本發(fā)明屬于熱激蛋白領(lǐng)域，特別涉及一種香菇熱激蛋白Hsp60及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

香菇(Lentinula edodes)屬于中低溫型變溫結(jié)實(shí)性菇類(lèi)，具有極高的食藥用價(jià)值，隨著生活水平的日益提高，人們對(duì)香菇的需求量也大大增加。在正常生長(zhǎng)條件下，香菇子實(shí)體發(fā)生的最適溫度為8-20℃，菌絲生長(zhǎng)發(fā)育最適溫度為24-27℃，原基分化的最適溫度為10-12℃。我國(guó)作為香菇生產(chǎn)大國(guó)，由于主產(chǎn)區(qū)的夏季溫度遠(yuǎn)高于25℃，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)燒菌、菇小蓋薄、開(kāi)傘難等問(wèn)題，因此夏季溫度過(guò)高嚴(yán)重影響了香菇的產(chǎn)量，造成夏季香菇供不應(yīng)求。對(duì)香菇耐熱機(jī)理的研究及其育種應(yīng)用，成為亟待解決的科學(xué)與技術(shù)問(wèn)題。

熱激蛋白(Heat shock protein,HSPs)是指在高于正常生長(zhǎng)溫度5℃以上的溫度下，當(dāng)大部分正常蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程都受到抑制時(shí)，此時(shí)會(huì)迅速大量合成的一類(lèi)蛋白質(zhì)。高溫下生物體產(chǎn)生的熱激蛋白可保護(hù)機(jī)體蛋白質(zhì)免遭損傷或修復(fù)已受損傷的蛋白質(zhì)，從而對(duì)生物體起到保護(hù)作用，熱激蛋白的誘導(dǎo)形成可使生物體提高耐熱性。熱鍛煉過(guò)程中有大量熱激蛋白的表達(dá)，它們富集在膜組分上，具有阻止膜蛋白的變性、防止生物膜熱破碎的功能。許多研究表明：HSP生成量與生物耐熱性呈正相關(guān)，目前雖不清楚是否已檢測(cè)到的每一種HSP都為產(chǎn)生耐熱性所必需，但已證實(shí)某些HSP的確與植物體的耐熱能力有關(guān)系。例如大豆HSP可阻止經(jīng)熱誘導(dǎo)的大豆幼苗溶質(zhì)的滲漏，高溫下在番茄細(xì)胞質(zhì)聚集形成的熱激顆粒能對(duì)蛋白質(zhì)的合成起保護(hù)作用。

按照熱激蛋白的類(lèi)型可將其分為誘導(dǎo)型和組成型兩類(lèi)：誘導(dǎo)型的HSP主要在受到外界環(huán)境的刺激下被誘導(dǎo)表達(dá)，具有保護(hù)細(xì)胞的功能；組成型的HSP在正常生理狀態(tài)下表達(dá)，與細(xì)胞的分化、發(fā)育密切相關(guān)。熱激蛋白除具有多脅迫刺激源(如高溫、缺氧、高滲、重金屬等)的特點(diǎn)外，還兼具分布普遍、進(jìn)化保守、種類(lèi)多樣、響應(yīng)時(shí)間短、交叉耐受等特性。

Hsp60蛋白最早被認(rèn)為是分子伴侶(Ellis,1990)，其大部分成員都是組成型蛋白。Hsp60蛋白能夠修復(fù)部分折疊或凝集多肽的自然構(gòu)象。相對(duì)于其它熱激蛋白，Hsp60具有優(yōu)先結(jié)合變性蛋白的能力，保護(hù)細(xì)胞免受逆境脅迫的危害。

目前人們對(duì)植物和動(dòng)物體內(nèi)熱激蛋白已有較深刻的認(rèn)識(shí)，關(guān)于微生物熱激蛋白的報(bào)道相對(duì)較少，而關(guān)于食用菌(尤其是香菇)的熱激蛋白Hsp60的功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種香菇熱激蛋白Hsp60及其應(yīng)用，將含有該蛋白讀碼框的核苷酸序列轉(zhuǎn)入適合的宿主體內(nèi)，可使宿主表達(dá)熱激蛋白并提高宿主細(xì)胞的耐熱性，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供了一種香菇熱激蛋白Hsp60，所述熱激蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明提供了一種編碼香菇熱激蛋白Hsp60的基因，所述基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明提供了一種香菇熱激蛋白Hsp60的基因設(shè)計(jì)的引物，所述引物序列如下：

5’-CGGATCCGATGCATCACCTGTCGACCAA-3’；

5’-GGAATTCCAGGAGCAGCTGGCTTCTCTT-3’。

本發(fā)明提供了一種含香菇熱激蛋白Hsp60基因的載體。

所述載體為pET-32a(+)/Hsp60。

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞、組織或微生物，轉(zhuǎn)入上述載體。

本發(fā)明提供了一種香菇熱激蛋白Hsp60的應(yīng)用，應(yīng)用于轉(zhuǎn)入大腸桿菌中使宿主獲得耐熱性。

本發(fā)明以香菇菌株18N44為材料，通過(guò)香菇基因組構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)本地Blast找到香菇中熱激蛋白Hsp60基因保守序列，使用Primer Premier 5.0結(jié)合DNAMAN 6.0程序設(shè)計(jì)一對(duì)引物，從香菇基因組DNA中擴(kuò)增出Hsp60全基因片段，經(jīng)PCR鑒定后，將目的片段與T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)中，送交生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，片段長(zhǎng)度為1792bp，如SEQ ID NO.2所示，編碼482個(gè)氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步分析香菇熱激蛋白Hsp60的核苷酸序列和氨基酸序列，序列分析表明該基因?qū)儆跓峒さ鞍譎sp60基因家族。多序列比對(duì)的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果如圖1所示，香菇的Hsp60蛋白與平菇(Pleurotus ostreatus)、可可鏈疫孢莢腐病菌(Moniliophthora roreri)、雞樅菌(Termitomyces)、雙色蠟?zāi)?Laccaria bicolor)等的親緣關(guān)系較近，與禾柄銹菌(Puccinia graminis)、厚皮馬拉色菌(Malassezia pachydermatis)等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由生物信息學(xué)分析得知，香菇Hsp60蛋白的分子量約為50.6kDa，等電點(diǎn)(pI,isoelectric point)為4.76；不穩(wěn)定系數(shù)為34.57，屬于穩(wěn)定蛋白；疏水性系數(shù)為-0.002，表明該蛋白具有親水性。經(jīng)NetPhos 2.0軟件預(yù)測(cè)得知，香菇Hsp60蛋白的Ser磷酸化位點(diǎn)為17個(gè)，Thr磷酸化位點(diǎn)為8個(gè)，Tyr磷酸化位點(diǎn)為3個(gè)。利用SignalP 4.1server對(duì)香菇熱激蛋白Hsp60進(jìn)行了信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白的綜合分值Y值為0.130，剪切位置分值C值為0.154，信號(hào)肽分值S值為0.175，C值和Y值都比較低，因此可判斷香菇熱激蛋白Hsp60不存在信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。經(jīng)EMBnet Tmpred跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，從N端開(kāi)始首先是由外向內(nèi)跨膜然后再由內(nèi)向外跨膜，依次經(jīng)過(guò)2次跨膜，從預(yù)測(cè)結(jié)果可知香菇熱激蛋白Hsp60是一個(gè)雙向跨膜蛋白，可能與膜定位和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

將獲得的香菇Hsp60基因序列，如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列與骨架載體pET-32a(+)連接構(gòu)建得到原核表達(dá)載體pET-32a(+)/Hsp60，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行異源表達(dá)，提取表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示在45kDa-60kDa之間出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果吻合。

轉(zhuǎn)基因大腸桿菌經(jīng)高溫(50℃)熱激處理后，通過(guò)對(duì)大腸桿菌活力的測(cè)定和大腸桿菌可溶性蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果均表明，香菇Hsp60蛋白的異源表達(dá)可顯著提高大腸桿菌的耐高溫能力，如圖9所示，且對(duì)大腸桿菌中其它蛋白有較好的保護(hù)作用。

有益效果

本發(fā)明獲得了香菇熱激蛋白Hsp60基因的完整開(kāi)放讀碼框及熱激蛋白的氨基酸序列，將含有該讀碼框的核苷酸序列轉(zhuǎn)入適合的宿主體內(nèi)，可使宿主表達(dá)熱激蛋白并提高宿主細(xì)胞的耐熱性，實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因大腸桿菌過(guò)量表達(dá)該熱激蛋白后獲得了耐熱性，推測(cè)該基因轉(zhuǎn)入其它生物中也可提高宿主的耐熱性。

附圖說(shuō)明

圖1為香菇熱激蛋白Hsp60的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；

圖2為香菇熱激蛋白Hsp60的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；

圖3為香菇熱激蛋白Hsp60的信號(hào)肽預(yù)測(cè)；

圖4為香菇熱激蛋白Hsp60的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；

圖5為香菇熱激蛋白Hsp60的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；

圖6為pET-32a(+)/Hsp60重組質(zhì)粒PCR鑒定電泳圖譜；

圖7為未進(jìn)行高溫處理?xiàng)l件下，pET-32a/Hsp60重組表達(dá)蛋白產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；

其中，泳道1是蛋白Marker；泳道2是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，含有pET-32a空載體對(duì)照組大腸桿菌表達(dá)蛋白產(chǎn)物的電泳圖譜；泳道3是未用IPTG誘導(dǎo)，含有pET-32a/Hsp60重組質(zhì)粒的大腸桿菌蛋白表達(dá)電泳圖譜；泳道4是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，含有pET-32a/Hsp60重組質(zhì)粒的大腸桿菌蛋白的電泳圖譜。

圖8為高溫(50℃)條件下，pET-32a/Hsp60重組表達(dá)蛋白產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；

其中，泳道1是蛋白Marker；泳道2是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在50℃條件下，高溫脅迫60min，含有pET-32a空載體的對(duì)照組大腸桿菌蛋白表達(dá)電泳圖譜；泳道3是在IPTG誘導(dǎo)下，未受到高溫脅迫的pET-32a對(duì)照組大腸桿菌蛋白表達(dá)電泳圖譜；泳道4是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，pET-32a/Hsp60重組的大腸桿菌在50℃條件下，高溫脅迫60min后，蛋白表達(dá)情況的電泳圖譜；泳道5是經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，含有pET-32a/Hsp60重組的大腸桿菌在未經(jīng)高溫脅迫的情況下，其蛋白表達(dá)的電泳圖譜。

圖9為高溫(50℃)條件下，轉(zhuǎn)入香菇Hsp60基因的大腸桿菌存活率比較。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附專(zhuān)利要求書(shū)所限定的范圍。所用試驗(yàn)材料及試劑

1.1.1試驗(yàn)材料

香菇18N44菌株是由菌株18誘變而來(lái)，相較于18菌株對(duì)高溫的抵抗力更強(qiáng)。

1.1.1.1大腸桿菌菌株

大腸桿菌(E.coli)菌株TOP10，大腸桿菌(BL21)為常用菌株，可在市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)獲得。

1.1.1.2克隆載體

本試驗(yàn)采用T載體：pGM-T Easy vector System I，Promega Corporation，全長(zhǎng)2692bp，攜帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp)和LacZ基因，重組體可通過(guò)藍(lán)白斑和氨芐抗性雙重篩選鑒定。

表達(dá)載體pET-32a(+)為常用載體，可在生物公司購(gòu)買(mǎi)到，全長(zhǎng)5900bp，攜帶有氨芐青霉素(Amp)抗性基因。

1.1.2試驗(yàn)培養(yǎng)基

1.1.2.1PDA固體培養(yǎng)基

馬鈴薯200g(取汁)，蔗糖20g，瓊脂20g，加蒸餾水定容至1000mL。

1.1.2.2LB固體培養(yǎng)基

蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂20g，加蒸餾水定容至1000mL。

1.1.2.3LB液體培養(yǎng)基

蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加蒸餾水定容至1000mL。

1.1.3試劑

總RNA提取試劑盒：Redzol，購(gòu)自賽百盛(北京)基因技術(shù)有限公司；

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；

Marker:GeneRuler^TM DNA Ladder Mix，購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；

反轉(zhuǎn)錄試劑盒：PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，購(gòu)自TAKARA公司；

限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和BamH I購(gòu)自TAKARA BIOTECHNOLOGY；

質(zhì)粒DNA提取試劑盒，TIANprep Mini Plasmid Kit，購(gòu)自TIANGEN公司；

SDS-PAGE凝膠試劑盒購(gòu)自PROMOTON；

SDS-PAGE染色脫色試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.4儀器

PCR擴(kuò)增儀，核酸蛋白檢測(cè)儀，凝膠成像系統(tǒng)，BCD-281E冰箱，VS-15000CFNⅡ高速冷凍離心機(jī)，電泳儀，制冰機(jī)，HWS12型電熱恒溫水浴鍋，DPH-9272恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，SX-500TOMY自動(dòng)滅菌鍋，DKY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床，微量移液器。

1.1.5常用溶液的配制

1.1.5.1氨芐青霉素儲(chǔ)存液：

將1g氨芐青霉素溶解于10mL去離子水中，使終濃度達(dá)到100mg/mL，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5.2IPTG：

將IPTG配制成24mg/mL(100mM)的水溶液，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5.3PBS緩沖液：

NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 1.76mmol/L，加蒸餾水定容至1000mL，調(diào)PH值至7.2-7.4。

1.1.5.4電極緩沖液(Running Buffer)：

Tris 3.1g，甘氨酸18.8g，SDS 1g，加蒸餾水定容至1L。

實(shí)施例1

香菇18N44中熱激蛋白Hsp60表達(dá)載體的構(gòu)建

將香菇菌株18N44接種到PDA平板上，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)2周，直至長(zhǎng)滿(mǎn)平板，然后將菌種與培養(yǎng)基一同轉(zhuǎn)移到勻漿機(jī)中，加入100mL的馬鈴薯肉湯培養(yǎng)基，低速15s高速15s再低速15s，打碎后吸取10mL至裝有培養(yǎng)液的三角瓶中。25℃、150r/min培養(yǎng)1周，收集菌絲。

(1)香菇菌絲RNA的提取

采用Redzol試劑盒提取香菇菌絲的總RNA，具體操作如下：

①向經(jīng)無(wú)RNA酶處理過(guò)的2mL離心管中加入1mL的Redzol裂解液，然后置于冰上。

②液氮預(yù)冷研缽、研棒、藥匙，將菌絲在液氮中研磨成粉末，然后加入到含有Redzol裂解液的離心管中，上下顛倒，充分混勻，常溫下靜置5min，使樣品充分裂解。

③加200μL的氯仿，劇烈震蕩，常溫靜置3min，在4℃、12000rpm條件下離心15min。離心后EP管中的液體分成三相，RNA在上層水相中。

④將上清液轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，加500μL的異丙醇，充分混勻后冰上靜置10min沉淀RNA。

⑤在4℃、12000rpm條件下離心10min，棄上清。

⑥加入現(xiàn)配的75％乙醇1mL，漂洗2-3次RNA沉淀。

⑦在4℃、7500rpm條件下離心5min，棄掉上清，并用移液槍吸去殘液。

⑧在超凈臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)管的蓋子，干燥RNA沉淀，6-10min，然后加入60μL DEPC水，溶解RNA，溶解6-10min。

⑨用1.0％的瓊脂糖電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量，并用NADO測(cè)定RNA樣品濃度，暫時(shí)不用的RNA于-80℃冰箱中保存。

(2)香菇菌絲RNA的反轉(zhuǎn)錄

①去除總RNA中的基因組DNA

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，對(duì)香菇菌絲RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作在冰上進(jìn)行。去除基因組DNA的反應(yīng)體系如下：Total RNA 1μg，gDNA Eraser 1μL，5×g DNA Erase Buffer 2μL，RNase Free dH₂O，up to 10μL。反應(yīng)條件：42℃2min，4℃保存。②反轉(zhuǎn)錄為cDNA

為了確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和一致性，先配制好母液然后分裝到各反應(yīng)管中，操作在冰上進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：RT Primer Mix 1μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4μL，Reaction solution from Step 1 10μL，RNase Free dH₂O，up to 20μL。反應(yīng)條件：42℃2min，37℃15min，85℃5s，4℃保持。

(3)常規(guī)PCR擴(kuò)增目的片段

利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)香菇熱激蛋白Hsp60基因的引物，并且用DNAMAN分析找到相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。引物交由上海捷瑞生物公司合成，使用前用無(wú)菌雙蒸水稀釋到10mol/L。引物序列如下：

5’-CGGATCCGATGCATCACCTGTCGACCAA-3’；

5’-GGAATTCCAGGAGCAGCTGGCTTCTCTT-3’。

PCR反應(yīng)體系：正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL，dNTP(10mmol/L)1μL，Loading Buffer(10×)2.5μL，Tap酶(5U/μL)0.25μL，ddH₂O 18.25μL，Total 25μL。反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

(4)PCR目的產(chǎn)物的純化與回收

按照AxyPrep DNA試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR目的產(chǎn)物進(jìn)行回收。取3μL的純化產(chǎn)物，用1.5％瓊脂糖電泳檢測(cè)回收的純度。

(5)連接反應(yīng)

將純化后的PCR產(chǎn)物連接到T載體上，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，連接的反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物2μL，Vector 0.5μL，T4DNA Ligase 0.5μL，2×Rapid Ligation Buffer5μL，ddH₂O 2μL，Total 10μL。反應(yīng)條件：吹打混勻，在4℃條件下，過(guò)夜連接。

(6)克隆轉(zhuǎn)化

①向每個(gè)含有Amp抗性的LB平板上，加入40μL X-GAL(20mg/mL)和16μL IPTG(200mg/mL))，并涂布均勻；

②準(zhǔn)備好冰盒，在冰上操作，簡(jiǎn)短離心連接反應(yīng)液，將10μL連接反應(yīng)液全部加入到1.5mL無(wú)菌離心管中；

③取出感受態(tài)細(xì)胞TOP10，置于冰上融化，然后吸取50μL加入到步驟②的離心管中，用槍頭輕輕吸打混勻，置于4℃，30min；

④將步驟③中的反應(yīng)液，置于42℃，熱激50s，冰上冷卻2min；

⑤加入800μL的液體LB，37℃，220rpm，40-60min，搖床振蕩培養(yǎng)；

⑥將步驟⑤中的菌液，5000rpm，2min，吸掉750μL上清，然后將菌液吸打混勻；

⑦取80μL菌液涂布到步驟①準(zhǔn)備的平板培養(yǎng)基，37℃，靜置5-10min，然后倒置，過(guò)夜培養(yǎng)；⑧準(zhǔn)備好無(wú)菌的2.0mL的離心管，加入1mL含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基，然后挑取白色菌落，置于相應(yīng)的離心管中，37℃，220rpm，5-6h；

⑨將搖好的菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，1.5％凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，選取3個(gè)陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。

(7)質(zhì)粒的提取

提取測(cè)序驗(yàn)證正確的菌液質(zhì)粒，在超凈工作臺(tái)上，挑取經(jīng)驗(yàn)證的單菌落，接到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，150rpm恒溫震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。按照質(zhì)粒快速提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒用1.0％凝膠電泳驗(yàn)證，然后以每管10μL進(jìn)行分裝，于-20℃冰箱保存。(8)目的片段酶切

將目的片段進(jìn)行酶切，其反應(yīng)體系為：T載體重組質(zhì)粒40μL，EcoRⅠ3μL，BamHⅠ3μL，10×M Buffer 10μL，ddH₂O 44μL，Total 100μL。酶切條件：4℃3h。將酶切反應(yīng)液進(jìn)行片段回收，按照AxyPrep DNA試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR目的產(chǎn)物進(jìn)行回收，然后用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段。

(9)酶連反應(yīng)

酶連反應(yīng)的體系為：目的片段2μL，pET-32a Vector 1μL，EcoRⅠ0.5μL，BamHⅠ0.5μL，10×H Buffer 5μL，ddH₂O 1μL，Total 10μL。反應(yīng)條件：4℃過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，經(jīng)過(guò)菌落PCR驗(yàn)證后送菌樣至生工測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果與克隆全長(zhǎng)比對(duì)匹配。

實(shí)施例2

香菇熱激蛋白Hsp60基因的原核表達(dá)及蛋白功能驗(yàn)證

(1)提取測(cè)序成功的pET-32a/Hsp60重組質(zhì)粒，然后將pET-32a/Hsp60載體重組質(zhì)粒以及pET-32a空載體質(zhì)粒分別導(dǎo)入到大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21中。

(2)大腸桿菌的熱激處理

①吸取60μL驗(yàn)證正確的菌液，然后涂布到含有Amp的LB平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；

②挑取單菌落，接種到含有5mL LB+Amp培養(yǎng)基中，37℃，150r/min過(guò)夜培養(yǎng)；

③取1mL活化后的培養(yǎng)液加到100mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/min培養(yǎng)2.5-3h，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)待OD600達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；

④繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后用含有Amp的LB培養(yǎng)基將菌液稀釋104倍，轉(zhuǎn)入到50℃的水浴鍋中，分別熱激0min、30min、60min、90min、120min；

⑤取熱激處理后的菌液80μL，涂布在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃，過(guò)夜培養(yǎng)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

(3)大腸桿菌原核表達(dá)蛋白Hsp60的提取

①取1mL活化后的培養(yǎng)液加到100mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/min培養(yǎng)2.5-3h，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)待OD600達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；

②加入IPTG后，繼續(xù)培養(yǎng)2h，將菌液轉(zhuǎn)移到50mL無(wú)菌的離心管中，在4℃、5000r/min的條件下離心2min；

③向無(wú)菌離心管中加入25mL的PBS，然后用槍頭將菌體吸打混勻，加入20μL Protease Inhibitor Cocktail，保護(hù)蛋白免受損傷；

④將處理好的菌體用超聲破碎，工作3s，間歇5s，工作電壓300W，破碎時(shí)間20-30min；

⑤將破碎后的菌體轉(zhuǎn)入到無(wú)菌的50mL的離心管中，在4℃、8000r/min下離心20min；

⑥取離心后的上清50μL于無(wú)菌小離心管中，加入12.5μL的5×蛋白Loading Buffer，沸水中煮10min，再取200μL，放于-80℃中保存。

(4)大腸桿菌原核表達(dá)蛋白Hsp60的SDS-PAGE分析

①將玻璃板、電泳架、電泳槽等用清水沖洗干凈，用濾紙將玻璃板擦拭干凈，然后安裝好電泳裝置；

②用移液槍在玻璃板的左上角注入濃度為15％的分離膠，給濃縮膠留足夠的空間，然后注入雙蒸水，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，30min，水封能夠?qū)⒎蛛x膠壓平并且能防止空氣中的氧使凝膠聚集；

③分離膠固定好后，將水封的雙蒸水倒掉，用吸水紙洗干凈；

④配制濃度為5％的濃縮膠，用移液槍在玻璃板的左上角注入濃縮膠，插入梳子，然后置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱，30min，插入時(shí)應(yīng)小心避免產(chǎn)生氣泡；

⑤待濃縮膠固定后，將梳子拔出，然后用雙蒸水清洗膠板，將膠板固定在電泳槽中，向上下電泳槽中注入現(xiàn)配制的電泳緩沖液，檢驗(yàn)電泳槽是否有泄漏；

⑥按照次序，依次在上樣孔中注入16μL的蛋白樣品；

⑦在濃縮膠時(shí)，電壓設(shè)置為100V，當(dāng)顯示溴酚藍(lán)指示劑跑出濃縮膠的底部時(shí)，將電壓改為140V，繼續(xù)進(jìn)行分離膠的電泳，當(dāng)顯示溴酚藍(lán)指示劑跑到分離膠的底部時(shí)，停止電泳；

⑧電泳結(jié)束后，將膠置于干凈的盒子中，用雙蒸水沖洗15min，重復(fù)3次，然后加入考馬斯亮藍(lán)染液，染色30min；

⑨染色完畢后，將考馬斯亮藍(lán)染液置于回收瓶中，然后加入雙蒸水，置于微波爐中，中火微波15-20s，清洗數(shù)次，然后加入脫色液，覆蓋凝膠表面，20-25min換一次脫色液，直至退去凝膠的考馬斯亮藍(lán)藍(lán)色背景，觀察到清晰的蛋白質(zhì)條帶；

⑩對(duì)蛋白質(zhì)凝膠拍照，然后進(jìn)行結(jié)果分析。

由SDS-PAGE電泳圖譜(圖7、圖8)可知：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在45kDa-60kDa之間，重組組中出現(xiàn)一條表達(dá)量顯著高于對(duì)照組的特異性蛋白條帶，該條帶與熱激蛋白Hsp60的分子量相吻合，表明香菇熱激蛋白Hsp60在大腸桿菌中異源表達(dá)成功。

(5)熱激處理下大腸桿菌存活率的測(cè)定

將過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，數(shù)出不同處理?xiàng)l件下各平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌落數(shù)(Soto et al,1999；李翠翠，2009；孫翔英，2014)，分別以處理0min平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌落數(shù)為對(duì)照組，由熱激后的存活率柱形圖(圖9)可以看出，在熱激處理30min和60min時(shí)，重組組的存活率要顯著高于對(duì)照組，證明了香菇熱激蛋白Hsp60基因的導(dǎo)入及表達(dá)確實(shí)提高了大腸桿菌BL21在高溫脅迫條件下的存活率。