專利名稱：融合蛋白一步催化制備n-乙酰神經(jīng)氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種融合酶蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，屬于生物 工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
N-乙酰神經(jīng)氨酸是一個含9個碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖，廣泛存在 于許多生物體內(nèi)，隨著生物進化程度的增加，唾液酸及衍生物在生物體內(nèi)的含量亦增加。在 動物體內(nèi)和多種微生物表面，因唾液酸帶有一個羧基而賦予細胞和許多復(fù)合糖的負電荷性 質(zhì)。在細胞與細胞之間、細胞與外界環(huán)境之間的信號傳遞和識別過程中，唾液酸殘基起著至 關(guān)重要的作用。經(jīng)過近十幾年的發(fā)展，糖生物學(xué)和糖化學(xué)在生物工程和制藥工業(yè)中的作用 日顯重要。在以糖為基礎(chǔ)的治療藥物中，流感病毒唾液酸酶抑制劑的開發(fā)是一個成功的例 子。如上所述，由于唾液酸酶對于新生成病毒從細胞表面的唾液酸受體釋放是必需的，因此 抑制唾液酸酶可終止病毒的復(fù)制，呈現(xiàn)該病的嚴重性減弱和病程縮短。如葛蘭素公司推出 的抗病毒新藥Zanamivir就是N-乙酰神經(jīng)氨酸的類似物。唾液酸是一種必需的和豐富的定位于細胞表面聚糖末端的氨基糖。它在很多生物 學(xué)中有重要作用，比如病毒侵染，病毒的神經(jīng)氨酸酶移走受感染細胞表面的唾液酸是其形 成病毒顆粒后進行釋放的基本步驟。因此唾液酸類似物被廣泛的應(yīng)用于抗病毒藥物。如葛 蘭素公司推出的抗病毒新藥Zanamivir就是N-乙酰神經(jīng)氨酸的類似物，可以阻抑A和B型 流感病毒的神經(jīng)氨酸酶，它已經(jīng)被商業(yè)化生產(chǎn)，用于避免高致病H5W病毒的感染。由于唾液酸存在于人乳中，并且大量研究已經(jīng)證實唾液酸對于增強嬰兒的免疫力 和提高大腦的發(fā)育有重要作用，唾液酸可以添加到一些嬰幼兒奶粉中。因此唾液酸的規(guī)模 化生產(chǎn)對于醫(yī)藥及食品工業(yè)有重要的作用。唾液酸的酶法合成主要是以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸鈉為底物，在N乙酰神經(jīng)氨 酸醛縮酶的作用下生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。但是由于N-乙酰甘露糖胺的價格昂貴，所以實 際上有“化學(xué)加酶法”和“雙酶法”兩種方法?！盎瘜W(xué)加酶法”是將廉價的N乙酰葡萄糖胺在 堿性條件下進行異構(gòu)化生成N-乙酰甘露糖胺，但是此方法回收率較低，環(huán)境污染嚴重，限 制了其大規(guī)模應(yīng)用。“雙酶法”是采用N乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶制備成N-乙酰甘露 糖胺，但是該酶提取困難，重組表達的酶活比較低，并且兩個酶催化兩步反應(yīng)工藝復(fù)雜，不 能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，公開了一種融合蛋白一步催化制備N-乙 酰神經(jīng)氨酸的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng) 氨酸的方法，其特征是包括以下步驟(1)利用重疊PCR技術(shù)，將N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的基因連在一起，導(dǎo)入畢赤酵母宿主細胞中，從而獲得具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向 異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸異構(gòu)酶活性的融合蛋白；(2)反應(yīng)體系的pH為6. 5-8.0，反應(yīng)溫度為30_40°C，N-乙酰葡萄糖胺與丙酮酸及 其鹽的重量比為1-1. 2，將N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其鹽與游離的融合酶蛋白或者固定 化的融合蛋白混勻，反應(yīng)得到混合物；(3)從反應(yīng)混合物分離制備N-乙酰神經(jīng)氨酸。所述的步驟⑴中的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶為 E. C. 5. 1. 3. 8 ；融合蛋白中N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶為E. C. 4. 1. 3. 3。所述的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶包括具有N-乙酰葡萄糖 胺-2-差向異構(gòu)酶活性的多肽，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶包括具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶 活性的多肽；所述的融合蛋白的融合方式(1)第一區(qū)位于融合蛋白的N端，第二區(qū)位于融合蛋 白的C端；(2)第一區(qū)位于融合蛋白的C端，第二區(qū)位于融合蛋白的N端；優(yōu)選的融合方式為N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶N端與N-乙酰神經(jīng)氨酸異構(gòu) 酶C端融合。所述的步驟(1)中的融合蛋白還包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙 酰神經(jīng)氨酸異構(gòu)酶之間加入0-30個長度的氨基酸作為連接肽。所述的步驟(1)中的融合蛋白還包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙 酰神經(jīng)氨酸異構(gòu)酶之間加入10個氨基酸長度或(G4S)5作為連接肽，優(yōu)選(G4S)5作為連接 肽。所述的反應(yīng)體系的pH為6. 5-8. 0，反應(yīng)溫度為30_40，N-乙酰葡萄糖胺與丙酮酸 及其鹽的重量比為1-1. 8，其中優(yōu)選PH 7. 5，溫度36°C，N-乙酰葡萄糖胺與丙酮酸及其鹽的 重量比為1.5倍。所述的步驟(1)中的融合蛋白存中的融合蛋白包括在于宿主細胞內(nèi)表達或從宿 主中分泌出來，優(yōu)選胞內(nèi)表達。所述的融合蛋白的宿主細胞是細菌或酵母或動物細胞或植物細胞，優(yōu)選酵母細 胞，更優(yōu)選畢赤酵母。所述的步驟(1)中的融合蛋白包括固定后的酶蛋白。所述的步驟(2)中固定化的融合蛋白所用的載體為高分子合成材料或木炭或陶 瓷或玻璃或纖維素，優(yōu)選Amberlite FPA。本發(fā)明將以前的兩步反應(yīng)中的兩個酶融合表達，從而顯著簡化了生產(chǎn)工藝流程和 降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明中由于融合蛋白中兩酶的活性中心位點鄰近，使得酶促反應(yīng)的效率 得到了極大的提高。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化效率達到了 60%以上，并且能在30h內(nèi)完成催化反應(yīng)，該 方法操作簡便，對N-乙酰神經(jīng)氨酸在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)上有較大意義。


圖1顯示本發(fā)明的一個實施例中制得的唾液酸產(chǎn)品的HPLC圖；圖2a顯示唾液酸標品紅外掃描；圖2b顯示本發(fā)明的一個實施例中制得的唾液酸產(chǎn)品紅外掃描。
具體實施例方式實施例1用于本發(fā)明中的酶包括不含額外序列的酶，N端或者C端有氨基酸殘基缺失的酶 及含有額外序列的酶(如帶有標簽序列)的蛋白或多肽，只要這些變異的N-乙酰葡萄糖 胺-2-差向異構(gòu)酶仍然保留其天然形式所具備的催化N-乙酰葡萄糖胺形成N-乙酰甘露糖 胺的活性，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶仍然保留其天然形式所具備的催化N-乙酰甘露糖胺和 丙酮酸及其鹽形成N-乙酰神經(jīng)氨酸的活性即可。其中優(yōu)選融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶是指E. C. 5. 1. 3. 8,N-乙 酰神經(jīng)氨酸醛縮酶是指E. C. 4. 1. 3. 3。本發(fā)明使用的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶來源廣泛，包括但不限于豬腎，猴 腎，人腎，酵母及藍藻，優(yōu)選藍藻，更優(yōu)選藍藻中的魚腥藻屬(Anabaena sp.)。本發(fā)明使用本領(lǐng)域中常見的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶來源廣泛，包括但不限于 大腸桿菌屬(Escherichia)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，桿菌屬(Bac terium)，假單胞桿 菌屬(Pseudomonas), Breviba terium氣桿菌屬(Aerobacter)等，其中優(yōu)選大腸桿菌屬 (Escherichia)，更優(yōu)選N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶來源E. coli. K12株系。本發(fā)明表達載體可以通過商業(yè)途徑獲得，包括但不限于細菌表達載體PET_32a， PET-22b, PET-28a, pBV220 等；酵母表達載體 pHIL-D，pPIC9k, pPIC3. 5K, pPICZa pPICZ, pGAPZa，pGAPZ，pYES等；動物細胞表達載體pSVK3，pMSG，pcDNA3. 1等。優(yōu)選酵母表達載體， 更優(yōu)選PPIC3. 5K。大腸桿菌的表達系統(tǒng)的啟動子可以是任何一種。如trp啟動子(P trp)Uac啟動 子(P lac)、T7啟動子、PL啟動子、I3R啟動子，PSE啟動子等來源于大腸桿菌或噬菌體的啟 動子，優(yōu)選T7啟動子。酵母表達系統(tǒng)的啟動子可以是其中任意一種。如GAP啟動子，AOXl啟動子，PGK啟 動子，ADH啟動子等。優(yōu)選的方法是將融合蛋白基因克隆到載體pPIC3. 5k，這是酵母整合型 質(zhì)粒，帶有His4選擇標記。醇氧化酶操縱子(AOXl)兩側(cè)的序列用于編碼基因整合至酵母 染色體，并控制編碼基因的表達。優(yōu)選啟動子為A0X1。一、BP融合基因片段的PCR擴增(1)利用引物設(shè)計軟件，根據(jù)測序結(jié)果中的基因序列設(shè)計下列引物(2)以魚腥藻的基因為模板，引物1和2，PCR擴增N-乙酰葡萄糖胺_2_差向異構(gòu) 酶基因。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶基因 IyL弓I物一 5，gaattcatggggaaaaacttacaagcactggcg-3‘弓丨物二 5，-cgcggggattcaactcaacgcctcgaa-3，弓丨物三5，-ttcgaggcgttgagttgaatccccgcg-3，弓I物四5，-gcggccgcatggcaacgaatttacgtggcgtaatg-310XPCR Buffer 5 μ LdNTPs(2. 5mmol/L) 4μ L引物 l(10ymol/L) 1 μ L
引物 2(10ymol/L)1 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 5 μ L加ddH20 至終體積為 50 μ L ；94°C預(yù)變性 4min ；94°C變性 30s，57°C退火 30s，72°C 延伸20s，循環(huán)35次；72°C最終延伸7min ；4°C保存；(3)以大腸桿菌K12菌株的基因組為模板，引物3和4為，PCR擴增N-乙酰神經(jīng)氨 酸醛縮酶基因。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下N-乙酰神經(jīng)氨酸醛締酵酶基因1 μ L
10XPCR Buffer5 μ L
dNTPs(2. 5mmol/L)4μ L
引物 3(10ymol/L)1 μ L
引物 4(10ymol/L)1 μ L
Taq DNA 聚合酶(5U/'yL)0. 5μ L
加ddH20至終體積為50 μ L ；94°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s, 57°C退火30s, 72°C
延伸20s，循環(huán)35次；72°C最終延伸7min ；4°C保存。二、基因的體外拼接(1)將兩純化后的PCR產(chǎn)物1 1混合作為模板，重疊PCR體外拼接N-乙酰葡萄 糖胺-2-差向異構(gòu)酶基因和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下混合的模板2yL10XPCR Buffer5μ LdNTPs(2. 5mmol/L)4μ L
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5 μ L加ddH20 至終體積為 50 μ L ；94°C預(yù)變性 2min ；94°C變性 30s，44°C退火 30s，72°C 延伸15s，循環(huán)8次；72°C最終延伸7min ；之后立即向反應(yīng)體系中加入lOymol/L的引物1 和引物3各1 μ L，改變退火溫度為54°C，延伸時間為20s，繼續(xù)進行PCR擴增，循環(huán)30次；(2)上述PCR產(chǎn)物進行純化，回收融合蛋白BP基因。將得到的融合基因(BP)克隆至T載體，經(jīng)測序驗證后，連接有目的基因的T載體 經(jīng)EcoRl和Notl雙酶切，凝膠電泳后割膠回收，載體pPIC3. 5K經(jīng)同樣處理后與前者通過T4 連接酶16°C連接過夜。將連接過夜的DNA轉(zhuǎn)化E. coliDH5a感受態(tài)細胞。然后從E. coli DH5 α轉(zhuǎn)化子中提取pPIC3. 5K/BP質(zhì)粒，為轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞做好準備。三、畢赤酵母感受態(tài)酵母細胞的制備(1)從新活化的YPD平板上挑取單菌落，接種到裝有IOmL YPD培養(yǎng)基的50mL三角 瓶中，30°C，180r/min過夜培養(yǎng)。(2)將過夜培養(yǎng)的種子以0. 1 %的接種量接種到裝有150mL YPD培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，30°C，150r/min培養(yǎng)至A600 = 1.3左右。(3)取IOOmL 培養(yǎng)好的菌液分裝至兩個50ml的離心管中，4°C，8000r/min，5min離心棄上清。(4)每管用 40ml預(yù)冷無菌水重懸菌體沉淀，4°C，8000r/min，5min離心棄上清。重復(fù)此步驟一次。(5) 用滅過菌的預(yù)冷的lmol/L山梨醇溶液IOmL重懸菌體沉淀，4°C，8000r/min，5min離心棄上 清。(6)用無菌的lmol/L山梨醇溶液300 μ L重懸菌體沉淀，分裝至無菌1. 5mL離心管中， 每支100 μ L放于冰上待用。四、畢赤酵母感受態(tài)細胞的電擊轉(zhuǎn)化
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取0. 1 μ g (彡5 μ L) all線性化處理的重組質(zhì)粒pPIC3. 5K/BP與100 μ L酵母感 受態(tài)細胞混勻；將酵母和轉(zhuǎn)化DNA混合物轉(zhuǎn)移到冰冷的0. 2cm間隙的電擊池中；按一般真 菌轉(zhuǎn)化的設(shè)置(1. 5kV、25 μ F、200 Ω、時間參數(shù)5ms)，進行電擊轉(zhuǎn)化；電擊結(jié)束后立即加入 600 μ 1 lmol/L冰冷的山梨醇，混勻后各取200 μ 1分別涂布到含有l(wèi)mol/L山梨醇的MD平 板上，30°C培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。五、畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的篩選方法從YPD平板上挑一單菌落接入到搖瓶生長培養(yǎng)基(100mL/500mL三角瓶)，30°C， 220rpm,培養(yǎng)24 30h (A600 = 20左右)。4°C，3000rpm離心收集菌體，棄去上清液，接入至 20mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(濃縮4倍)，30°C，220rpm，每24h補加3%甲醇，誘導(dǎo)72 96h。下?lián)u 床離心后，收集菌體，細胞破碎測酶活，經(jīng)過大量篩選，最終獲得一株酶活較高的菌株(G3)。酶活定義lu酶活定義為每分鐘產(chǎn)生1 μ mol N-乙酰神經(jīng)氨酸所需酶量。實施例2工程菌GS115/G3的發(fā)酵及酶蛋白的固定化從新鮮的斜面上挑取一環(huán)種子，接種到已滅好菌的IOOml的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 16-18h，接種到2L基礎(chǔ)培養(yǎng)基BSM中，8-10h左右溶氧(DO)達到最低并開始反彈，此時開始 流加甘油，使溶氧維持在20%左右，當A600達到100左右，即開始甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)60h左右 后下罐。8000rpm離心20min收集菌體。將發(fā)酵收集的菌體稱取500克，加入IL水重懸，壓力lOOObar，共破碎兩次。破碎 后15000rpm離心30min，得到1. IL融合酶蛋白的粗酶液。將高壓破碎和去雜蛋白后所得的粗酶固定化到載體上得到固定化酶，一種優(yōu)選 的方法是按照粗酶液量載體量=1-20 1的投入載體，在反應(yīng)器中固定12-48h，溫度 18-30°C, pH 6. 5-8. 5。然后將載體和融合酶酶蛋白放入發(fā)酵罐中，30°C，150rpm，固定24h。固定完畢用 IM的磷酸緩沖(pH8.0)液洗載體，然后離心測得酶活25U/g。實施例3轉(zhuǎn)化稱取200g固定好的酶蛋白，投入到IL的反應(yīng)體系中(N-乙酰葡萄糖胺1. 2M，丙酮 酸鈉0. 8M，ATP IOOMm, pH 7. 6)，混勻后，30°C，160rpm反應(yīng)，28h后離心放罐，收集轉(zhuǎn)化液。實施例4結(jié)晶將實施例3中所得到的轉(zhuǎn)化液14000rpm，離心15min，去除雜質(zhì)。活性炭60°C脫色 lh，濃縮5倍，加入10倍體積的乙醇，4°C結(jié)晶4-5天。三足式離心機離心收集唾液酸晶體， 烘干4-5天，HPLC檢測唾液酸純度(見圖1)將唾液酸樣品進行紅外光譜分析，結(jié)果與標品 一致(見圖2)。
權(quán)利要求
融合蛋白一步催化制備N 乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征是包括以下步驟(1)利用重疊PCR技術(shù)，將N 乙酰葡萄糖胺 2 差向異構(gòu)酶和N 乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的基因連在一起，導(dǎo)入畢赤酵母宿主細胞中，從而獲得具有N 乙酰葡萄糖胺 2 差向異構(gòu)酶和N 乙酰神經(jīng)氨酸異構(gòu)酶活性的融合蛋白；(2)催化反應(yīng)體系的pH為6.5 8.0，反應(yīng)溫度為30 40℃，N 乙酰葡萄糖胺與丙酮酸及其鹽的重量比為1 1.8，將N 乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其鹽與游離的融合酶蛋白或者固定化的融合蛋白混勻，反應(yīng)得到混合物；(3)從反應(yīng)混合物分離制備N 乙酰神經(jīng)氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征是所 述的步驟(1)中的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶為E. C. 5. 1.3. 8,N-乙酰 神經(jīng)氨酸醛縮酶為E. C. 4. 1. 3. 3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征是 所述的步驟(1)中融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶包括具有N-乙酰葡萄糖 胺-2-差向異構(gòu)酶活性的多肽，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶包括具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶 活性的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征是 所述的融合蛋白的融合方式為(1)第一區(qū)位于融合蛋白的N端，第二區(qū)位于融合蛋白的C 端；(2)第一區(qū)位于融合蛋白的C端，第二區(qū)位于融合蛋白的N端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征是所 述的步驟(1)中的融合蛋白包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸異 構(gòu)酶之間加入0-30個長度的氨基酸作為連接肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征是所 述的融合蛋白的宿主細胞是細菌或酵母或動物細胞或植物細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征是所 述的步驟(1)中的融合蛋白在宿主細胞內(nèi)表達或從宿主細胞中分泌出 來。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征是所 述的步驟(1)中的融合蛋白包括固定后的酶蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征是所 述的步驟(2)中固定化的融合蛋白所用的載體為高分子合成材料或木炭或陶瓷或玻璃或 纖維素。
全文摘要
本發(fā)明公開了融合蛋白一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。利用重疊PCR技術(shù)，將N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的基因連在一起，導(dǎo)入畢赤酵母宿主細胞中，從而獲得具有活性的融合蛋白，該融合蛋白在反應(yīng)器中催化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其鹽轉(zhuǎn)化生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。本發(fā)明通過重疊PCR技術(shù)將兩個酶融合，一步催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸，顯著簡化了生產(chǎn)工藝流程和降低生產(chǎn)成本。由于融合蛋白中兩酶的活性中心位點鄰近，使得酶促反應(yīng)的效率得到了極大的提高。本發(fā)明總的轉(zhuǎn)化效率達到了60％以上，并且能在30h內(nèi)完成催化反應(yīng)，該方法操作簡便，對N-乙酰神經(jīng)氨酸在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)上有較大意義。
文檔編號C12N9/90GK101979644SQ201010282400
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者梅松 申請人:揚州博生源生物科技有限公司