達(dá)能結(jié)合egfr的人igg，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)蛋白-a色譜純化所有的抗體和aas。同樣，用3μgpfil-vegf-hc將3μg每種aa輕鏈pfil2-306mvegf-lc、pfil2-1825mvegf-lc、pfil2-1827mvegf-lc、或者pfil2-1829mvegf-lc的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染到3μgcho-s細(xì)胞。在自由型cho培養(yǎng)基(invitrogen)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并選擇用于阻礙博萊霉素和殺稻瘟。用有限稀釋法分離出單個(gè)克隆體并通過(guò)elisa為能夠結(jié)合egfr人igg表達(dá)選定單個(gè)克隆體?？?vegf抗體和aa的靶點(diǎn)置換實(shí)驗(yàn)將vegf吸收到96孔微滴度板，洗凈，用牛奶蛋白封堵。將約25ml含有抗-vegf抗體或抗-vegfaa的含mm的js306、js1825、js1827和js1829的培養(yǎng)基加入涂敷的孔中并孵育約1、2、8或24小時(shí)。清洗經(jīng)過(guò)孵育后的板孔，并通過(guò)抗-huigg免疫檢測(cè)結(jié)合aa程度。實(shí)施例16:抗-egfriggaa的構(gòu)建抗-egfriggaa的構(gòu)建用寡核苷酸cx638-cx655通過(guò)組裝pcr合成c225輕鏈可變區(qū)基因，如bessette等，methodsinmolecularbiology,vol.231。得到的產(chǎn)品用bamhi/notl消化并用bamhi/notl消化結(jié)合到bamhi/notl消化的pxmal的大片段產(chǎn)生質(zhì)粒px-scfv225-vk。類似地，用寡核苷酸cx656-cx677通過(guò)組裝pcr合成c225重鏈可變區(qū)基因，用bglll/notl消化并結(jié)合到pxmalbamhi/notl生成質(zhì)粒px-scfv225-vh。然后，將輕鏈可變區(qū)基因作為一個(gè)bamhi/notl片段從px-scfv225-vk克隆到px-scfv225-vh質(zhì)粒的bamhi/not位點(diǎn)生成質(zhì)粒px-scfv225m-hl，基于c225含有scfv基因。將il2信號(hào)序列作為一個(gè)kasl/ncol片段轉(zhuǎn)移到用kasl/ncol消化的pfuse2-clig-hk(invivogen)，產(chǎn)生質(zhì)粒pfil2-cl-hk。將il2信號(hào)序列也作為一個(gè)kasi/ecori片段從pinfuse-higgl-fc2轉(zhuǎn)移到用kasi/ecori消化的pfuse-chig-hgl(invivogen)在三個(gè)方向結(jié)合，產(chǎn)生質(zhì)粒pfilchig–hgl。用寡核苷酸cx325/cx689從質(zhì)粒pfil2-cl-hk通過(guò)擴(kuò)增將人igg重鏈恒定區(qū)實(shí)施位點(diǎn)特異性突變，bsiwi/nhel消化，并在bsiwi/nhel克隆到pfil2-cl-hk，產(chǎn)生pfil2cl225。在三個(gè)片段中，用寡核苷酸cx325/cx689、cx690/cx692和cx693/cx694從質(zhì)粒pfil-chig-hgl通過(guò)擴(kuò)增將人igg重鏈恒定區(qū)實(shí)施位點(diǎn)特異性突變，接著用外引物cx325/cx694通過(guò)重疊pcr擴(kuò)增所有三個(gè)產(chǎn)品。用erori/avrll消化得到的產(chǎn)品并在ecori/nhel克隆到pinfuse-higgl-fc2，產(chǎn)生質(zhì)粒pfil-ch225。從px-scfv225mhl和寡核苷酸cx695/cx696擴(kuò)增可變輕鏈基因片段，用bsal消化，并在ecori/bsiwi克隆到pfil2-cl225，導(dǎo)致c225輕鏈表達(dá)載體pfil2-c225-光。從px-scfv225m-hl和oligoscx697/cx698擴(kuò)增可變重鏈基片段，用bsal消化，在ecori/nhel克隆到pfil-ch22，導(dǎo)致c225重鏈表達(dá)載體pfil-c225-重鏈?？?egfraa表達(dá)載體的構(gòu)建在不同的反應(yīng)中，使用引物cx730/cx731和cx732/cx733通過(guò)pcr擴(kuò)增質(zhì)粒px-scfv225m–hlp，使用外引物cx730/cx733通過(guò)重疊pcr擴(kuò)增所得到的產(chǎn)品，用bglll/notl消化，并在bamhi/notl克隆到pxmal，產(chǎn)生質(zhì)粒px-scfv225m-lh。在一個(gè)與重疊正向引物cx740,cx741和反應(yīng)引物cx370反應(yīng)中通過(guò)pfuse-higg-fc2的pcr擴(kuò)增將鏈接體序列加入人iggfc片段基因的n-末端。用ecori/bglll消化所得到的產(chǎn)品，將～115bp片段在ecori/bglll克隆到pfuse-higg-fc2。將所所得脂質(zhì)用kpnl/bglll消化，將大片段結(jié)合到kpnl/bamhi消化的，用oligoscx736/cx735擴(kuò)增px-scfv225m-lh的pcr產(chǎn)品，產(chǎn)生質(zhì)粒pphb3734。用sfil/xhol消化得到的質(zhì)粒，克隆掩蔽肽3690作為pphb3690的sfil/xhol片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pphb3783。加入蛋白酶底物sm984，用bamhi/kpnl消化得到的質(zhì)粒用，并結(jié)和退化磷酸寡核苷酸cx747/cx748的產(chǎn)品，產(chǎn)生質(zhì)粒pphb3822。通過(guò)用xhol得到的質(zhì)粒、去磷酸化消化5'端，并克隆到xhol-消化的用引物cx268/cx448擴(kuò)增pphb3579的pcr產(chǎn)品構(gòu)建串聯(lián)肽掩蔽體，產(chǎn)生質(zhì)粒pphb3889。使用引物cx325/cx696通過(guò)pcr擴(kuò)增pphb3783、pphb3822和pphb3889的掩蔽的區(qū)域、鏈接體、底物和輕鏈可變區(qū)，用ecori/bsiwi消化，并在ecori/bsiwi克隆到pfil2-cl225分別產(chǎn)生aa輕鏈表達(dá)載體pphb4007、pphb3902和pphb3913。通過(guò)克隆如sfil/xhol的片段，親和成熟掩蔽肽交換到到aa輕鏈表達(dá)載體。如bamhi/kpnl相容片段，蛋白酶底物被交換進(jìn)入?？筫gfr抗體和aa的表達(dá)與純化根據(jù)制造商協(xié)議(invitrogen公司)使用脂質(zhì)體200(invitrogen公司)將3μgpfil-ch225-hl和3μgpfil2-ch225-light共轉(zhuǎn)染到cho-s細(xì)胞(invitrogen)。在自由型培養(yǎng)基(invitrogen公司)中培養(yǎng)并選擇用于阻礙博萊霉素和殺稻瘟。用有限稀釋法分離出單個(gè)克隆體并通過(guò)elisa為能夠結(jié)合egfr人igg表達(dá)選定單個(gè)克隆體。所有的抗體和aas使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用蛋白-a色譜純化。同樣，用3μgpfil-ch225-hl將3μg每種aa輕鏈的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染到3μgcho-s細(xì)胞。在自由型cho培養(yǎng)基(invitrogen)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并選擇用于阻礙博萊霉素和殺稻瘟。用有限稀釋法分離出單個(gè)克隆體并通過(guò)elisa為能夠結(jié)合egfr人igg表達(dá)選定單個(gè)克隆體。親和力成熟的抗-egfrmm庫(kù)的篩選用sa磁珠和ecpx3-755庫(kù)中的1.4×108細(xì)胞進(jìn)行第一輪macs。在磁性選擇之前，用3nm生物素標(biāo)記的c225mab孵育細(xì)胞，磁選擇產(chǎn)生6×106分離細(xì)胞。對(duì)2×107用0.1nm熒光劑-c225(fluor530nm)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行第一輪facs排序，產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)合的1.5×105細(xì)胞，提高細(xì)胞群選擇壓力，37℃下在100μm3690肽(cisprgc)存在下對(duì)10nm熒光劑-c225標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行第二輪facs排序。進(jìn)一步提高選擇壓力，37℃下在100μm3690肽(cisprgc)存在下對(duì)10nm熒光劑-c225標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行第三輪和第四輪facs排序，收集了1％最亮的陽(yáng)性細(xì)胞群，代表結(jié)合沒(méi)有被3690肽競(jìng)爭(zhēng)。對(duì)從上述篩選中分離出的單個(gè)克隆體的細(xì)胞親和力測(cè)量顯示由三種肽3954(cisprgcpdgpyvm)、3957(cisprgcepgtyvpt)和3958(cisprgcpgqiwhpp)具有對(duì)c225至少有大于3690(cisprgc)100倍的親和力。圖22顯示了一些egfrmm的親和力成熟過(guò)程。c225mm的親和力測(cè)定c225結(jié)合mm的3690、3954和3957的細(xì)胞親和力測(cè)量。對(duì)結(jié)合ecpx3.0的克隆體3690、3954和3957，在3種不同濃度的熒光劑標(biāo)記的抗-egfrfab之間進(jìn)行facs分析。結(jié)合曲線如圖23所示。mm3954和3957顯示比3690至少有高于100倍的親和力?？筫gfraa的靶向目標(biāo)替代物分析將egfr吸收到96孔微滴度板孔內(nèi)，洗凈，用牛奶蛋白封堵。將約25ml含有2nm抗-egfr或抗-vegfaa含mm的3690,3957，3954and3960/3579的培養(yǎng)基加入涂敷的孔中并孵育約1、2、8或24小時(shí)。清洗經(jīng)過(guò)孵育后的板孔，并通過(guò)抗-huigg免疫檢測(cè)結(jié)合aa程度。以抗-egfr抗體的結(jié)合(100％)為準(zhǔn)對(duì)抗-egfraa的結(jié)合進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以便在aa背景下直接對(duì)比掩蔽效率。以親代或未修飾抗體的百分比表示的平衡結(jié)合程度顯示在表34和圖24中。鑒于mm3954和3957顯示相同的親和力，比3609、3954高出100倍，在抑制靶點(diǎn)結(jié)合是至少有2倍以上的更高效率。下表中提供了c225重鏈和輕型鏈、mms和aa的序列。下表也提供了核苷酸和氨基酸序列。括號(hào)劃定了各種序列域之間的界限：(鏈接體)(mm)(鏈接體)(cm)(鏈接體)(ab)。表34：c225tda：親代抗體結(jié)合的百分比+在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的sem時(shí)間(小時(shí))3690aa3954aa3975aa3690/3579aa115.5±4.24.4±1.87.3±2.03.6±1.2219.3±6.06.0±2.09.3±2.82.1±0.6421.5±5.07.6±1.712.8±2.33.3±1.2827.6±7.49.7±0.414.9±0.033.0±1.62420.0±9.113.4±1.222.3±2.62.8±0.1egfrmm共有序列以下提供了egfrmms的共有序列。3690mm共有序列是一種主要的共有序列。實(shí)施例17：選擇性底物/cm的發(fā)現(xiàn)和測(cè)試一下部分是發(fā)現(xiàn)選擇性底物和測(cè)試一些典型的酶的過(guò)程。upa選擇性底物的發(fā)現(xiàn)從一個(gè)8eclips細(xì)菌庫(kù)中分離出upa選擇性底物，該細(xì)菌庫(kù)含有～108隨機(jī)8-mer表達(dá)成n末端融合在在大腸桿菌表面上的底物。用facs通過(guò)正負(fù)選擇交替輪富集優(yōu)化的底物用于upa裂解和耐脫靶絲氨酸蛋白酶klk5和7裂解。原生庫(kù)用8ug/mlupa在37℃孵育1小時(shí)，然后用sape(紅)和ypetmona(綠)標(biāo)記。upa裂解導(dǎo)致sape標(biāo)簽的損失，并允許從細(xì)菌表達(dá)未裂解肽(紅+綠)表達(dá)排序細(xì)菌表達(dá)的upa底物(綠色，陽(yáng)性選擇)。用facs對(duì)upa的底物進(jìn)行排序，將經(jīng)過(guò)富集的庫(kù)擴(kuò)增然后用5ng/mlklk5和7在37℃孵育1小時(shí)，用sape和ypetmona進(jìn)行標(biāo)記，用這些脫靶蛋白酶進(jìn)行缺乏裂解排序(紅+綠，陰性選擇)。將該庫(kù)擴(kuò)增，并用降低濃度的upa(4ug/ml,2ug/ml)和提高濃度的klk5and7(5ng/ml,10ng/ml)進(jìn)行4個(gè)額外的交替輪的正負(fù)facs排序。對(duì)每個(gè)最后3輪facs的單個(gè)克隆體進(jìn)行測(cè)序分析(表45)。然后對(duì)每一個(gè)來(lái)自共有序列的克隆體進(jìn)行upa濃度范圍的裂解分析，mmp-9、klk5和7和纖溶酶plasmin裂解特異性對(duì)脫靶蛋白酶裂解性分析。有代表性的數(shù)據(jù)顯示，對(duì)纖溶酶裂增加的解特異性，如表44所示。圖25顯示了，不像一個(gè)upa對(duì)照，底物sml6,kk1203,1204和1214顯示抗klk5、klk7和纖溶酶裂解。纖溶酶選擇性底物發(fā)現(xiàn)從第二代纖溶酶10eclips細(xì)菌庫(kù)分離纖溶酶選擇性底物，該庫(kù)含有隨機(jī)10-mer表達(dá)成n末端融合在在大腸桿菌表面上的底物。用facs通過(guò)正負(fù)選擇交替輪換富集優(yōu)化的底物用于纖溶酶裂解和耐脫靶基質(zhì)金屬蛋白酶(以mmp-9代表)。和絲氨酸蛋白酶(以klk5和klk7代表)裂解。第二代纖溶酶10eclips庫(kù)是基于一種室內(nèi)驗(yàn)證的共有序列，通過(guò)選擇8eclips快速裂解纖溶酶底物來(lái)濃縮低至30pm纖溶酶以便選擇。在l0mer內(nèi)的單個(gè)殘基是隨機(jī)的(n＝20)，限制的(l<n>20)或固定的(n＝l)偏離趨于共有序列的肽。同時(shí)允許不利脫靶序列中的選擇靈活性。第二代纖溶酶10eclips庫(kù)用300pm纖溶酶在37℃孵育1小時(shí)，接著用sape(紅)和ypetmona(綠)進(jìn)行標(biāo)記。纖溶酶裂解的結(jié)果導(dǎo)致sape標(biāo)簽損失，允許從細(xì)菌表達(dá)未裂解肽(紅+綠)排序中細(xì)菌表達(dá)纖溶酶底物(綠色，陽(yáng)性選擇)。從而用facs纖溶酶底物進(jìn)行了排序。對(duì)經(jīng)過(guò)富集庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，然后用80u/mlmmp-9在37℃孵育2小時(shí)，用sape和ypetmona做標(biāo)記，用這些脫靶蛋白酶進(jìn)行缺乏裂解排序(紅+綠，陰性選擇)。將該庫(kù)擴(kuò)增，并用纖溶酶(第三輪lpm或30pm,第五輪l00pm或300pm)和klk5和7(第四輪100ng/ml,第六輪200ng/ml)進(jìn)行4個(gè)額外的交替輪的正負(fù)facs排序。對(duì)每個(gè)最后2輪facs的單個(gè)克隆體進(jìn)行測(cè)序分析(表45)。然后對(duì)每一個(gè)來(lái)自共有序列的克隆體進(jìn)行纖溶酶裂解分析，mmp-9、klk5和klk7的裂解特異性對(duì)脫靶蛋白酶裂解性分析。有代表性的數(shù)據(jù)顯示，對(duì)纖溶酶裂增加的解特異性，如圖26所示。圖26顯示了，不像一個(gè)非優(yōu)化的底物，優(yōu)化的底物plasl237，plasl29和plas1254顯示抗klk5、klk7裂解。sm1231yvprvkalemupa酶活化的aa序列下表提供了upa酶激活抗vegf輕鏈aa的核苷酸和氨基酸序列。括號(hào)劃定了各種序列域之間的界限：(鏈接體)(mm)(鏈接體)(mm)(鏈接體)(ab)。纖溶酶激活的aa序列下表提供了纖溶酶激活抗-vegf輕鏈aa的核苷酸和氨基酸序列。括號(hào)劃定了各種序列域之間的界限：(鏈接體)(mm)(鏈接體)(cm)(鏈接體)(ab)。豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶-活化的aas天冬酰胺內(nèi)肽酶底物aanl和ptnl的序列為本專業(yè)所熟知(liu,etal.2003.cancerresearch63,2957-2964；mathieu,etal2002.molecularandbiochemicalparisitology121,99-105)。下表提供了天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的抗vegf輕鏈aa的核苷酸和氨基酸序列。括號(hào)劃定了各種序列域之間的界限：(鏈接體)(mm)(鏈接體)(cm)(鏈接體)(ab)。級(jí)聯(lián)激活aa下表提供了凋亡酶激活的抗-vegf輕鏈aa的核苷酸和氨基酸序列。括號(hào)界定了各種序列域之間的界限：(鏈接體)(mm)(鏈接體)(mm)(鏈接體)(ab)。凋亡酶底物、序列devd為本專業(yè)所熟知。天冬酰胺內(nèi)肽酶和級(jí)聯(lián)激活的aa表達(dá)載體的構(gòu)建在一個(gè)具有兩個(gè)步驟的過(guò)程中構(gòu)建底物。首先，這兩種產(chǎn)品用cx0325正向引物和底物特定的反向引物(cx0720aanl、cx0722ptnl、cx0724ptn和cx0758devd)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，另一個(gè)用cx0564反向引物和底物特定的前向引物正向引物(cx0721aanl、cx0723ptnl、cx0725ptn和cx0754devd)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。在兩種情況下pcr擴(kuò)增的底物是抗-vegfmmp-9306scfv。其次，兩種產(chǎn)品結(jié)合并用引物cx0325和cx0564進(jìn)行pcr擴(kuò)增。用ecori和xhol酶切位點(diǎn)將最終產(chǎn)品克隆到pfil2cl-抗-vegflc。豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶激活aas的表達(dá)和純化根據(jù)制造商協(xié)議(invitrogen公司)，使用脂質(zhì)體200(invitrogen公司)將3μgofpfilvegf-hl和3μgpfil2-306-底物-vegf-light共轉(zhuǎn)染到cho-s細(xì)胞(invitrogen公司)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在cho底物(invitrogen公司)中培養(yǎng)并選擇抗博萊霉素和殺稻瘟素。用有限稀釋法分離出單個(gè)克隆體并通過(guò)elisa為能夠結(jié)合egfr人igg表達(dá)選定單個(gè)克隆體。所有的抗體和aas使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用蛋白-a色譜純化。scfvaa消解試驗(yàn)說(shuō)明在測(cè)試緩沖液中將scfvaa稀釋到200nm，并加入2ug/ml在稀釋在測(cè)試緩沖液中稀釋的rhlegumain。消化物在室溫下孵育過(guò)夜。將iggaa在緩沖液稀釋到200nm，并加入緩沖液稀釋的rhlegumain，濃度為2-40mg/ml，rhlegumain的最終濃度lug/ml,5ug/ml,20ug/ml，5ug/ml，20ug/ml。消化物在37℃孵育過(guò)夜。消化后，激活的程度，通過(guò)aa與在elisa板上的vegf的結(jié)合程度測(cè)定，用抗-人類-fc實(shí)現(xiàn)可視化。圖27中的面板a顯示含有aanl和ptnl底物接著用5mg/ml天冬酰胺內(nèi)肽酶處理的scfvaas的激活。面板b顯示抗含有天冬酰胺內(nèi)肽酶底物pntl的vegfiggaa的激活。天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的aa的體內(nèi)穩(wěn)定性四個(gè)12周齡balb/c小鼠分別給予100微克的纖溶酶原激活的aa、aaplasvegf、或天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的aa、aaaanlvegf或aaptnlvegf之一的單次注射。在注射后15分鐘、1天、3天、7天收集血清。通過(guò)elisa法測(cè)量血清中的總?cè)祟恌c計(jì)算總aa濃度。從人的vegf結(jié)合elisa的測(cè)量計(jì)算激活抗體的濃度，如圖28所示。注射7天后從血清中分離出的天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的aa仍然保持掩蔽(n＝4)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，激活aa與總aa的比率是對(duì)動(dòng)物個(gè)體的測(cè)量的平均值，并以百分比表示，如圖28所示。而由纖維蛋白溶酶激活的aa在7天內(nèi)幾乎完全被激活。而兩種由天冬酰胺內(nèi)肽酶激活的aa僅最低限度地被激活。實(shí)施例18:aas的血清半衰期圖29顯示了一個(gè)掩蔽的單鏈抗體fv-fc融合的親代抗體表現(xiàn)出提高了的血清半衰期。一個(gè)掩蔽多肽被連接到一個(gè)抗體的n-末端，這樣掩蔽可以與抗體的結(jié)合點(diǎn)相互作用以提高熱力學(xué)穩(wěn)定性或阻礙中和抗體抗體。一種蛋白酶底物可用于在血清或特定組織中以不同速率清除這種掩蔽。圖30顯示，超過(guò)10天的健康小鼠的scfv-fc在血藥濃度。c57bi/6小鼠(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3)分別給予單劑量(150ug)抗vegfscfv-fc、aammpvegf(aa1)或aaplasmmvegf(aa2)。在指定的時(shí)間收集血清和用elisa法檢測(cè)總的scfv-fc濃度。aa的濃度在給予劑量7天后保持穩(wěn)定，而親代的scfv–fc濃度第3天后下降，并在10天后幾乎檢測(cè)不到。圖31顯示，與在荷瘤小鼠的親代scfv-fc相比，aa的scfv-fc濃度升高并在血清中維持較長(zhǎng)時(shí)間。相當(dāng)于單劑量抗vegfscfv-fc，aammpvegf(aa1)或aaplasmnvegf(aa2)給予苛有ht29異種移植(a)或mda-mb-231異種移植(b)的裸鼠。在指定的時(shí)間收集血清，用elisa法檢測(cè)總的scfv-fc濃度。在這兩項(xiàng)研究中，在3天(b)及3和7天(a)，在血清中檢測(cè)到與初始aa劑量相比的更高比例的濃度。圖32顯示了在一項(xiàng)多劑量研究研究中aa維持在較高的濃度：荷瘤balb/cnu/nu小鼠血注射5mg/kg親代vegfscfv-fc、aa1，沒(méi)3天2次或3次。在指定的時(shí)間收集血并用elisa法檢測(cè)aa的濃度，在整個(gè)研究過(guò)程中，所有三種aa比親代保持顯著的血清濃度。vegfscfv-fcsaa的氨基酸序列對(duì)比親代抗體，aa表現(xiàn)出提高了的血清半衰期。8個(gè)12周齡的balb/c小鼠分別給予100μgmmp激活的aa、aammpvegf、纖溶酶激活的aa，aaplasvegf或親代抗-vegf抗體ab–vegf進(jìn)行單次推注。在注射后15分鐘、8小時(shí)、1天、3天、7天、10天收集血清。通過(guò)elisa法測(cè)量血清中的總?cè)祟恌c計(jì)算總aa濃度。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以對(duì)動(dòng)物個(gè)體測(cè)量的平均和作為初始劑量的百分比表示的總aa濃度如圖33所示。氨基酸和親代抗體的分布類似并符合預(yù)期。在15分鐘達(dá)到一個(gè)高和相等的濃度并在第一天分布到組織中。與超過(guò)10天后親代抗體幾乎完全消除相比，在試驗(yàn)期間兩種aa在血清中的濃度都保持在較高水平。實(shí)施例19：基于aa供給的副作用降低被典型地供給一種傳統(tǒng)egfr抗體治療時(shí)，大于80％的患者在人體最大的器官皮膚上表現(xiàn)出毒性。當(dāng)患者供給直接對(duì)抗egfr的aa時(shí)，預(yù)計(jì)對(duì)皮膚有很小或沒(méi)有毒性，因?yàn)槿狈膊√禺愋詂m，aa將在皮膚中不被激活。因此，預(yù)計(jì)，aa的抗-egfrab將不能與egfr的靶點(diǎn)特異性結(jié)合。此外，預(yù)計(jì)在這樣的患者中，因?yàn)閍a不會(huì)在皮膚中激活，aa將不會(huì)被隔離，并預(yù)期，aa將保持高水平的血藥濃度，從而提高了aa在病變組織中的濃度，有效地提高有效劑量?；诩膊〉沫h(huán)境，cm在病變組織中水解將導(dǎo)致一個(gè)激活的aa，允許解掩蔽及ab與egfr靶點(diǎn)的特異性結(jié)合，并會(huì)導(dǎo)致理想的治療效果。雖然用針對(duì)具體實(shí)施例的參考文獻(xiàn)對(duì)本發(fā)明經(jīng)了描述。本專業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不離開(kāi)本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍的情況下，可以提出各種變化和等價(jià)替換。此外，也可提出許多修改，以適應(yīng)特定情況下、材料、物質(zhì)的組成、過(guò)程、一個(gè)或多個(gè)過(guò)程步驟或步驟、本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有這些修改的目的均在所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12