本發(fā)明屬于真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白領(lǐng)域，特別涉及一種毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(Fungal immunomodulatory protein，F(xiàn)IP)是從高等擔(dān)子菌中分離得到的一類具有免疫調(diào)節(jié)活性的小分子蛋白質(zhì)。1989年，日本學(xué)者Kino從靈芝(Ganoderma lucidum)子實體中分離到第一個真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，命名為Ling Zhi-8(LZ-8)，并對其基因序列、氨基酸順序和免疫生理活性進(jìn)行了測定(Kino K,1989,J Biol Chem)。通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可以促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞和人類周邊血淋巴細(xì)胞的增生(Hsieh KY,2003,Clin Exp Allergy)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌表達(dá)黏附分子ICAM(Wu CT,2011,Carcinogenesis)，增強(qiáng)IL-2，TNF-α和IFN-γ的分泌水平(Li QZ,2011,Crit Rev Biotechnol)，從而提高機(jī)體免疫力。同時在動物實驗中還觀察到真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可以抑制小鼠產(chǎn)生全身性過敏，或降低局部性免疫過敏的發(fā)生率(Lin YL,2009,J Leukocyte Biol)，并且可以減輕一型糖尿病的病情(Kino K,1990,Diabetologia)，過敏和一型糖尿病都是由于機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂所致，而真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)恢復(fù)正常功能的作用。在抗癌方面，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白對于HL60腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性(Huang L,2009,Proteins)。并且相對于許多成分復(fù)雜難解或化學(xué)結(jié)構(gòu)不清楚(如靈芝多糖)的中草藥來說，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有簡單的化學(xué)結(jié)構(gòu)，完全具備成藥的條件。因此，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白擁有良好的臨床應(yīng)用前景和藥用保健價值。

目前，已經(jīng)從靈芝(G.lucidium)、金針菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、松杉靈芝(G.tsugae)、紫芝(G.japoncium)、小孢子靈芝(G.microsporum)、甜靈芝(G.sinense)、拱狀靈芝(G.fornicatum)、綿腐臥孔菌(Postia placenta)和赤球叢赤殼(Nectria haematococca)中發(fā)現(xiàn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，但是還未有在毒蠅鵝膏(Amanita muscaria)中發(fā)現(xiàn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的相關(guān)報道。在大型真菌中挖掘新型真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白資源，對于我國進(jìn)一步開發(fā)有關(guān)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白藥物和保健食品，提高我國在食用菌資源開發(fā)方面的核心競爭力具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1及其制備方法和應(yīng)用，該毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1能夠明顯促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)等免疫調(diào)節(jié)作用，因此，在提高機(jī)體免疫力方面具有應(yīng)用潛力。

本發(fā)明的一種毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1，所述免疫調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的一種編碼毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1的基因，所述基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

將毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1的cDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，沒有發(fā)現(xiàn)與其相似的基因序列，而將其氨基酸序列在NCBI的無冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(nr)中進(jìn)行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與來源于小孢子靈芝(G.microsporum)免疫調(diào)節(jié)蛋白的相似性達(dá)到55％，與來自于赤芝(Ganoderma lucidum)免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8的相似性為50％。

本發(fā)明的一種毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1基因的載體。

優(yōu)選的，所述載體為pET-32a。

將本發(fā)明的毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。優(yōu)選的，將毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1基因插入到pET-32a上的KpnI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體pET-Fip-amu1。

本發(fā)明的一種毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1基因的重組菌株。

優(yōu)選的，所述重組菌株為Rosetta-Fip-amu1。

本發(fā)明的一種毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1的制備方法，包括：

(1)將毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA序列連入載體中，得到重組載體；

(2)將上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到重組菌株；

(3)培養(yǎng)上述重組菌株，誘導(dǎo)重組毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1的表達(dá)；

(4)經(jīng)NI柱純化、透析分離獲取所表達(dá)的毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1。

所述步驟(2)中的宿主細(xì)胞為大腸桿菌Rosetta細(xì)胞。

本發(fā)明的一種毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1的應(yīng)用，所述免疫調(diào)節(jié)蛋白用于制備保健食品。

本發(fā)明運(yùn)用基因工程手段獲得，以及用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1產(chǎn)品都未見報道。本發(fā)明首次提供了毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1，該蛋白對脾淋巴細(xì)胞具有催化分裂的作用，可作用于保健品和醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1。

有益效果

本發(fā)明毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1能夠明顯促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)等免疫調(diào)節(jié)作用，因此，在提高機(jī)體免疫力方面具有應(yīng)用潛力；可以制備出新型的提高人體免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所導(dǎo)致的疾病的危害，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1氨基酸序列與其它真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白氨基酸序列比對結(jié)果；

圖2為本發(fā)明pET-Fip-amu1質(zhì)粒圖譜；

圖3為本發(fā)明毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1表達(dá)的SDS-PAGE分析；其中，1為包涵體；2為上清；M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；

圖4為本發(fā)明毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1的復(fù)性和純化；

圖5為本發(fā)明毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖實驗；

圖6為本發(fā)明毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1促進(jìn)腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

下述是實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑公司買得。以下實施例中的定量實驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

1.細(xì)胞株：Rosetta感受態(tài)，DH5a感受態(tài)。

2.動物：清潔級ICR小鼠，體重18～22g，購于揚(yáng)州大學(xué)實驗動物中心。

3.試劑盒、酶類、生化試劑和儀器：

試劑盒：天根質(zhì)粒提取試劑盒，天根蛋白定量檢測試劑盒，上海生工PCR產(chǎn)物回收試劑盒，PCR引物合成和基因測序均由上海生工完成。TNF-αElisa檢測試劑盒，CD4+CD62L+TCell分離試劑盒購于美國BD。

酶類：Takara常規(guī)內(nèi)切酶，Takara DNA T4連接酶，東盛TaqDNA聚合酶。

儀器：艾本德微量加樣器、賽默飛世爾離心機(jī)、酶聯(lián)免疫分析儀，上海天能凝膠成像儀、水平電泳槽、垂直電泳槽，江陰諾源恒溫培養(yǎng)搖床，新芝超聲破碎儀，Biorad電轉(zhuǎn)儀，晶格PCR儀，美國Thermo scientific細(xì)胞培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀，蘇州金凈生物安全柜，上海蔡康倒置顯微鏡。

生化試劑：

國藥冰乙酸、丙三醇(甘油)、無水乙醇、異丙醇、甲醇、甘氨酸、Tris、氫氧化鈉、EDTA、氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、咪唑、脲、鹽酸胍；生工NI樹脂、丙烯酰胺、N,N-亞甲叉丙烯酰胺、IPTG；Oxdine胰蛋白胨、酵母提取物；Solarbio氨芐青霉素、卡那抗生素；SDS、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250、AP；美國sigmaMTT。

4.培養(yǎng)基：生工LB培養(yǎng)基，美國GIBCORPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清。

實施例1

毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1基因序列信息與同源性分析：

毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1cDNA序列為345bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.2。根據(jù)cDNA序列推導(dǎo)出Fip-amu1氨基酸序列，共115個氨基酸殘基，分子量12.58kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為7.88，不穩(wěn)定系數(shù)為21.31，脂肪族系數(shù)為87.11，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1所示序列。

將毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與來源于小孢子靈芝(G.microsporum)免疫調(diào)節(jié)蛋白的相似性達(dá)到55％，與來自于平蓋靈芝(G.applanatum)免疫調(diào)節(jié)蛋白的相似性為55％，與來自于赤芝(G.lucidum)免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8的相似性為50％,與金針菇(Flammulina velutipes)免疫調(diào)節(jié)蛋白相似性為55％,與綿腐臥孔菌(Postia placenta)免疫調(diào)節(jié)蛋白相似性為52％，如圖1所示。由此可見，毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1與真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白家族在蛋白水平上存在較高的同源性，是一種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。

實施例2

毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1基因的合成與表達(dá)：

委托上海生工生物工程有限公司完成基因的堿基序列合成，合成的序列構(gòu)建到克隆載體pUC57上，轉(zhuǎn)化克隆菌株DH5a，提取質(zhì)粒，以雙酶切(KpnI和XhoI)消化后，瓊脂糖凝膠電泳，回收Fip-amu1基因片段，以連接酶(T4ligase)連接到以KpnI和XhoI消化的pET30a載體上，表達(dá)載體pET-Fip-amu1轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Rosetta。挑取單克隆，LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日，菌種以1:50擴(kuò)大培養(yǎng)800mL，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.4-0.6，加入0.5mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h。經(jīng)0.5mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h。如圖2所示，將Fip-amu1基因片段構(gòu)建到表達(dá)載體pET32a上。

實施例3

重組毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1的分離與復(fù)性：

8000rpm、4℃離心5min，收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌株，加100mL破碎液進(jìn)行超聲波裂解。裂解條件：溫度冰浴、功率60％、超聲2s、間隔2s、時間15min。12000rpm、4℃離心15min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE檢測，判斷目的蛋白的表達(dá)形式。目的蛋白Fip-amu1以包涵體形式存在，對包涵體進(jìn)行增溶洗滌處理，過NI柱純化，收集流穿液、洗脫液，SDS-PAGE檢測蛋白純化效果。對包涵體進(jìn)行復(fù)性。復(fù)性采用尿素梯度復(fù)性，既8M-6M-4M-2M-0M尿素，穩(wěn)定的透析到貯存液中(20mM Tris，50mM NaCl，1mM EDTA)。如圖3、4所示，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白通過SDS-PAGE鑒定，大小正確。

實施例4

重組毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的脾淋巴細(xì)胞增殖試驗：

(1)脾細(xì)胞懸液制備：BALB/c小鼠購得后飼養(yǎng)1周進(jìn)行免疫學(xué)實驗。無菌條件下脫頸椎處死，立即切除脾臟，加適量PBS研磨，以100目不銹鋼網(wǎng)濾過，并加入紅細(xì)胞裂解液5min除去溶血的紅細(xì)胞，1200r/min離心5min，棄上清，加PBS重復(fù)洗滌2次。然后加入CD4+CD62L+T Cell分離試劑盒，即得到純度大于90％的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞用10％胎牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

(2)淋巴細(xì)胞增殖實驗：于96孔板中，每孔加100μL脾細(xì)胞懸液(1×10⁷個/mL)，實驗設(shè)置空白組，刀豆蛋白A(ConA)組，F(xiàn)ip-amu1組和LZ-8陽性對照組。ConA組、Fip-amu1組及LZ-8組分別加入20μL濃度為5μg/mL的ConA作用6h，然后Fip-amu1組和LZ-8組分別加入終濃度為100μM的Fip-amu1和LZ-8，每孔各100μL。作用12h，每組設(shè)置4個復(fù)孔。達(dá)到作用時間后，向上述細(xì)胞板中各加藥孔入10μL MTT試劑(MTT需避光)，放入培養(yǎng)箱中，4h后棄去孔中液體加入150μL DMSO，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，在多功能酶標(biāo)儀A570nm測定吸光度，計算細(xì)胞增殖情況。

如圖5所示，毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1能顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，其效果與LZ-8相當(dāng)。

實施例5

重組毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1的促腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)：

脾細(xì)胞懸液制備及細(xì)胞鋪板方法與細(xì)胞增殖實驗一致。

(1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μL分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μL棄掉，再各取50μL分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μL分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻后從第七、第八孔中分別取50μL加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻后從第九第十孔中各取50μL棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為(300ng/L，200ng/L，100ng/L，50ng/L，25ng/L)。

(2)加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

(3)溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。

(4)配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

(5)洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

(6)加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。

(7)溫育：操作同(3)。

(8)洗滌：操作同(5)。

(9)顯色：每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min.

(10)終止：每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

(11)測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進(jìn)行。

如圖6所示，毒蠅鵝膏免疫調(diào)節(jié)蛋白Fip-amu1能顯著促進(jìn)腫瘤壞死因子TNF-α水平表達(dá)，其效果與LZ-8相當(dāng)。