本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種美拉諾坦Ⅰ的制備方法。
背景技術(shù)：
：α-MSH(黑色素細(xì)胞刺激激素)是一種能夠使黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素的激素，主要是在腦垂體中產(chǎn)生，此外亦可在皮膚、胃腸道、性腺等外周部位產(chǎn)生，能控制生物體皮膚和毛發(fā)的顏色?，F(xiàn)大量研究已證實(shí)它的受體分子在性喚起、催化黑色素的合成以及降低食欲中起著重要作用，由此可以治療性功能障礙、刺激皮膚產(chǎn)生黑色素抵抗紫外線灼傷以及肥胖等疾病。2014年12月22日，Clinuvel公司開(kāi)發(fā)的光損傷保護(hù)藥Afamelanotide(商品名：Scenesse)獲得歐盟批準(zhǔn)上市。Afamelanotide為化學(xué)合成的人α-MSH類(lèi)似物。Afamelanotide中文名為美拉諾坦Ⅰ，分子量1646.85，是一種含13個(gè)氨基酸的多肽分子，其結(jié)構(gòu)如下：目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于美拉諾坦Ⅰ合成工藝的報(bào)道均較少：PNAS77(10)：5754-5758中采用Boc法進(jìn)行固相合成，工藝操作復(fù)雜，危險(xiǎn)性高，不適宜進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)；專(zhuān)利CN102816211B公開(kāi)了一種以Fmoc固相合成法逐一偶聯(lián)保護(hù)氨基酸制備美拉諾坦Ⅰ的方法，該方法合成過(guò)程中容易發(fā)生第6位氨基酸His和第7位氨基酸D-Phe消旋化，生成對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)，且在后續(xù)純化過(guò)程中很難除去，導(dǎo)致產(chǎn)品總收率低。綜上所述，目前報(bào)道的美拉諾坦Ⅰ合成方法中，Boc固相合成法需要使用高腐蝕性的氫氟酸，生產(chǎn)過(guò)程危險(xiǎn)系數(shù)高；采用Fmoc固相合成法逐一偶聯(lián)保護(hù)氨基酸進(jìn)行合成，合成過(guò)程容易產(chǎn)生對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)，并且該雜質(zhì)難除去，以致總收率偏低，僅有60％，且純度也僅為83％，不適宜進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述美拉諾坦Ⅰ合成過(guò)程中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種美拉諾坦Ⅰ的制備方法：首先采用液相合成法制備三肽片段：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH；然后采用Fmoc固相合成法向載體樹(shù)脂上依次偶聯(lián)保護(hù)氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、三肽片段、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，然后進(jìn)行N端乙酰化反應(yīng)制得拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂，經(jīng)裂解反應(yīng)后制得美拉諾坦Ⅰ粗肽，純化精制后得美拉諾坦Ⅰ精肽。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：一種美拉諾坦Ⅰ的制備方法，包括如下步驟：(a)液相合成法制備三肽片段：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH；(b)采用Fmoc固相合成法向載體樹(shù)脂上依序偶聯(lián)保護(hù)氨基酸及步驟(a)中的三肽片段，并進(jìn)行N端乙?；?，制備美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂；(c)美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂經(jīng)裂解反應(yīng)制備美拉諾坦Ⅰ粗肽；(d)美拉諾坦Ⅰ粗肽經(jīng)純化過(guò)程制備美拉諾坦Ⅰ精肽。其中步驟(a)中，三肽片段Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH的制備過(guò)程包括以下過(guò)程：(1)制備Fmoc-His(Trt)-OSu：將Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu溶于有機(jī)溶劑中，然后向其中滴加DCC的有機(jī)溶劑溶液，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，濃縮反應(yīng)液，向濃縮液中加入5～6倍體積的石油醚，析出白色固體，抽濾，濾餅以乙酸乙酯重新溶解至濃縮后體積，加入5～6倍體積石油醚，析晶，抽濾，真空干燥濾餅，得Fmoc-His(Trt)-OSu；其中Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu的摩爾比為1:1.0～1.2；Fmoc-His(Trt)-OH和DCC的摩爾比為1:1.0～1.2；(2)制備Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH：將H-D-Phe-OH和碳酸鈉溶于水中，加入Fmoc-His(Trt)-OSu的有機(jī)溶劑溶液，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾，向?yàn)V液中加入飽和檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，濃縮后加入5～6倍體積石油醚析晶得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH；其中H-D-Phe-OH和碳酸鈉的摩爾比為1：1～2；H-D-Phe-OH和Fmoc-His(Trt)-OSu的摩爾比為1:1.1～1.5；(3)制備Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu：將Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH和HOSu溶于有機(jī)溶劑中，然后向其中滴加DCC的有機(jī)溶劑溶液，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)；反應(yīng)結(jié)束后抽濾，濃縮反應(yīng)液，向濃縮液中加入5～6倍體積的石油醚，析出白色固體，抽濾，濾餅以乙酸乙酯重新溶解至濃縮后體積，加入5～6倍體積石油醚，析晶，抽濾，真空干燥濾餅，得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu，其中Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH和HOSu的摩爾比為1:1.0～1.2；Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH和DCC的摩爾比為1:1.0～1.2；(4)制備Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH：將H-Arg(Pbf)-OH和碳酸鈉溶于水中，加入Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu的有機(jī)溶劑溶液，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾，向?yàn)V液中加入飽和檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，濃縮后加入5～6倍體積石油醚析晶得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH；其中H-Arg(Pbf)-OH和碳酸鈉的摩爾比為1：1～2；H-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu的摩爾比為1:1.1～1.5。其中有機(jī)溶劑為四氫呋喃、二氧六環(huán)、丙酮中的一種或一種以上的混合液。步驟(b)中，載體樹(shù)脂為替代度為0.3-1.0mmol/g的RinkAmideresin或RinkAmideAMresin。步驟(b)中，美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂的制備過(guò)程為：(1)保護(hù)氨基酸Fmoc-Val-OH在縮合試劑的作用下與載體樹(shù)脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，制備Fmoc-Val-RinkAmideresin或Fmoc-Val-RinkAmideAMresin；(2)依次偶聯(lián)保護(hù)氨基酸Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、三肽片段Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，然后進(jìn)行N端乙?；磻?yīng)，制得美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂。步驟(b)中的反應(yīng)都是以2-5倍的投料比加入保護(hù)氨基酸或三肽片段進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，每一個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)均是在縮合試劑的存在下進(jìn)行的固相接肽反應(yīng)，每一步偶聯(lián)反應(yīng)均以Kaiser試劑檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)完畢后用脫保護(hù)試劑脫除Fmoc，再與下一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。優(yōu)選的，脫保護(hù)試劑為哌啶與DMF體積比1:4組成的混合溶液；縮合試劑為DIC/HOBt、DIC/HOAt、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HATU/HOAt/DIEA中的一種。優(yōu)選的，N端乙酰化反應(yīng)為：配制乙酸酐/DIEA/DCM或乙酸酐/吡啶/DCM的混合溶液作為封端試劑，加入到肽樹(shù)脂反應(yīng)器中，攪拌反應(yīng)1-3h；乙酸酐、吡啶、DIEA的用量為合成規(guī)模的5-30倍摩爾量，DCM用量為乙酸酐的2倍體積。步驟(c)中，美拉諾坦Ⅰ粗肽的制備過(guò)為：將美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂加入到裂解液中，在15～30℃下，裂解反應(yīng)2～5h，反應(yīng)結(jié)束，將裂解液過(guò)濾到甲基叔丁基醚或乙醚中沉降并洗滌，離心收集沉淀，真空干燥后得美拉諾坦Ⅰ粗肽。其中裂解液為加入體積比1-5％清除劑的TFA溶液，清除劑為苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巰基乙醇、苯酚、水中的一種或幾種。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：液相法制備三肽片段：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH，相比于固相合成法，能夠避免合成過(guò)程中第6位His和第7位D-Phe發(fā)生消旋化，產(chǎn)生難以除去的對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)，使產(chǎn)品總純度達(dá)到99.5％以上，對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)[6-D-His]-美拉諾坦Ⅰ和[7-Phe]-美拉諾坦Ⅰ含量均小于0.1％，總收率大于60％，大大提高了終產(chǎn)品純度及收率降低了生產(chǎn)成本。說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的縮寫(xiě)含義如下：Fmoc9-芴甲氧羰基RinkAmideAMresinRinkAmideAM樹(shù)脂RinkAmideresinRinkAmide樹(shù)脂DCM二氯甲烷DMFN,N-二甲基甲酰胺DIEAN,N-二異丙基乙胺DICN,N-二異丙基碳二亞胺HOBt1-羥基苯并三唑HOAtN-羥基-7-偶氮苯并三氮唑HBTU苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯TBTU苯并三唑四甲基四氟硼酸TFA三氟乙酸HOSuN-羥基琥珀酰亞胺DCC二環(huán)己基碳二亞胺BOC叔丁氧羰基TIS三異丙基硅烷具體實(shí)施方式下面用具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但不限定本專(zhuān)利；根據(jù)本發(fā)明改變?cè)系耐读媳?，或是反?yīng)溶劑或及縮合劑等，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1：Fmoc-His(Trt)-OSu的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取Fmoc-His(Trt)-OH929.6g(1.5mol)和HOSu189.9g(1.65mol)溶于2.5L四氫呋喃中，低溫(0℃)攪拌。準(zhǔn)確稱(chēng)取DCC340.4g(1.65mol)，溶于1L四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完成后，抽濾，濃縮反應(yīng)液至900-1000mL，向濃縮液中加入5L石油醚，析出白色固體，溶液-20℃靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以1L乙酸乙酯溶解，加入5L石油醚，析晶，抽濾，濾餅真空干燥后，得Fmoc-His(Trt)-OSu949.4g，純度99.8％，收率88.3％。實(shí)施例2：Fmoc-His(Trt)-OSu的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取Fmoc-His(Trt)-OH743.7g(1.2mol)和HOSu165.7g(1.44mol)溶于3L二氧六環(huán)中，低溫(0℃)攪拌。準(zhǔn)確稱(chēng)取DCC297.1g(1.44mol)，溶于1.5L四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完成后，抽濾，濃縮反應(yīng)液至1500mL，向濃縮液中加入7.5L石油醚，析出白色固體，溶液-20℃靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以1.5L乙酸乙酯溶解，加入7.5L石油醚，析晶，抽濾，濾餅真空干燥后，得Fmoc-His(Trt)-OSu738.0g，純度99.8％，收率85.8％。實(shí)施例3：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取H-D-Phe-OH99.1g(0.6mol)和碳酸鈉122.4g(1.2mol)溶于1.2L水中，低溫(0℃)下緩慢加入實(shí)施例2中所得Fmoc-His(Trt)-OSu645.1g(0.9mol)的四氫呋喃溶液2.5L，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，過(guò)濾，低溫(0℃)下向?yàn)V液中加入飽和檸檬酸水溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至2～3，析出白色固體，抽濾，濾餅用水洗滌3次，干燥后用1.5L乙酸乙酯重新溶解，加入7L石油醚析晶，過(guò)濾，抽干，真空干燥得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH399.9g，純度99.8％，收率86.9％。實(shí)施例4：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取H-D-Phe-OH165.2g(1.0mol)和碳酸鈉116.6g(1.1mol)溶于2L水中，低溫(0℃)下緩慢加入實(shí)施例1中所得Fmoc-His(Trt)-OSu788.5g(1.1mol)的四氫呋喃溶液4L，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，過(guò)濾，低溫(0℃)下向?yàn)V液中加入飽和檸檬酸水溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至2～3，析出白色固體，抽濾，濾餅用水洗滌3次，干燥后用2L乙酸乙酯重新溶解，加入10L石油醚析晶，過(guò)濾，抽干，真空干燥得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH671.0g，純度99.8％，收率87.5％。實(shí)施例5：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取實(shí)施例4中所得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH536.8g(0.7mol)和HOSu96.7g(0.84mol)溶于1800mL二氧六環(huán)中，低溫(0℃)攪拌。準(zhǔn)確稱(chēng)取DCC173.3g(0.84mol)，溶于500mL四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完成后，抽濾，濃縮反應(yīng)液至700-800mL，向濃縮液中加入4L石油醚，析出白色固體，溶液-20℃靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以700mL乙酸乙酯溶解，加入3.5L石油醚，析晶，抽濾，濾餅真空干燥后，得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu532.1g，純度99.8％，收率86.5％。實(shí)施例6：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取實(shí)施例3中所得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH306.8g(0.4mol)和HOSu50.6g(0.44mol)溶于1200mL四氫呋喃中，低溫(0℃)攪拌。準(zhǔn)確稱(chēng)取DCC90.8g(0.44mol)，溶于300mL四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完成后，抽濾，濃縮反應(yīng)液至400～500mL，向濃縮液中加入2.5L石油醚，析出白色固體，溶液-20℃靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以400mL乙酸乙酯溶解，加入2L石油醚，析晶，抽濾，濾餅真空干燥后，得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu310.0g，純度99.8％，收率89.7％。實(shí)施例7：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取H-Arg(Pbf)-OH92.5g(0.2mol)和碳酸鈉42.4g(0.4mol)溶于400mL水中，低溫(0℃)下緩慢加入實(shí)施例6中所得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu259.2g(0.3mol)的四氫呋喃溶液1L，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，過(guò)濾，低溫(0℃)下向?yàn)V液中加入飽和檸檬酸水溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至2～3，析出白色固體，抽濾，濾餅用水洗滌3次，干燥后用1L乙酸乙酯重新溶解，加入5L石油醚析晶，過(guò)濾，抽干，真空干燥得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH206.4g，純度99.8％，收率87.8％。實(shí)施例8：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取H-Arg(Pbf)-OH231.3g(0.5mol)和碳酸鈉58.3g(0.55mol)溶于1L水中，低溫(0℃)下緩慢加入實(shí)施例5中所得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu475.2g(0.55mol)的四氫呋喃溶液2.5L，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，過(guò)濾，低溫(0℃)下向?yàn)V液中加入飽和檸檬酸水溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至2～3，析出白色固體，抽濾，濾餅用水洗滌3次，干燥后用3L乙酸乙酯重新溶解，加入15L石油醚析晶，過(guò)濾，抽干，真空干燥得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH508.9g，純度99.8％，收率86.6％。實(shí)施例9：Fmoc-Val-RinkAmideresin的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取RinkAmideresin55.6g(樹(shù)脂初始替代度為0.90mmol/g，合成規(guī)模為50mmol)置于合成柱中，用500mLDMF洗滌兩次，加入500mLDCM溶脹30min；抽濾掉DCM后，加入Fmoc-Val-OH/DIC/HOBt的混合溶液[稱(chēng)取Fmoc-Val-OH33.9g(100mmol)和14.9g(110mmol)HOBt置于溶解瓶中，加入250mlDMF溶液攪拌溶解，低溫(0℃)下加入17.0ml(110mmol)DIC，活化5min]，攪拌反應(yīng)3h，抽掉反應(yīng)液，用500mLDMF洗滌3次，然后再用DCM、甲醇各洗滌3次，真空干燥后得Fmoc-Val-RinkAmideresin60.9g。實(shí)施例10：Fmoc-Val-RinkAmideAMresin的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取RinkAmideAMresin108.7g(樹(shù)脂初始替代度為0.92mmol/g，合成規(guī)模為100mmol)置于合成柱中，用900mLDMF洗滌兩次，加入900mLDCM溶脹30min；抽濾掉DCM后，加入Fmoc-Val-OH/DIC/HOBt的混合溶液[稱(chēng)取Fmoc-Val-OH101.8g(300mmol)和44.6(330mmol)HOBt置于溶解瓶中，加入900mlDMF溶液攪拌溶解，低溫(0℃)下加入51.1ml(330mmol)DIC，活化5min]，攪拌反應(yīng)4h，抽掉反應(yīng)液，用900mLDMF洗滌3次，然后再用DCM、甲醇各洗滌3次，真空干燥后得Fmoc-Val-RinkAmideAMresin118.9g。實(shí)施例11：美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂的制備將實(shí)施例9中的Fmoc-Val-RinkAmideresin60.9g(合成規(guī)模50mmol)置于合成柱中，加入500mLDCM溶脹30min；抽濾掉DCM后，500mLDMF洗滌2次，加入20％哌啶/DMF溶液500mL脫保護(hù)2次，分別反應(yīng)10min和10min；然后用DMF洗滌6次，每次500mL；稱(chēng)取Fmoc-Pro-OH33.7g(100mmol)、HOAt14.9g(110mmol)用1LDMF溶解，低溫(0℃)中預(yù)冷15-20min，然后加入DIC17.0ml(110mmol)活化5min，將溶液加入到樹(shù)脂中，反應(yīng)2h，反應(yīng)終點(diǎn)以Kaiser試劑檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)后，抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌6次，每次500mL；隨后再脫保護(hù)。如此反復(fù)循環(huán)操作，依次偶聯(lián)Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH，配制1600mL乙?；噭?400ml乙酸酐、350ml吡啶和850mlDMF混合溶液)，加入到反應(yīng)柱中，反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束，樹(shù)脂用DMF、DCM和甲醇分別洗滌3次，每次500mL，真空干燥得美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂195.5g實(shí)施例12：美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂的制備將實(shí)施例10中的Fmoc-Val-RinkAmideresin118.9g(合成規(guī)模100mmol)置于合成柱中，加入900mLDCM溶脹30min；抽濾掉DCM后，900mLDMF洗滌2次，加入20％哌啶/DMF溶液900mL脫保護(hù)2次，分別反應(yīng)10min和10min；然后用DMF洗滌6次，每次900mL；稱(chēng)取Fmoc-Pro-OH101.2g(300mmol)、HOBt44.6g(330mmol)用1LDMF溶解，低溫(0℃)中預(yù)冷15-20min，然后加入DIC51.1ml(330mmol)活化5min，將溶液加入到樹(shù)脂中，反應(yīng)2h，反應(yīng)終點(diǎn)以Kaiser試劑檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)后，抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌6次，每次900mL；隨后再脫保護(hù)。如此反復(fù)循環(huán)操作，依次偶聯(lián)Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH，配制800mL乙?；噭?200ml乙酸酐、175ml吡啶和425mlDMF混合溶液)，加入到反應(yīng)柱中，反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束，樹(shù)脂用DMF、DCM和甲醇分別洗滌3次，每次900mL，真空干燥得美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂385.6g。實(shí)施例13：美拉諾坦Ⅰ粗肽的制備將實(shí)施例11得到的195.5g美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂(50mmol)，加入到預(yù)冷的1.5L裂解液(體積配比為T(mén)FA/TIS/苯酚/苯甲硫醚/H2O＝85/2.5/2.5/5/5)中，室溫下攪拌反應(yīng)3h；裂解反應(yīng)結(jié)束，過(guò)濾樹(shù)脂，100mlTFA洗滌樹(shù)脂2次，合并濾液和洗液，旋蒸濃縮至1L，濃縮液倒入10L預(yù)冷的叔丁基甲醚中，析出白色沉淀，靜置1h后，過(guò)濾，叔丁基甲醚洗滌6次，真空干燥得美拉諾坦Ⅰ粗肽85.6g，收率104.0％，純度80.5％。實(shí)施例14：美拉諾坦Ⅰ粗肽純化精制將實(shí)施例13中的美拉諾坦Ⅰ粗肽85.6g，采用內(nèi)徑為100mm的C18制備柱，流動(dòng)相A為0.1％TFA/水，流動(dòng)相B為0.1％TFA/乙腈，上樣量為10g/針，流速300ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，梯度洗脫，峰前和峰后循環(huán)進(jìn)樣，得到中控分析純度為98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水體系轉(zhuǎn)鹽后凍干得美拉諾坦Ⅰ50.3g，純度99.5％，對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)[6-D-His]-美拉諾坦Ⅰ含量為0.07％，[7-Phe]-美拉諾坦Ⅰ含量為0.01％，總收率為61.1％。實(shí)施例15：美拉諾坦Ⅰ粗肽的制備將實(shí)施例12得到的385.6g美拉諾坦Ⅰ肽樹(shù)脂(100mmol)，加入到冷凍的3L裂解液(體積配比為T(mén)FA/TIS/苯酚/苯甲硫醚/H2O＝85/2.5/2.5/5/5)中，室溫下攪拌反應(yīng)4h；裂解反應(yīng)結(jié)束，過(guò)濾樹(shù)脂，300mlTFA洗滌樹(shù)脂2次，合并濾液和洗液，旋蒸濃縮至2L，濃縮液倒入20L預(yù)冷叔丁基甲醚中，析出白色沉淀；靜置1h后，過(guò)濾，叔丁基甲醚洗滌6次，真空干燥得美拉諾坦Ⅰ粗肽176.4g，收率107.1％，純度80.3％。實(shí)施例16：美拉諾坦Ⅰ粗肽純化精制將實(shí)施例15中的美拉諾坦Ⅰ粗肽176.4g，采用內(nèi)徑為100mm的C18制備柱，流動(dòng)相A為0.1％TFA/水，流動(dòng)相B為0.1％TFA/乙腈，上樣量為10g/針，流速300ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，梯度洗脫，峰前和峰后循環(huán)進(jìn)樣，得到中控分析純度為98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水體系轉(zhuǎn)鹽后凍干得美拉諾坦Ⅰ108.2g，純度99.6％，對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)[6-D-His]-美拉諾坦Ⅰ含量為0.02％，[7-Phe]-美拉諾坦Ⅰ含量為0.03％，總收率為65.7％。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3