專利名稱：一種雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記及其獲取方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性 相關(guān)分子標記及其獲取方法和應用。
背景技術(shù)：
分子標記輔助選擇育種，是基因工程在現(xiàn)代家禽育種中的一項重要應用，通過分 子標記的方法進行現(xiàn)場育種，不僅能縮短育種時限，大大減少育種的人力物力消耗，另外分 子標記的多樣性更使得分子標記輔助選擇育種在現(xiàn)場育種中的應用潛力大大提高。高溫季 節(jié)容易引起雞產(chǎn)生熱應激，導致生長發(fā)育緩慢，免疫力降低，發(fā)病率和死亡率升高，給集約 化的養(yǎng)雞生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前生產(chǎn)中主要采取通風降溫、日糧調(diào)控等綜合措施 來緩解雞的熱應激反應，但這并不能從根本上解決熱應激對現(xiàn)在家禽養(yǎng)殖的影響。因此，通 過育種的途徑改善個體本身的熱適應性是今后家禽遺傳育種重要的研究方向之一，而分子 標記是達到這一目的的重要手段。耐熱力是一種適應能力，通過遺傳育種手段增強家禽自身對高溫的耐受力，培育 耐熱品系是消除熱應激的根本措施，是家禽的育種方向之一，而確定耐熱指標是選育耐熱 品系的基礎(chǔ)。皮質(zhì)酮可以作為一個準確的評價家禽應激狀況的生理指標，應激會引起皮質(zhì) 酮的大量分泌。血漿皮質(zhì)酮水平降低時，代謝速度減慢，產(chǎn)熱減少；而當血漿皮質(zhì)酮水平升 高時，代謝強度加強，產(chǎn)熱增多。淋巴細胞是重要的免疫細胞，包括τ細胞和B細胞，分別直 接參與細胞免疫和體液免疫應答，在機體免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，其數(shù)量的多少與免 疫性能息息相關(guān)。當機體受到外界刺激時(如病原體入侵，熱應激等)，淋巴細胞和單核細胞 在血液中的含量會下降，異嗜性粒細胞增加，因此異嗜性粒細胞(H)與淋巴細胞(L)的比值 升高。因此H、L和H/L值不僅是獸醫(yī)臨床上常用的檢測方法，也是家禽抗病育種上的一個 重要的免疫性狀，H/L值的變化與家禽的應激程度密切相關(guān)，可以作為檢測家禽應激程度的 一項準確指標。由甲狀腺分泌的三碘甲狀腺原氨酸(T3)與應激有重要關(guān)系，T3水平下降 時，代謝速度減慢，產(chǎn)熱減少，反之亦然，是敏感的熱應激指標。T淋巴細胞群是檢測機體細 胞免疫功能的重要指標，CD (Cluster of Differentiation)是指位于細胞膜上一類分化 抗原的總稱。在抗原識別過程中，CD3+T細胞起著信號傳導作用。CD4+T細胞具有輔助細胞 免疫和體液免疫應答的作用，CD3+、CD4+T細胞水平降低，機體的免疫水平也隨之降低。目前熱應激抗性候選基因研究主要集中在熱應激蛋白家族(HSP)，其中HSP70是 熱應激蛋白家族中重要成員，作為主要的分子伴侶參與機體耐受性的形成。HSP70在應激 適應性過程中起著重要的作用，所以Hsp70基因的多態(tài)性可能與易感性、疾病等應激存在 重要的關(guān)聯(lián)。目前針對雞熱適應性的分子標記研究比較少，中國專利申請200910210772. 7 公開了一種篩選耐熱性奶牛的SNP位點及檢測方法，該SNP位點為奶牛HSP70A1A基因上的 堿基。通過該位點可以通過單倍型組合確定耐熱性狀，進行奶牛的早期篩選。本發(fā)明在雞 Hsp70的編碼區(qū)找到的耐熱性分子標記為首次報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的耐熱性雞品種的篩選中存在的無法從本質(zhì)上減少 熱應激的缺點，利用輔助分子標記的方法，從遺傳育種上改良雞的耐熱性的雞熱應激蛋白 70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記。本發(fā)明另一目的在于提供上述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記的 獲取方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標 記的應用。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
一種雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記，所述耐熱性相關(guān)分子標記為 A+258G 和 C+1437T。上述利用分子標記對雞耐熱性的獲取方法，包括如下步驟
(1)雞基因組DNA的提取；
(2)設計2對特異性引物，其核苷酸序列如SEQID NO:廣4所示，進行PCR擴增；
(3)擴增產(chǎn)物分型，A+258G位點利用PCR產(chǎn)物測序分型，C+1437T位點利用酶切分型。作為一種優(yōu)選方案，上述步驟中，步驟(1)中所述雞血為抗凝血，抗凝劑為EDTA或 肝素鈉。所述提取是用苯酚_氯仿抽提法或試劑盒抽提。作為一種優(yōu)選方案，上述步驟中，步驟(2)中所述PCR擴增的反應體系為Mix占 反應體系的50%，上游引物和下游引物各l(T20pmol，Taq酶占反應體系的0. 75%，基因組 DNA0.廣lug，加滅菌雙蒸水至反應總體積。所述PCR擴增的反應程序為
94X3-Sumi
94 VMs ι
6(fC JOs^ .JO.. .J 5 個循環(huán)
？C JOs J
sC 后延伸 5-Mtaiiii6
作為一種優(yōu)選方案，上述步驟中，步驟(3)中所述酶切分型的酶切反應體系為PCR產(chǎn) 物8 10 μ L，內(nèi)切酶3飛U，IOX緩沖液為內(nèi)切酶體積的2倍，37°C水浴過夜，用2. 5%的瓊 脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶判斷個體的基因型，位點C+1437T酶切產(chǎn)物檢 測到三種基因型，其中TT基因型為一條371bp的條帶；CC基因型為兩條分別為193bp和 178bp的條帶；CT基因型為三條分別為371bp、193bp和178bp的條帶。其中，所述內(nèi)切酶為 Tsp A5 I。本發(fā)明雞血基因組DNA的抽提包括以下具體步驟
30ul抗凝血+470ul 1XSET+12. 5ul 20% SDS+5ul蛋白酶K混勻，55°C水浴過夜消化 (注要按順序加)
加Tris飽和酚500ul，搖勻(20min)，離心。
取上清于干凈1.5ml離心管，加入500ul Tris飽和酚，搖勻，離心。取上清于干凈1. 5ml離心管，加入500ul氯仿一異戊醇(23 1 )，搖勻，離心。取上清于干凈1. 5ml離心管，加入無水乙醇(-20°C) lOOOul，搖勻，冰凍于-20°C， 20 30min。棄上清，加入IOOOul 75%乙醇，搖勻，離心。
棄上清，烘干，加入適量TE，55°C水浴過夜。本發(fā)明雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記可以通過遺傳育種，增強 雞對高溫的耐受力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記通過遺傳育種，增強雞對高溫 的耐受力，所采用的方法具有條件簡單，價格低，可信度高等優(yōu)點，用于選擇熱適應性較好 的種雞具有重要作用。


圖1為A+258G位點測序分型示意圖2為C+1437T酶切電泳圖，其中，M為DL2000的Marker，自上而下分別為2000、1000、 750、500、100bp。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
實施例分別在室內(nèi)環(huán)境溫度為35°C和15°C時翅下靜脈采集333個矮腳黃血液分裝成三 管非抗凝血1 2mL，血清用于測定T3和皮質(zhì)酮；抗凝血1 2mL，用于測定H/L，及⑶3+、 CD4+。抗凝血l_2ml，用于基因組DNA的抽提。其中非抗凝血直接離心吸取血清，利用酶聯(lián) 免疫吸附法測定T3和皮質(zhì)酮；抗凝血用于測定H/L，用瑞氏和吉姆薩染復合染色法對血涂 片染色，鏡檢，按Alfred的白細胞分類方法進行細胞分類，并按Campo的方法進行計數(shù)和計 算；CD3+、CD4+利用流式細胞儀檢測。抽提666個血液樣本的基因組DNA，每個樣本取10ul，分別制成各樣本DNA稀釋 液，以DNA稀釋液為模板，按照申請專利說明的PCR反應體系配制反應體系，并按相應反應 程序進行PCR擴增。位點A+258G的PCR擴增產(chǎn)物直接測序分型，測序分型結(jié)果見圖1 ；位點 C+1437T的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測擴增結(jié)果良好的產(chǎn)物進行酶切分型，酶切效果圖 如圖2，酶切產(chǎn)物檢測到三種基因型，分別為CC (178bp、193bp)、CT (371bp、178bp、193bp)、 TT (371bp)；分型結(jié)果與測定的耐熱性狀進行相關(guān)分析，分析結(jié)果如下表1
表1位點A+258G和C+1437T與耐熱性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
權(quán)利要求
一種雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記，其特征在于所述耐熱性相關(guān)分子標記為A+258G和C+1437T。
2.權(quán)利要求1所述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記的獲取方法，其特征 在于包括如下步驟(1)雞基因組DNA的提?。?2)設計2對特異性引物，其核苷酸序列如SEQID NO:廣4所示，進行PCR擴增；(3)擴增產(chǎn)物分型，A+258G位點利用PCR產(chǎn)物測序分型，C+1437T位點利用酶切分型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記的獲取方法，其 特征在于步驟(1)中所述雞血為抗凝血，抗凝劑為EDTA或肝素鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記的獲取方法，其 特征在于步驟(1)中所述提取是用苯酚_氯仿抽提法或試劑盒抽提。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記的獲取方法，其 特征在于步驟(2)中所述PCR擴增的反應體系為Mix占反應體系的50體積％，上游引物和 下游引物各l(T20pmol，Taq酶占反應體系的0. 75體積％，基因組DNA0.廣lug，加滅菌雙蒸 水至反應總體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記的獲取方法，其 特征在于步驟(2)中所述PCR擴增的反應程序為
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記的獲取方法，其 特征在于步驟(3)中所述酶切分型的酶切反應體系為PCR產(chǎn)物纊10yL，內(nèi)切酶;T5U，10X 緩沖液為內(nèi)切酶體積的2倍，37°C水浴過夜，用2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，根據(jù) 電泳條帶判斷個體的基因型，位點C+1437T酶切產(chǎn)物檢測到三種基因型，其中TT基因型為 一條371bp的條帶；CC基因型為兩條分別為193bp和178bp的條帶；CT基因型為三條分別 為 371bp、193bp 和 178bp 的條帶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記的獲取方法，其 特征在所述內(nèi)切酶為TspA5 I。
9.權(quán)利要求1所述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記的應用，其特征在于 所述雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記通過遺傳育種，增強雞對高溫的耐受 力。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞熱應激蛋白70基因上的耐熱性相關(guān)分子標記及其獲取方法和應用。本發(fā)明耐熱性相關(guān)分子標記是在雞熱應激蛋白70基因編碼區(qū)的A+258G和C+1437T得到的。通過對熱應激蛋白70進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物直接進行測序篩查單核苷酸多態(tài)位點，將所得分型結(jié)果與雞的耐熱形狀指標進行關(guān)聯(lián)分析，顯著相關(guān)的多態(tài)位點確定為耐熱性相關(guān)分子標記，得到A+258G和C+1437T。本發(fā)明通過獲取得到耐熱性相關(guān)分子標記，可以培育出耐熱品系的雞，通過遺傳育種的方法從根本上增強了雞自身對高溫的耐受力。
文檔編號C12Q1/68GK101948832SQ201010282780
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者張細權(quán), 江麗燕, 甘建伉, 羅慶斌, 聶慶華, 肖雄, 陳曉芬 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學