本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與植物抗逆性相關(guān)蛋白GsNAC019及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鹽堿逆境制約我國東北地區(qū)乃至全國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，其中，堿脅迫是影響植物生長、發(fā)育和地理分布的重要環(huán)境限制因素，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。開發(fā)利用鹽堿地，挖掘逆境農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)生產(chǎn)潛力，是保持我國農(nóng)業(yè)持續(xù)高效發(fā)展、保證我國糧食安全亟待解決的重大問題。而迄今植物耐堿分子機(jī)制研究鮮有報(bào)道。大豆是我國尤其是黑龍江省的一種重要作物，既提供蛋白，又提供油料，其與固氮菌的共生關(guān)系使它成為輪作系統(tǒng)中的一種高利潤作物。大豆在馴化過程中，栽培種丟失了很多與環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的重要基因，因此栽培大豆具有的遺傳多樣性比野生大豆低很多，比如很多栽培大豆對(duì)鹽堿很敏感，而野生大豆則對(duì)鹽堿有很強(qiáng)的適應(yīng)性。所以將野生大豆中能夠適應(yīng)某一特定環(huán)境的基因重新引入到栽培大豆中，是大豆品種改良的快捷方法。這種將野生種優(yōu)良性狀基因轉(zhuǎn)入到栽培種從而加速作物改良的策略已經(jīng)在多種作物育種研究中獲得成功。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，利用日趨成熟的基因工程技術(shù)培育具有優(yōu)良性狀及良好耐逆功能的作物新品種已成為現(xiàn)代作物改良的重要手段之一。而轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，單基因的表達(dá)就可以啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，激活下游眾多脅迫相關(guān)功能基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而達(dá)到更顯著的改良作物抗逆性的效果。因此，挖掘抗逆轉(zhuǎn)錄因子基因，將為作物轉(zhuǎn)基因育種提供功能更加顯著的基因資源。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控植物抗逆性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了與植物抗逆性相關(guān)蛋白，本發(fā)明所提供的與植物抗逆性相關(guān)蛋白的名稱為GsNAC019蛋白質(zhì)，GsNAC019蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。其中，序列2由343個(gè)氨基酸殘基組成。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列1第46-1077位所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與GsNAC019蛋白相關(guān)的生物材料。本發(fā)明提供的與GsNAC019蛋白相關(guān)的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：A1)編碼GsNAC019蛋白質(zhì)的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述相關(guān)生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列1第46-1077位所示的cDNA分子或基因組DNA分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼GsNAC019蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼GsNAC019蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼GsNAC019蛋白的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有編碼GsNAC019蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GsNAC019蛋白且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述生物材料中，A2)所述的含有編碼GsNAC019蛋白的核酸分子的表達(dá)盒(GsNAC019基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)GsNAC019蛋白的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)GsNAC019轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止GsNAC019轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S：來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國專利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國專利5，057,422)；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128(CN101063139B(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動(dòng)子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcSE9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述GsNAC019基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptII基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了GsNAC019蛋白或上述相關(guān)生物材料的新用途。本發(fā)明提供了GsNAC019蛋白或上述相關(guān)生物材料在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了GsNAC019蛋白或上述相關(guān)生物材料在作為轉(zhuǎn)錄激活因子中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了GsNAC019蛋白或上述相關(guān)生物材料在培育抗逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為提高。上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗堿脅迫；所述抗堿脅迫具體為抗NaHCO3脅迫，體現(xiàn)為在7mM或150mMNaHCO3脅迫的條件下：轉(zhuǎn)基因植物的根長長于受體植物，或轉(zhuǎn)基因植物的葉綠素含量高于受體植物，或轉(zhuǎn)基因植物的存活率高于受體植物，或轉(zhuǎn)基因植物的堿脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量高于受體植物；所述堿脅迫相關(guān)基因具體為H+-ATPase基因和/或RD29A基因和/或KIN基因。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明最后提供了一種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括在受體植物中過表達(dá)GsNAC019蛋白質(zhì)，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述受體植物。上述方法中，所述過表達(dá)的方法為將GsNAC019蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w植物；所述GsNAC019蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述GsNAC019蛋白的編碼基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)是通過pCAMBIA330035Su載體導(dǎo)入受體植物，所述pCAMBIA330035Su載體為在pCAMBIA330035Su載體的PacⅠ和Nt.BbvCI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間插入了如序列表中序列1所示的GsNAC019基因。pCAMBIA330035Su載體表達(dá)序列2所示的GsNAC019蛋白。上述方法中，所述抗逆性為抗堿脅迫。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述受體植物體現(xiàn)在如下(1)-(4)中任一種：(1)轉(zhuǎn)基因植物的根長長于受體植物；(2)轉(zhuǎn)基因植物的葉綠素含量高于受體植物；(3)轉(zhuǎn)基因植物的存活率高于受體植物；(4)轉(zhuǎn)基因植物的堿脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量高于受體植物；所述堿脅迫相關(guān)基因具體為H+-ATPase基因和/或RD29A基因和/或KIN基因。上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體可為豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、苜?；蛩S皮；所述十字花科植物可為擬南芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述擬南芥可為擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型col-0)。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述GsNAC019基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。擴(kuò)增編碼上述GsNAC019蛋白的核酸分子全長或其片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明從東北白城地區(qū)重度鹽堿土地采集到了數(shù)百份東北野生大豆(GlycinesojaL.)，其具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，其優(yōu)質(zhì)基因資源豐富，是抗逆基因克隆的理想材料，并從野生大豆中克隆到一種與植物抗逆性相關(guān)的GsNAC019基因。通過實(shí)驗(yàn)證明，將GsNAC019基因超表達(dá)于擬南芥中，得到的轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥對(duì)碳酸鹽脅迫的耐性明顯高于野生型擬南芥，說明GsNAC019蛋白具有調(diào)控植物耐堿性的功能，可以為培育具有碳酸鹽脅迫耐性的轉(zhuǎn)基因植物的研究奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1為野生大豆根和葉中的GsNAC019基因在50mMNaHCO3(pH8.5)和200mMNaCl脅迫處理下的表達(dá)模式。其中，圖1a為野生大豆葉中的GsNAC019基因在50mMNaHCO3(pH8.5)脅迫處理下的表達(dá)模式；圖1b為野生大豆根中的GsNAC019基因在50mMNaHCO3(pH8.5)脅迫處理下的表達(dá)模式；圖1c為野生大豆根中的GsNAC019基因在200mMNaCl脅迫處理下的表達(dá)模式。圖2為GsNAC019基因的亞細(xì)胞定位分析。圖3為酵母細(xì)胞中GsNAC019基因的轉(zhuǎn)錄激活活性分析。圖4為利用酵母單雜分析GsNAC019基因的結(jié)合元件。圖5為轉(zhuǎn)GsNAC019基因擬南芥在堿脅迫下的表型分析。圖5a和圖5b為轉(zhuǎn)GsNAC019基因擬南芥在7mMNaHCO3處理下的幼苗期表型及根長測(cè)定；圖5c、圖5d和圖5e為轉(zhuǎn)GsNAC019基因擬南芥在150mMNaHCO3處理下的成苗期表型、葉綠素含量和存活率的統(tǒng)計(jì)分析。其中，6#、16#和22#均為T3代轉(zhuǎn)GsNAC019基因擬南芥，WT為野生型擬南芥。圖6為轉(zhuǎn)GsNAC019基因擬南芥中各堿脅迫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中的野生大豆G07256種子在文獻(xiàn)“MingzheSun,XiaoliSun,YangZhao,HuaCai,ChaoyueZhao,WeiJi,HuiziDuanMu,YangYu,YanmingZhu.EctopicexpressionofGsPPCK3andSCMRPinMedicagosativaenhancesplantalkalinestresstoleranceandmethioninecontent.PLOSONE2014,9(2):e89578”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AH109在文獻(xiàn)“孫曉麗；段小紅；才華；李勇；柏錫；紀(jì)??；季佐軍；朱延明利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與AtbZIP1相互作用的蛋白質(zhì)。中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010，26(11)1050-1058”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的酵母菌Y187在文獻(xiàn)“LiangYang,WeiJi,YanmingZhu,PengGao,YongLi,HuaCai,XiBaiandDianjingGuo.GsCBRLK,acalcium/calmodulin-bindingreceptor-likekinase,isapositiveregulatorofplanttolerancetosaltandABAstress,journalofexperimentalbotany.201061(9)2519–2533,”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Columbia-0亞型)在文獻(xiàn)“KimH,HyunY,ParkJ,ParkM,KimM,KimH,LeeM,MoonJ,LeeI,KimJ.AgeneticlinkbetweencoldresponsesandfloweringtimethroughFVEinArabidopsisthaliana.NatureGenetics.2004,36:167-171”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的pGBKT7載體在文獻(xiàn)“XiaoLuo,NaCui,YanmingZhu,LeiCao,HongZhai,HuaCai,WeiJi,XuedongWang,DanZhu,YongLi,XiBaiOver-expressionofGsZFP1,anABA-responsiveC2H2-typezincfingerproteinlackingaQALGGHmotif,reducesABAsensitivityanddecreasesstomatasize.JournalofPlantPhysiology169(12)；1192-1202”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的pGBKT7-DREB載體在文獻(xiàn)XiaoLuo,XiBai,XiaoliSun,DanZhu,BaohuiLiu,WeiJi,HuaCai,LeiCao,JingWu,MengranHu,XinLiu,LiliTangandYanmingZhu.ExpressionofwildsoybeanWRKY20inArabidopsisenhancesdroughttoleranceandregulatesABAsignaling.JournalofExperimentalBotany,2013,64(8).2155–2169”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的pGADT7載體在文獻(xiàn)“LiangYang,WeiJi,YanmingZhu,PengGao,YongLi,HuaCai,XiBaiandDianjingGuo.GsCBRLK,acalcium/calmodulin-bindingreceptor-likekinase,isapositiveregulatorofplanttolerancetosaltandABAstress,journalofexperimentalbotany.201061(9)2519–2533,”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的pBSK-35S-eGFP載體在文獻(xiàn)“XiaoliSun,WeiJi,XiaodongDing,XiBai,HuaCai,ShanshanYang,XueQian,MingzheSun,YanmingZhu.GsVAMP72,anovelGlycinesojaR-SNAREprotein,isinvolvedinregulatingplantsalttoleranceandABAsensitivity.PlantCellTissOrganCult2013,113:199–215”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的pCAMBIA330035Su載體在文獻(xiàn)“XiaoliSun,WeiJi,XiaodongDing,XiBai,HuaCai,ShanshanYang,XueQian,MingzheSun,YanmingZhu.GsVAMP72,anovelGlycinesojaR-SNAREprotein,isinvolvedinregulatingplantsalttoleranceandABAsensitivity.PlantCellTissOrganCult2013,113:199–215”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的農(nóng)桿菌LBA4404在文獻(xiàn)“AilinLiu,YangYu,XiangboDuan,XiaoliSun,HuiziDuanmu,YanmingZhu.GsSKP21,aGlycinesojaSphasekinaseassociatedprotein,mediatestheregulationofplantalkalinetoleranceandABAsensitivity.PlantMolBiol(2015)87:111–124”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。實(shí)施例1、大豆轉(zhuǎn)錄因子GsNAC019基因的克隆1、植物材料的處理挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理10min以去除蠟質(zhì)膜，倒凈濃H2SO4，用無菌水沖洗3～4遍后放置于濕潤的濾紙上，25℃暗培養(yǎng)3d催芽，待芽長到約1～2cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到盛有霍格蘭培養(yǎng)液的缽中，用太空棉固定，使芽浸入培養(yǎng)液中，并將其放置于人工氣候箱中培養(yǎng)。待幼苗長至3周齡，取其根部3cm放入EP管中，置于-80℃保存。2、RNA提取采用RNApreppure試劑盒(TRANSGENBIOTECH)提取上述步驟1獲得的3周齡野生大豆幼苗的根的總RNA。3、cDNA的獲得以上述步驟2獲得的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。4、PCR擴(kuò)增以上述步驟3或獲得的cDNA為模板，采用Primer-KS和Primer-KAS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下：Primer-KS：5’-CAGTGGTTCTTTTCCTTCTGAGA-3’；Primer-KAS：5’-AAGAATCCCCACCTATTTACACC-3’。PCR擴(kuò)增體系(50μl)：cDNA4μl，10×PSbuffer(Mg2+)10μl，dNTPMixture(2.5mM)4μl，Primer-F1μl，Primer-R1μl，PrimeSTARDNAPolymerase(TaKaRa)0.5μl，ddH2O29.5μl。PCR擴(kuò)增條件為：98℃8min；98℃10s，60℃10s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃終止。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到分子量略大于1Kb的條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TRANSGENBIOTECH)回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將其與pEASY-BluntZero載體(TRANSGENBIOTECH)連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pEASY-BluntZero-GsNAC019，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后送交測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增得到大小為1145bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將其命名為GsNAC019基因，ORF為序列1的第46-1077位，GsNAC019基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。實(shí)施例2、野生大豆轉(zhuǎn)錄因子GsNAC019基因的表達(dá)特性分析一、野生大豆根和葉中的GsNAC019基因在堿脅迫處理下不同時(shí)間的表達(dá)模式分析1、植物材料的處理挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理10min以去除泥膜，倒凈濃H2SO4，用無菌水沖洗3～4遍后放置于濕潤的濾紙上，25℃暗培養(yǎng)3d催芽，待芽長到約1～2cm時(shí)，移出，用霍格蘭液體培養(yǎng)基進(jìn)行水培。待野生大豆幼苗長至3周齡，分別在50mMNaHCO3(pH8.5)和200mMNaCl條件下處理0h、1h、3h、6h、12h、24h后迅速剪取幼嫩的葉片和根，置于-80℃保存。2、總RNA的提取和cDNA的獲得采用RNApreppure試劑盒(TRANSGENBIOTECH)分別提取上述步驟1獲得的不同時(shí)間處理后的野生大豆幼苗的葉片和根的總RNA；并以獲得總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。3、Real-timePCR以上述步驟2獲得的cDNA為模板，采用Primer-BS和Primer-BAS引物，通過Real-timePCR對(duì)GsNAC019基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。引物序列如下所示：Primer-BS：5’-CTTCCCGAAAGAACACTGGC-3’；Primer-BAS：5’-CCGTTGCTGTATTGAGTGTGC-3’；Real-timePCR反應(yīng)的條件：95℃7min→[95℃15s→60℃1min]×40→95℃1min→55℃1min→95℃30s。Real-timePCR采用比較CT法(ΔΔCT)計(jì)算基因表達(dá)量，以野生大豆GsGAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，以未經(jīng)處理的樣品作為對(duì)照。目標(biāo)基因表達(dá)差異通過經(jīng)過處理的樣本相對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來表示。每個(gè)樣品包括3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，如果有一個(gè)數(shù)值的偏差比較大則取兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)T-test進(jìn)行差異顯著性分析。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT處理-ΔCT對(duì)照)＝2-[(CT處理目的基因-CT處理內(nèi)參基因)-(CT對(duì)照目的基因-CT對(duì)照內(nèi)參基因)]。內(nèi)參基因引物序列如下所示：GsGAPDH-S：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；GsGAPDH-AS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。結(jié)果如圖1所示：在未處理的野生大豆葉片中，GsNAC019基因表達(dá)量在12h上調(diào)，而在50mMNaHCO3處理下，GsNAC019基因在野生大豆葉中表達(dá)呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢(shì)，并在1h和12h出現(xiàn)波峰，這說明堿脅迫處理使野生大豆提前表達(dá)該基因來響應(yīng)堿脅迫，也說明堿脅迫中該基因的表達(dá)量呈現(xiàn)節(jié)律性變化。在堿脅迫處理的野生大豆根中GsNAC019基因表達(dá)量12h達(dá)到最大值，且各時(shí)間點(diǎn)相較于未處理組表達(dá)量較高，說明根中GsNAC019基因的表達(dá)明顯受堿脅迫的誘導(dǎo)；而在200mMNaCl處理下，GsNAC019基因表達(dá)量表現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢(shì)，這說明GsNAC019基因也響應(yīng)鹽脅迫，而且就同一基因而言，鹽與堿脅迫對(duì)野生大豆的影響不盡相同。實(shí)施例3、基因槍轟擊介導(dǎo)的GsNAC019基因瞬時(shí)表達(dá)與目的蛋白的亞細(xì)胞定位1、亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建以野生大豆總cDNA為模板，采用GsNAC019-YS和GsNAC019-YAS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即GsNAC019基因，引物序列如下所示(下劃線標(biāo)注引入的酶切位點(diǎn)序列，其左側(cè)為保護(hù)堿基)：GsNAC019-YS：5'-ACGCGTCGACATGGGAGTTCCAGAGAAAGACCC-3'；GsNAC019-YAS：5'-AAAACTGCAGATTSCTGACCCGAACCCG-3'；PCR反應(yīng)的體系：20μL5×PrimeSTARTMHSPCR緩沖液，8μLdNTPmix(A、G、T、C、各2.5mM)，2μL上下游引物(10μM)，1μL稀釋100倍(含目的基因的質(zhì)粒)的通用模板，1μL高保真酶[PrimeSTARDNAPolymerase(TaKaRa)]，無菌ddH2O補(bǔ)足體積(總體積100μL)。PCR反應(yīng)條件：98℃8min；98℃10s，60℃10s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10m；4℃終止。用限制性內(nèi)切酶SalI和PstI分別對(duì)GsNAC019基因和pBSK-35S-eGFP載體進(jìn)行雙酶切，連接，得到含GsNAC019基因的亞細(xì)胞定位載體。對(duì)含GsNAC019基因的亞細(xì)胞定位載體進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：含GsNAC019基因的亞細(xì)胞定位載體為將pBSK-35S-eGFP載體的SalI和PstI酶切位點(diǎn)間的DNA片段替換為序列表中序列1所示的GsNAC019基因，保持pBSK-35S-eGFP載體的其他序列不變得到的載體。2、基因槍轟擊介導(dǎo)的GsNAC019基因瞬時(shí)表達(dá)采用基因槍法將上述步驟1獲得的含GsNAC019基因的亞細(xì)胞定位載體轟擊洋蔥表皮細(xì)胞(具體方法參見美國Bio-Rad伯樂Helios基因槍系統(tǒng)說明書)，以pBSK-35S-eGFP空載體為陽性對(duì)照，剪取轟擊過含GsNAC019基因的亞細(xì)胞定位載體和空載體的洋蔥表皮細(xì)胞，裝片，利用激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖2所示：GFP陽性對(duì)照在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都有表達(dá)，整個(gè)細(xì)胞均能夠檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，而GsNAC019都主要定位在細(xì)胞核中。實(shí)施例4、野生大豆轉(zhuǎn)錄因子GsNAC019基因的轉(zhuǎn)錄激活活性分析1、含有GsNAC019基因或其結(jié)構(gòu)域的重組載體的構(gòu)建將序列表中序列1所示的GsNAC019基因替換pGBKT7載體的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持pGBKT7載體的其他序列不變，得到pGBKT7-GsNAC019-1重組載體。將序列表中序列1的第1-39位所示的DNA分子替換pGBKT7載體的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持pGBKT7載體的其他序列不變，得到pGBKT7-GsNAC019-2重組載體。將序列表中序列1的第40-1032位所示的DNA分子替換pGBKT7載體的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持pGBKT7載體的其他序列不變，得到pGBKT7-GsNAC019-3重組載體。將序列表中序列1的第1-417位所示的DNA分子替換pGBKT7載體的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持pGBKT7載體的其他序列不變，得到pGBKT7-GsNAC019-4重組載體。將序列表中序列1的第418-1032位所示的DNA分子替換pGBKT7載體的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持pGBKT7載體的其他序列不變，得到pGBKT7-GsNAC019-5重組載體。2、重組菌的獲得分別將步驟1獲得的pGBKT7-GsNAC019-1重組載體，pGBKT7-GsNAC019-2重組載體、pGBKT7-GsNAC019-3重組載體、pGBKT7-GsNAC019-4重組載體、pGBKT7-GsNAC019-5重組載體轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，分別得到重組菌GsNAC019-1、重組菌GsNAC019-2、重組菌GsNAC019-3、重組菌GsNAC019-4和重組菌GsNAC019-5。將pGBKT7-DREB轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，得到陽性對(duì)照菌株；將pGBKT7空載體轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，得到陰性對(duì)照菌株。其中，酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備(LiAc法)及小量LiAc/PEG法轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞的具體步驟參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版及ClontechYeastProtocolsHandbook。3、β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)分別將重組菌GsNAC019-1、重組菌GsNAC019-2、重組菌GsNAC019-3、重組菌GsNAC019-4和重組菌GsNAC019-5用接種環(huán)接種在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上劃線，30℃培養(yǎng)3天后，將菌體影印到濾紙上，進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示：陽性對(duì)照菌株能使底物變藍(lán)，而陰性對(duì)照菌株不能使底物變藍(lán)。重組菌1和重組菌5均都能使底物變藍(lán)，而重組菌GsNAC019-2、重組菌GsNAC019-3和重組菌GsNAC019-4均不能使底物變藍(lán)。在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上除陽性對(duì)照菌株、重組菌1和重組菌5外其他酵母菌均不生長，說明GsNAC019基因所表達(dá)蛋白和其全序列的C端具有自激活功能。推測(cè)其可能通過啟動(dòng)下游基因使植物響應(yīng)堿脅迫。實(shí)施例5、GsNAC019與下游結(jié)合元件分析1、GsNAC019基因的獲得以野生大豆總cDNA為模板，采用GsNAC019-JS和GsNAC019-JAS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為1032bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即為GsNAC019基因。GsNAC019-JS：5’-GGAATTCCATATGATGGGAGTTCCAGAGAAAGACCC-3’GsNAC019-JAS：5’-CGGGATCCTCAATTCTGACCCGAACCCG-3’2、pGADT7-GsNAC019的獲得用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ分別對(duì)pGADT7載體和上述步驟1獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，連接，得到pGADT7-GsNAC019重組載體，對(duì)pGADT7-GsNAC019重組載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明：pGADT7-GsNAC019重組載體為將pGADT7載體的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)間的DNA片段替換為序列表中序列1所示的GsNAC019基因，且保持pGADT7載體的其他序列不變得到的載體，表達(dá)GsNAC019蛋白。3、pHIS2-cis及pHIS2-mcis載體的獲得將NAC-CIS-1結(jié)合元件的核苷酸序列替換pHIS2載體的EcoRⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持pHIS2載體的其他序列不變得到的載體，得到pHIS2-cis-1重組載體；將NAC-CIS-2結(jié)合元件的核苷酸序列替換pHIS2載體的EcoRⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持pHIS2載體的其他序列不變得到的載體，得到pHIS2-cis-2重組載體；將NAC-MCIS結(jié)合元件的核苷酸序列替換pHIS2載體的EcoRⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持pHIS2載體的其他序列不變得到的載體，得到pHIS2-cis-mcis重組載體；NAC-CIS-1結(jié)合元件的核苷酸序列為：CGTGTATACGTGTATACGTG；NAC-CIS-2結(jié)合元件的核苷酸序列為：CGTATTAACGTATTAACGTA；NAC-CIS-1結(jié)合元件的核苷酸序列為：GGGGTTAAGGGGTTAAGGGG。4、重組菌的獲得將pGADT7-GsNAC019重組載體和pHIS2-cis-1重組載體共同轉(zhuǎn)化酵母菌Y187，得到含質(zhì)粒pGADT7-GsNAC019/pHIS2-cis-1的酵母菌Y187。將pGADT7-GsNAC019重組載體和pHIS2-cis-2重組載體共同轉(zhuǎn)化酵母菌Y187，得到含質(zhì)粒pGADT7-GsNAC019/pHIS2-cis-2的酵母菌Y187。將pGADT7-GsNAC019重組載體和pHIS2-cis-mcis重組載體共同轉(zhuǎn)化酵母菌Y187，得到含質(zhì)粒pGADT7-GsNAC019/pHIS2-cis-mcis的酵母菌Y187。將pGADT7載體和pHIS2載體共同轉(zhuǎn)化酵母菌Y187，得到含質(zhì)粒pGADT7/pHIS2的酵母菌Y187。5、結(jié)合活性檢測(cè)分別用微量移液器吸取1ul的含質(zhì)粒pGADT7-GsNAC019/pHIS2-cis-1的酵母菌Y187菌液、含質(zhì)粒pGADT7-GsNAC019/pHIS2-cis-2的酵母菌Y187菌液、含質(zhì)粒pGADT7-GsNAC019/pHIS2-cis-mcis的酵母菌Y187菌液和含質(zhì)粒pGADT7/pHIS2的酵母菌Y187菌液在SD/-Trp/-Leu及SD/-Trp/-Leu/-His+50mM3-AT固體培養(yǎng)基上點(diǎn)點(diǎn)，以含質(zhì)粒pGADT7/pHIS2的酵母菌Y187為陰性對(duì)照，若有轉(zhuǎn)錄因子與各元件結(jié)合并具有激活功能，則會(huì)表達(dá)HIS蛋白。30℃培養(yǎng)3天后，觀察菌落是否生長。結(jié)果如圖4所示：所有菌落均能在SD/-Trp/-Leu上生長，說明各組質(zhì)粒均轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母菌Y187。陰性對(duì)照及含質(zhì)粒pGADT7-GsNAC019/pHIS2-cis-1的酵母菌Y187不能在SD/-Trp/-Leu/-His+50mM3-AT的培養(yǎng)基上生長，說明GsNAC019不能與NAC-CIS-1結(jié)合元件結(jié)合。而含質(zhì)粒pGADT7-GsNAC019/pHIS2-cis-2的酵母菌Y187能在SD/-Trp/-Leu/-His+50mM3-AT的培養(yǎng)基上生長，說明GsNAC019能與NAC-CIS-2結(jié)合元件結(jié)合。實(shí)施例6、轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥植株的獲得及其耐堿性分析一、轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥植株的獲得1、GsNAC019基因的獲得以實(shí)施例1中的步驟4得到的pEASY-BluntZero-GsNAC019為模板，采用引物Primer-UA和Primer-UAS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即GsNAC019基因。引物序列如下：Primer-UA：5’-GGCTTAAUCAGTGGTTCTTTTCCTTCTGAGA-3’；Primer-UAS：5’-GGTTTAAUAAGAATCCCCACCTATTTACACC-3’。PCR擴(kuò)增體系(10μl)：模板1μl，buffer1μl，dNTPMixture(2.5mM)0.4μl，Primer-UA0.5μl，Primer-UAS0.5μl，PfuCxDNAPolymerase(TaKaRa)0.2μl，ddH2O6.4μl。PCR擴(kuò)增條件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃終止反應(yīng)。2、植物表達(dá)載體的獲得用限制性內(nèi)切酶PacⅠ和Nt.BbvCI對(duì)pCAMBIA330035Su載體進(jìn)行酶切，將獲得的載體酶切產(chǎn)物、USER酶(NEB,M5505S)和GsNAC019基因在37℃下孵育20min，利用USER酶對(duì)GsNAC019基因片段的尿嘧啶處進(jìn)行切割，形成可與pCAMBIA330035Su載體雙酶切后互補(bǔ)的粘性末端，得到的重組表達(dá)載體記作pCAMBIA330035Su-GsNAC019。將獲得的重組表達(dá)載體pCAMBIA330035Su-GsNAC019在25℃下孵育20min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(全式金，CD201-01)，并送交測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：在pCAMBIA330035Su載體的PacⅠ和Nt.BbvCI酶切位點(diǎn)之間插入了如序列表中序列1所示的GsNAC019基因。pCAMBIA330035Su載體表達(dá)序列2所示的GsNAC019蛋白。3、轉(zhuǎn)化采用凍融法，將pCAMBIA330035Su-GsNAC019載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌LB4404，獲得重組農(nóng)桿菌pCAMBIA330035Su-GsNAC019/LB4404，將pCAMBIA330035Su轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌LB4404，獲得重組農(nóng)桿菌pCAMBIA330035Su/LB4404。經(jīng)PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)化子(含有序列表中序列1所示的GsNAC019基因的轉(zhuǎn)化子)，用于侵染擬南芥植株。4、轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥的獲得將重組農(nóng)桿菌pCAMBIA330035Su-GsNAC019/LB4404通過Floral-dip法侵染野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型col-0)，將侵染過的擬南芥進(jìn)行培養(yǎng)，得到T0代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥種子。將T0代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥種子表面消毒后，播種于含25mg/L固殺草(glufosinate-ammonium，Sigma，45520)的1/2MS培養(yǎng)基上篩選，得到T1代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥幼苗。如此重復(fù)，直至得到T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合體株系。提取T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥幼苗的基因組RNA，進(jìn)行RT-PCR鑒定。具體步驟如下：提取T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥植株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；以cDNA為模板，分別采用Primer-BS和Primer-BAS引物對(duì)、Actin2-S和Actin2-AS引物對(duì)，對(duì)GsNAC019基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下所示：Primer-BS：5’-CTTCCCGAAAGAACACTGGC-3’；Primer-BAS：5’-CCGTTGCTGTATTGAGTGTGC-3’；Actin2-S：5’-TTACCCGATGGGCAAGTC-3’；Actin2-AS：5’-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3’。PCR反應(yīng)的體系為：5μL2×EasyTaqDNAPolymerase，0.8μL上下游引物(10μM)，1μL稀釋100倍的cDNA，無菌ddH2O補(bǔ)足體積(總體積10μL)。PCR反應(yīng)的條件：GsNAC019：94℃10min→[94℃30s→60℃30s→72℃90s]×30→72℃10min→4℃終止反應(yīng)。Actin2：94℃10min→[94℃30s→60℃30s→72℃90s]×28→72℃10min→4℃終止反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果表明：野生型擬南芥植株的RT-PCR無擴(kuò)增產(chǎn)物，而T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系#6、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系#16和T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系#22都可以擴(kuò)增出大小為1032bp的目的條帶，表明外源基因GsNAC019基因不但已順利整合到擬南芥的基因組上，而且能夠在轉(zhuǎn)基因擬南芥中正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。選取T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#和T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系22#用于下一步的表型分析。二、轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥在堿脅迫下的表型分析1、轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥在7mMNaHCO3脅迫下的幼苗期表型、根長選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#和T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#種子，用5％次氯酸鈉消毒液消毒10min后，于4℃春化3d，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上。1周后，挑選長勢(shì)一致的轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥和野生型擬南芥幼苗水平擺放于7mMNaHCO3脅迫培養(yǎng)基的平皿中，豎直生長，并以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的擬南芥幼苗作為對(duì)照。12d后觀察堿脅迫處理組和對(duì)照組的擬南芥長勢(shì)、根長，所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)各3次。每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)株系5株。結(jié)果如圖5a和圖5b所示：根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在正常條件下，野生型平均根長為68.2mm，而T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#的平均根長為64.8mm，T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#的平均根長為67.9mm；在NaHCO3脅迫處理?xiàng)l件下，野生型的平均根長為34.0mm，T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#的平均根長為44.0mm，T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#的平均根長為47.6mm。上述結(jié)果表明：在正常條件下，T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#和T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#與野生型擬南芥的生長發(fā)育并沒有顯著差異，表明導(dǎo)入的GsNAC019基因并未在幼苗期對(duì)擬南芥的生長、發(fā)育造成影響；在NaHCO3脅迫處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥與野生型擬南芥的生長都受到了抑制，但在7mMNaHCO3處理下，野生型生長抑制更明顯，轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥的根長明顯長于野生型。因此超量表達(dá)GsNAC019基因提高了擬南芥在幼苗期對(duì)堿脅迫的耐性。2、轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥在150mMNaHCO3處理下的成苗期表型、葉綠素含量及存活率選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#和T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系22#種子，4℃春化3d后，播種于營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)土，君子蘭土，蛭石按1：1：1混合)，置于溫室中培養(yǎng)(22℃，光照16h/d)。3周后，對(duì)于堿處理的苗每2～3d澆灌一次150mMNaHCO3溶液，并以未用NaHCO3溶液澆灌的正常條件下生長的擬南芥幼苗作為對(duì)照。15d后觀察各堿處理組(150mMNaHCO3)和對(duì)照組的擬南芥長勢(shì)，并測(cè)定各組葉綠素含量及存活率(檢測(cè)方法參見文獻(xiàn)“植物生理實(shí)驗(yàn)/郝再彬等主編哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社，2004.9”)。所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)各3次。每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)株系30株。150mMNaHCO3處理下轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥與野生型擬南芥的長勢(shì)情況如圖5c所示：在正常條件下，T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#和T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系22#與野生型擬南芥的成苗生長發(fā)育情況并沒有顯著差異，表明導(dǎo)入的GsNAC019基因并未在成苗期對(duì)擬南芥的生長、發(fā)育造成影響；對(duì)于澆灌150mMNaHCO3溶液的成苗，野生型大部分葉片發(fā)黃、卷曲最終死亡，但T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#和T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系22#葉片發(fā)生輕度萎蔫，基本都完全存活并開始生殖生長。150mMNaHCO3處理下轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥與野生型擬南芥的葉綠素含量和存活率如圖5d和圖5e所示：在正常條件下，T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#和T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系22#與野生型擬南芥的葉綠素含量和存活率并沒有顯著差異，但在150mMNaHCO3條件下，T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#和T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系22#與野生型擬南芥的葉綠素含量和存活率均明顯高于野生型擬南芥。3、轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥在50mMNaHCO3處理下的堿脅迫相關(guān)的marker基因的相對(duì)表達(dá)量分析將野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系6#、T3代轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥純合株系16#的種子播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上，22℃光照培養(yǎng)10天，將其移出放入添加了50mMNaHCO3的1/2MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行處理，在0h及6h采取處理及未處理的樣品，提取全基因組RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的cDNA，按照實(shí)施例6步驟一中的4的方法通過RT-PCR對(duì)堿脅迫相關(guān)的marker基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。marker基因及內(nèi)參基因ACTIN2引物如表3所示。表3、marker基因的引物序列Real-timePCR反應(yīng)的條件：95℃7min→[95℃15s→60℃1min]×40→95℃1min→55℃1min→95℃30s。Real-timePCR采用比較CT法(ΔΔCT)計(jì)算基因表達(dá)量，以擬南芥ACTIN2基因?yàn)閮?nèi)參基因，以未經(jīng)處理的樣品作為對(duì)照。目標(biāo)基因表達(dá)差異通過經(jīng)過處理的樣本相對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來表示。每個(gè)樣品包括3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，如果有一個(gè)數(shù)值的偏差比較大則取兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)T-test進(jìn)行差異顯著性分析。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT處理-ΔCT對(duì)照)＝2-[(CT處理目的基因-CT處理內(nèi)參基因)-(CT對(duì)照目的基因-CT對(duì)照內(nèi)參基因)]。A檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出：在轉(zhuǎn)GsNAC019擬南芥中，超表達(dá)GsNAC019基因使耐堿相關(guān)基因H+-ATPase、RD29A和KIN發(fā)生上調(diào)表達(dá)而對(duì)NADP-ME、RD22和COR47基因的表達(dá)量影響不大。推測(cè)GsNAC019是通過上調(diào)H+-ATPase、RD29A和KIN等基因來提高植物耐堿性。當(dāng)前第1頁1 2 3