專利名稱：甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)tt10基因家族及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)及其親本 物種白菜(Brassica rapa)和甘藍(lán)(Brassica oleracea) TTlO (TRANSPARENT TESTA 10，透 明種皮10 ；又稱LAC15，即LACCASE 15，漆酶15)基因家族及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞 植物品種，為人類提供營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業(yè)提供飼料，具 有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜是由2個(gè)二倍體物種白 菜和甘藍(lán)通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍(lán)型油菜是世界第二大油料作物，在全世界 廣泛種植，栽培面積和產(chǎn)量?jī)H次于大豆。白菜和甘藍(lán)也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對(duì) 甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)功能基因的比較基因組學(xué)研究將為揭示它們之間的 遺傳進(jìn)化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應(yīng)用基礎(chǔ)。籽粒顏色是甘藍(lán)型油菜的重要性狀之一。甘藍(lán)型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼 率低、粗纖維含量低、含油量高、餅粕蛋白含量高等優(yōu)點(diǎn)，與黑籽品系相比，餅粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值 和油的品質(zhì)都有所提高。雖然白菜和甘藍(lán)中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但自然界 中不存在天然的甘藍(lán)型油菜黃籽基因型。已有的甘藍(lán)型油菜黃籽材料主要通過遠(yuǎn)緣雜交等 方式而創(chuàng)造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育 種周期長(zhǎng)，負(fù)相關(guān)性狀難以克服等缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘 藍(lán)型油菜黃籽性狀成為甘藍(lán)型油菜育種的重要目標(biāo)。長(zhǎng)期以來(lái)，全世界眾多研究者對(duì)該性 狀進(jìn)行了廣泛研究，但到目前為止對(duì)于黃籽性狀形成的分子機(jī)理仍不清楚。擬南芥(Arabidopsisthaliana) TTlO (AtTTIO，At5g48100)基因位于擬南芥的第 5染色體上，是通過候選基因的方法從透明種皮(TRANSPARENTTESTA，TT)突變體ttlO中鑒 定出來(lái)的。ttlO種子在收獲時(shí)種皮呈淺褐色，在合點(diǎn)區(qū)呈深褐色，在貯藏6 12個(gè)月后， 突變體的種皮逐漸恢復(fù)為野生型種皮的深褐色。與野生型種子相比，ttlO突變體種子表 現(xiàn)為發(fā)育過程中的褐變延遲。AtTTlO基因編碼漆酶15(AtLacl5)，既參與種皮中原花青素 (proanthocyanidin,PA)氧化聚合成褐色的種皮色素，也參與種皮中木質(zhì)素(Iignin)單體 氧化聚合成木質(zhì)素。蕓薹屬和擬南芥同屬十字花科，可能具有相同的色素位點(diǎn)。原花青素 是形成甘藍(lán)型油菜黑籽顏色的基礎(chǔ)，在黃籽種皮中明顯降低。木質(zhì)素含量也是甘藍(lán)型油菜 的重要性狀之一，在十字花科的黃籽系中明顯低于在褐籽或黑籽中的含量，與十字花科的 黃籽表型密切相關(guān)。因此，在蕓薹屬中對(duì)TTlO基因進(jìn)行同源克隆和功能鑒定，將有助于揭 示甘藍(lán)型油菜種皮色素和木質(zhì)素的分子機(jī)理，是篩選甘藍(lán)型油菜黃籽位點(diǎn)的重要途徑。蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700 1800萬(wàn)年前發(fā)生分離，蕓薹族植物 發(fā)生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種白菜(AA組，529Mbp)、甘藍(lán)(CC組，696Mbp) 和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當(dāng)于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍(lán)型油菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當(dāng)于甘藍(lán)和白菜兩個(gè)基因組之和，則約相當(dāng)于擬南芥基 因組的6倍。也就是說(shuō)，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍(lán)和白菜中可能分別有3個(gè)對(duì)應(yīng) 的拷貝，而在甘藍(lán)型油菜中可能有6個(gè)拷貝。目前，TTlO基因在甘藍(lán)型油菜及其親本物種 白菜和甘藍(lán)中的成員數(shù)、蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性及與黃籽性狀的關(guān)系等都 未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO
基因家族。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，分別克隆了甘藍(lán)型 油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族成員的全長(zhǎng)cDNA和對(duì)應(yīng)的基因組序列，并對(duì) 其進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示所述白菜TTlO (BrTTlO)基因家族包括以下3個(gè)成員BrTT10_lA基因、BrTTlO-IB 基因和BrTT10-2基因；所述BrTTlO-IA基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No. 2所示， BrTTlO-IB基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No. 4所示，BrTT10-2基因的全長(zhǎng)cDNA序列如 SEQ ID No. 6 所示；所述甘藍(lán)TTlO (BoTTlO)基因家族包括以下2個(gè)成員=BoTTlO-I基因和 BoTTlO-Ipse 基因；所述BoTTlO-I 基因的全長(zhǎng) cDNA序列如 SEQ ID No. 8 所示，BoTTlO-Ipse 基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No. 9所示；所述甘藍(lán)型油菜TTlO(BnTTlO)基因家族包括以下3個(gè)成員=BnTTlO-I基因、 BnTT10-2基因和ΒηΤΤ10-3基因；所述BnTTlO-I基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No. 11所 示，BnTT10-2基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No. 12所示，ΒηΤΤΙΟ-3基因的全長(zhǎng)cDNA序列 如 SEQ IDNo. 14 所示。進(jìn)一步，所述BrTTlO-IA基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrTTlO-IB基因 的基因組序列如SEQ ID No. 3所示，BrTT10-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示；所 述BoTTlO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示；所述BnTTlO-I基因的基因組序列如 SEQ IDNo. 10所示，BnTT10-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 13所示。BrTTlO-IA基因與BrTTlO-IB基因的序列極其相似，可能互為一對(duì)等位基因。 BoTTlO-Ipse假基因與BoTTlO-I基因的序列一致，但在編碼區(qū)發(fā)生2處單堿基缺失，導(dǎo)致 提前終止突變，二者可能互為一對(duì)等位基因。根據(jù)基因序列和表達(dá)模式的分析，BnTTlO, BrTTlO和BoTTlO基因家族成員可分為兩種類型BnTT10_3和BrTT10_2基因?yàn)镮型基因， 它們與AtTTlO的同源性更高，可能參與原花青素聚合物的進(jìn)一步氧化以及木質(zhì)素的聚合 反應(yīng)；其它基因?yàn)镮I型基因，各成員之間具有較高的序列同源性，可能參與原花青素的聚 合反應(yīng)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，BnTTlCKBrTTlO和BoTTlO基因家族的正常編碼蛋白序列中 存在多銅氧化酶家族的3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和4個(gè)銅離子結(jié)合基序Ll L4，與其它高等植物 漆酶蛋白之間具有很高的同源性，由此預(yù)測(cè)BnTTIO、BrTTlO和BoTTlO基因家族編碼漆酶。 TTlO基因主要在甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)發(fā)育的種子中表達(dá)，在黑、黃籽近等基因系發(fā)育階 段尤其是后期轉(zhuǎn)色階段的種子中有差異表達(dá)，不同的基因成員表現(xiàn)出不同的黑、黃籽差異 表達(dá)模式。根據(jù)基因序列分析、組織特異性表達(dá)和在黑、黃籽近等基因系之間的表達(dá)差異，可以推斷甘藍(lán)型油菜的BnTTlO-I、BnTT10-3基因分別來(lái)自于白菜的BrTTlO-IA和BrTT10_2 基因，而甘藍(lán)型油菜的ΒηΤΤΙΟ-2基因則來(lái)自于甘藍(lán)的BoTTlO-I基因。基于上述結(jié)果，利用本發(fā)明的BnTTIO、BrTTlO, BoTTlO基因家族中的任一種或多 種基因或基因截短片段，可以構(gòu)建TTlO基因重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化體，用于TTlO基因的正義 表達(dá)、反義抑制、RNA干擾等。本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因 家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族在甘藍(lán)型油菜 黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明選取甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家 族特異保守片段BTTlOA (核苷酸序列如SEQ IDNo. 11中第653 1604位堿基所示)作為 反義片段，將其反義插入PCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動(dòng)子和Nos終止子之間，構(gòu)建了 BnTTlO.BrTTIO和BoTTlO基因家族共抑制的反義抑制表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚 軸侵染法轉(zhuǎn)入3個(gè)不同的甘藍(lán)型油菜品種，得到了抑制內(nèi)源TTlO轉(zhuǎn)錄本效果為O 83%的 轉(zhuǎn)基因株系，且3個(gè)品種轉(zhuǎn)基因材料的表型修飾效應(yīng)一致。研究發(fā)現(xiàn)，在BnTTlO基因家族 表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因株系中，種子的著色明顯晚于對(duì)照，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)色延遲，種皮中可溶性 原花青素含量增加，而種皮木質(zhì)素含量降低，證明BnTTlO基因家族參與了甘藍(lán)型油菜的種 皮著色、種皮原花青素單體的聚合和種皮木質(zhì)素的合成。發(fā)明人在前期研究中已發(fā)現(xiàn)TT12 等多個(gè)基因家族在甘藍(lán)型油菜黃籽材料中的表達(dá)均有下調(diào)，因此推測(cè)BnTTlO基因的表達(dá) 下調(diào)參與了黃籽性狀的形成，但它本身不是最源頭上的黃籽主要位點(diǎn)，而是受黃籽主效基 因調(diào)控的效應(yīng)基因之一。BnTTlO基因家族在種皮成熟轉(zhuǎn)色、種皮木質(zhì)素含量等種子性狀的 分子育種中具有應(yīng)用價(jià)值，但必須對(duì)包括BnTTlO在內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行操作。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TTlO基因在甘藍(lán)型油菜及其親本物種白 菜和甘藍(lán)中的成員數(shù)、各成員的全長(zhǎng)cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表 達(dá)的組織特異性等，并確認(rèn)了 TTlO基因參與了種皮著色、種皮原花青素單體的聚合和種皮 木質(zhì)素的合成，為受黃籽主效基因調(diào)控的效應(yīng)基因之一，由此本發(fā)明提供了 TTlO基因在蕓 薹屬作物種皮成熟轉(zhuǎn)色、種皮木質(zhì)素含量等種子性狀的分子育種特別是甘藍(lán)型油菜黃籽性 狀的分子育種中的應(yīng)用，應(yīng)用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1為甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)第一鏈cDNA的獲得，其中M為DNAmarker，A、B、C 分別為甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)。圖2為BnTTIO、BrTTlO和BoTTlO基因家族成員全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增，其中a、b、c分 別為甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)M為DNAmarkera 9為分別采用9種引物組合擴(kuò)增所得PCR 產(chǎn)物，d為BrTT10-2和ΒηΤΤ10_3基因全長(zhǎng)cDNA。圖3為BnTTIO、BrTTlO和BoTTlO基因家族成員的Southern雜交鑒定。圖4為BnTTIO、BrTTlO和BoTTlO家族蛋白及AtTTlO蛋白的氨基酸序列比對(duì)。
圖5為BnTTIO、BrTTlO和BoTTlO家族蛋白與其它植物漆酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹，其 中 ApLACl 為山槭漆酶 1 (ΑΑΒ09228)，AfLAC 為黃曲霉漆酶(ΧΡ_002378028)，AtTTlO 為擬 南芥 TT10(NP_199621)，AtLAC 12 為擬南芥漆酶 12 (ΝΡ_196158)，AtLAC 13 為擬南芥漆酶 13(ΝΡ_196330)，AtLAC 14 為擬南芥漆酶 14(ΝΡ_196498)，CmLAC 為板栗漆酶(ACI46953)， 0sLAC2為水稻漆酶2 (Q8RYM9)，0sLAC9為水稻漆酶9 (Q6Z8L2)，PtLACl為火炬松 (AAK37823)，PtLAC2 為火炬松(AAK37824)，RcLAC 為蓖麻(XP_002527130), SlAOX 為番茄抗 壞血酸氧化酶(AAY47050)，ZmLAC3為玉米漆酶3 (NPJ)Ol 105915)；進(jìn)化樹分支上的數(shù)字表 示靴值檢驗(yàn)的百分率(1000次重復(fù))。圖6為RT-PCR檢測(cè)BnTT10、BrTT10和BoTTlO基因家族總體和各成員在不同組織
器官中的表達(dá)。圖7為RT-PCR檢測(cè)BnTTIO、BrTTlO和BoTTlO基因家族總體和各成員在黑、黃籽
近等基因系生殖器官中的表達(dá)。圖8為BnTT10、BrTT10和BoTTlO基因家族反義抑制表達(dá)載體ρΒΤΤΙΟΑ的元件圖。圖9為轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜植株的PCR鑒定，其中a為轉(zhuǎn)基因Westar，b為轉(zhuǎn) 基因中油821，c為轉(zhuǎn)基因中雙10號(hào)；上排擴(kuò)增引物為FGUS+RGUS，下排擴(kuò)增引物為 F35S3N+FTT10A。圖10為轉(zhuǎn)基因和對(duì)照甘藍(lán)型油菜種子中BnTTlO基因家族及各成員的表達(dá)量檢 測(cè)，其中a為T2代轉(zhuǎn)基因和對(duì)照Westar種子中BnTTlO基因的總體表達(dá)，b為T2代轉(zhuǎn)基因 和對(duì)照中油821種子中BnTTlO基因的總體表達(dá)，c為T2代轉(zhuǎn)基因和對(duì)照中雙10號(hào)種子中 BnTTlO基因的總體表達(dá)，d為T2代轉(zhuǎn)基因和對(duì)照Westar種子中BnTTlO基因家族各成員的表達(dá)。圖11為轉(zhuǎn)基因和對(duì)照甘藍(lán)型油菜種子的轉(zhuǎn)色過程，其中a為轉(zhuǎn)基因和對(duì)照(CK) 中油821種子，b為轉(zhuǎn)基因和對(duì)照(CK)中雙10號(hào)種子。圖12為轉(zhuǎn)基因和對(duì)照Westar T3種皮的可溶性原花青素含量(a)和不可溶性原花 青素含量(b)，其中V-10、V-12、V-13為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，BnTTlO基因表達(dá)受到抑制；V-22 為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，但BnTTlO基因表達(dá)未收到抑制；V-24為對(duì)照株系，BnTTlO基因表達(dá)正 常汀2寸為T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系J2-CST1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的T2代分離陰性株或反義片 段丟失的株系。圖13為轉(zhuǎn)基因和對(duì)照Westar種皮的可溶性木質(zhì)素含量，其中V_10、V_12、V-13、 V-22、V-24、T2-P 和 T2-C 的含義同圖 12。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實(shí)施例采用的植物材料白菜材料均來(lái)自于白菜型油菜亞種(B.rapa ssp. oleifera)，包括典型黑籽品系06K130以及黃、黑籽近等基因系09L597 (黑籽)和 09L600 (黃籽)；甘藍(lán)材料均來(lái)自于羽衣甘藍(lán)變種(B. oleracea var. acephala)，包括典型 黑籽品系06K158以及黃、黑籽近等基因系09甘1 (黑籽)和09甘4(黃籽)；甘藍(lán)型油菜材料包括典型黑籽保持系5B以及黃、黑籽近等基因系09L588 (黑籽)和09L587 (黃籽)，均 由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供，大田常規(guī)種植；甘藍(lán)型油菜黑籽模式材料Westar和 黑籽商業(yè)品種中油821DH系由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供，黑籽雙低商業(yè)品種中雙 10號(hào)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供。優(yōu)選實(shí)施例采用的主要試劑及試劑盒Taq DNA聚合酶(5U/ μ 1)購(gòu)自上海生工生 物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Easy-Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)、DL_2000plus Marker、pEASY_T3 載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000、X-HindIII digest DNA Marker、rTaqDNA 聚合酶、LA Taq DNA 聚合酶(5U/yl)和 Ex Taq Hot Start DNA 聚合 酶(5U/ μ 1)、pMD 18-Τ 和 pMD19-T 載體、RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 購(gòu)自寶生物工程(大 連)有限公司；限制性內(nèi)切酶DraI、EcoRI、EcoRV、SacI(10U/y 1)購(gòu)自美國(guó)NewEngland Biolabs公司；限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI (10U/μ 1)、T4DNA連接酶(lOU/μ 1)購(gòu)自立陶 宛 MBI Fermentas 公司；MS (Murashige &Skoog medium, including vitamins)基本培養(yǎng)基 購(gòu)自荷蘭Duchefa Biochemie公司；pGEM-T easy載體購(gòu)自Promega公司；柱式小量植物組 織RNA抽提試劑盒、小量膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限 公司，GeneRacer Kit購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Southern雜交試劑、檢測(cè)試劑盒、尼龍膜、 地高辛標(biāo)記的DNA Marker購(gòu)自德國(guó)Roche公司。優(yōu)選實(shí)施例采用的主要儀器PTC-200ProgrammableThermal Controller PCR儀 購(gòu)自美國(guó)MJ Research公司，Veriti 多重控溫PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司； UVP HL-2000雜交紫外交鏈儀購(gòu)自美國(guó)UVP公司，Bio-Rad Model 785真空轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司，以及分子生物學(xué)和基因工程的其它常規(guī)儀器和設(shè)備。一、甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族的克隆1、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)基因組總DNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜06K130和甘藍(lán)06K158的嫩葉，采用 十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用電泳法和分光光度法評(píng)價(jià)核酸樣 品的質(zhì)量和濃度。1. 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的3個(gè)物種的基因組總DNA完整性 好，平均分子量均大于λ -HindIII DNA Marker的23kb條帶，RNA消化比較完全，經(jīng)分光光 度法檢測(cè)純度較高，可以直接用于PCR擴(kuò)增及Southern雜交。2、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)各器官總RNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜06K130和甘藍(lán)06K158的蕾(Bu)、 花(Fl)、開花后10天的種子(IOD)、開花后20天的種子(20D)和開花后30天的種子(30D)； 以及大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜09L587和09L588、白菜09L600和09L597、甘藍(lán)09 甘4和09甘1的根(Ro)、下胚軸(Hy)、子葉(Co)、莖(St)、葉(Le)、蕾、花、莢果皮(SP)以 及發(fā)育不同階段的種子(甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)取15D、30D、45D和55D的種子；白菜取10D、 25D、40D和45D的種子)共12個(gè)器官；采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒提取各器官總 RNA，采用電泳法和分光光度法評(píng)價(jià)核酸樣品的質(zhì)量和濃度。1. 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯 示，獲得的總RNA特征條帶清晰，且無(wú)明顯RNA降解和DNA污染，經(jīng)分光光度法檢測(cè)純度較 高，能夠滿足RACE操作的基本要求。3、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)RACE第一鏈cDNA的獲得分別取甘藍(lán)型油菜5B、白菜06K130和甘藍(lán)06K158的蕾、花和3個(gè)發(fā)育時(shí)期的種子的總RNA混合成總量為5 μ g的RNA樣品，采用GeneRacer Kit按其說(shuō)明書進(jìn)行一系列的 RACE操作，最終反轉(zhuǎn)錄獲得在3’端和5’端同時(shí)錨定有人工接頭序列的第一鏈cDNA，PCR 放大后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，三個(gè)物種的總cDNA呈現(xiàn)出大小 在200bp IOkb的拖帶，重心區(qū)域在Ikb 4kb，說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄比較完全，得到了較高質(zhì)量的 cDNA,可用于克隆甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族完整的cDNA末端。4、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族5’ cDNA末端的克隆通過Vector NTI Advance 9. 0 對(duì) AtTT10/AtLacl5 基因以及其它 16 個(gè)漆酶 (AtLacI-AtLac 14、AtLacl6和AtLacl7)基因序列進(jìn)行多重比對(duì)，選取AtTTlO基因與其它 擬南芥漆酶成員核酸序列中的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)了 2條正向引物(FTT10-31和FTT10-32)和2 條反向引物(RTT10-51和RTT10-52)(表1)作為擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家 族成員cDNA末端的基因特異引物(GSP)。分別以甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)第一鏈cDNA為模板，用引物組合5，P+RTT10-51進(jìn) 行 5，cDNA 末端的 RACE—擴(kuò)。50 μ 1 標(biāo)準(zhǔn) Taq PCR 擴(kuò)增體系為10 X PCR Buffer 5μ 1, 25mmol/L 的 MgCl23 μ 1,10mmol/L 的 dNTPs 1 μ l,10ymol/L 的正向引物 1 μ l,10ymol/L 的反向引物1 μ 1，5U/ μ 1的Taq酶0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，加雙蒸水至總體積為50 μ 1。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性1分鐘，52°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共 25個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。表15’和3’ RACE中的基因特異引物和GeneRacer試劑盒引物
引物名稱弓I物序列(5'-3’)GeneRacer 5，PcgactggagcacgaggacactgaGeneRacer 5'NPggacactgacatggactgaaggagtaGeneRacer 3'PgctgtcaacgatacgctacgtaacgGeneRacer 3'NPcgctacgtaacggcatgacagtgRTT10-51ctatgcgcgtgccaccaaacagtRTT10-52tgccaccaaacagtcgtgtcttcFTTl 0-31cctatgcatctccatggttttagcttFTT10-32ttctatgtggttgg 啦 agggttcgg 以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，用引物組合5，NP+RTT10-52進(jìn)行5，cDNA末端的RACE巢擴(kuò)， PCR擴(kuò)增體系與一擴(kuò)相同但模板改為0. 1 μ 1，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘；再94°C 變性1分鐘，43 48°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分 鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用小量膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，與T 載體(pMD18-T或pMD19-T)連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5 α或JM109)感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨 芐青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培養(yǎng)至藍(lán)白斑清晰，挑取白斑單菌落，用含有Amp 的LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果陽(yáng)性克隆子表現(xiàn)出明顯的長(zhǎng)度多 態(tài)性，每個(gè)物種挑選8 9個(gè)代表性單克隆子委托上海英竣生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè) 序。測(cè)序結(jié)果表明=BnTTlO基因家族得到長(zhǎng)度分別為405 (2種序列)、409、374和379bp [均 不包括poly (A)，下同]的5個(gè)5，cDNA末端，NCBI BLASTn分析表明它們與AtTTlO基因 (NM_124184)具有很高的同源性，可能分別代表2種不同的5，cDNA末端；BrTTlO基因家族得到長(zhǎng)度分別為346、357、374、379、405 (2種序列)、406和409bp的8個(gè)5，cDNA末端，表現(xiàn) 為差異明顯的兩種類型，但都與AtTTlO基因具有較高的同源性；BoTTlO基因家族得到長(zhǎng)度 分別為379(2種序列)、398、405、409和411bp的6個(gè)5，cDNA末端，均與AtTTlO基因有較 高的同源性，可能代表2種不同的5’ cDNA末端。5、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族3，cDNA末端的克隆分別以白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板，用引物組合3，P+FTT10-31進(jìn) 行3，cDNA末端的RACE —擴(kuò)。PCR擴(kuò)增體系和程序與5，cDNA末端的RACE —擴(kuò)相同。以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，用引物組合3，NP+FTT10-32進(jìn)行3，cDNA末端的RACE巢擴(kuò)， PCR擴(kuò)增體系和程序與5’cDNA末端的RACE巢擴(kuò)相同。PCR產(chǎn)物如前法所述進(jìn)行電泳檢測(cè)、 膠回收、T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽(yáng)性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測(cè)序。測(cè) 序結(jié)果表明=BnTTlO基因家族得到長(zhǎng)度分別為430 (4個(gè))、407和387bp的6個(gè)3，cDNA末 端，NCBI BLASTn分析表明這些3’cDNA末端與AtTTlO基因具有很高的一致性，表明它們的 確為BnTTlO基因家族的3’ cDNA末端，但這些不同長(zhǎng)度的片段序列一致，可能代表同一種 3’ cDNA末端，片段長(zhǎng)度差異是由可變poly (A)加尾位點(diǎn)所引起；BrTTlO基因家族得到長(zhǎng)度 分別為448 (2個(gè))、449 (2個(gè))、403、390和377bp的7個(gè)3，cDNA末端，這些3，cDNA末端與 AtTTlO基因具有很高的一致性，可能代表2種3，cDNA末端；BoTTlO基因家族得到長(zhǎng)度分 別為430、430、388和390bp的4個(gè)3，cDNA末端，均與AtTTlO基因一致性較高，可能代表2 種3，cDNA末端。6、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族成員全長(zhǎng)cDNA的克隆根據(jù)所獲得的BnTTIO、BrTTlO, BoTTlO基因家族5，和3，cDNA末端序列，設(shè)計(jì)了 3 條正向引物(FBNTT10、FBRTT10、FBOTT10)和 3 條反向引物(RBNTT10、RBRTT10、RBOTT10) (表2)，將所有正向引物與反向引物兩兩配對(duì)，形成9種引物組合。分別以甘藍(lán)型油菜、白 菜、甘藍(lán)第一鏈cDNA為模板，采用上述引物組合和50 μ 1標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR擴(kuò)增體系，擴(kuò)增甘 藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)TTlO基因家族各成員的全長(zhǎng)cDNA ；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分 鐘，再94°C變性1分鐘、57°C退火1分鐘、72°C延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 分鐘；PCR產(chǎn)物如前法所述進(jìn)行電泳檢測(cè)(圖2)、膠回收、T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)胞、陽(yáng)性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測(cè)序。結(jié)果分別得到BnTTIO、BrTTlO, BoTTlO基因 家族的3條、3條和8條全長(zhǎng)cDNA序列，合并相同的基因序列，并設(shè)計(jì)特異檢測(cè)引物，經(jīng)過 篩選、驗(yàn)證及補(bǔ)充克隆后，將不同的獨(dú)立基因(imigenes)分別命名為BnTT10-l、BnTT10-2、 BrTT10-lA、BrTT10_lB、BoTTlO-I 和 BoTTlO-Ipse。經(jīng)過分析和比對(duì)，發(fā)現(xiàn) BrTTlO 基因 家族獲得的一個(gè)5’ cDNA末端沒有擴(kuò)增獲得相應(yīng)的3’ cDNA末端和全長(zhǎng)cDNA序列，針對(duì) 該末端設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案以白菜第一鏈cDNA為模板，以該5，cDNA末端的對(duì)應(yīng)引物FBRTT10 與GeneRacer 3，NP配對(duì)，用Ex Taq Hot Start進(jìn)行擴(kuò)增，獲得相應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA，命名 為BrTT10-2 ；再設(shè)計(jì)相應(yīng)的3，cDNA末端引物RBRTT10-I與FBRTT10配對(duì)，擴(kuò)增BnTTIO、 BoTTlO基因家族的相應(yīng)cDNA，獲得ΒηΤΤΙΟ-3，而甘藍(lán)中沒有獲得相應(yīng)基因。由于BrTT10_2、 ΒηΤΤΙΟ-3的基因序列與AtTTlO基因序列具有更高的同源性，因此將此類基因定義為I型基 因，其它基因則定義為II型基因。多重序列比對(duì)的分析結(jié)果表明這些基因的全長(zhǎng)cDNA序 列與AtTTlO基因有很高的同源性，且都存在與它們對(duì)應(yīng)的3’和5’ RACE末端。表2BnTT10、BrTTlO, BoTTlO基因家族成員全長(zhǎng)cDNA和基因組序列擴(kuò)增引物
9
權(quán)利要求
甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT10基因家族，其特征在于所述白菜(Brassica rapa)TT10基因家族包括以下3個(gè)成員BrTT10 1A基因、BrTT10 1B基因和BrTT10 2基因；所述BrTT10 1A基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No.2所示，BrTT10 1B基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No.4所示，BrTT10 2基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No.6所示；所述甘藍(lán)(Brassica oleracea)TT10基因家族包括以下2個(gè)成員BoTT10 1基因和BoTT10 1pse假基因；所述BoTT10 1基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No.8所示，BoTT10 1pse假基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No.9所示；所述甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)TT10基因家族包括以下3個(gè)成員BnTT10 1基因、BnTT10 2基因和BnTT10 3基因；所述BnTT10 1基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No.11所示，BnTT10 2基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No.12所示，BnTT10 3基因的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ IDNo.14所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族，其特征 在于所述BrTTlO-IA基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrTTlO-IB基因的基因組序 列如SEQ ID No. 3所示，BrTT10-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示；所述BoTTlO-I 基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示；所述BnTTlO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 10 所示，BnTT10-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 13所示。
3.含有權(quán)利要求1或2所述的甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族中 任一種或多種基因或基因截短片段的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為含有甘藍(lán) 型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族特異保守片段BTTlOA的反義抑制表達(dá)載 體，所述BTTlOA片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 11中第653 1604位堿基所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述反義抑制表達(dá)載體是將 BTTlOA片段反義插入pCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動(dòng)子和Nos終止子之間而得到。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
7.權(quán)利要求1或2所述的甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族在蕓薹 屬作物蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TTlO基因家族的應(yīng)用，其 特征在于所述蕓薹屬作物種子性狀的分子育種為甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT10基因家族及其應(yīng)用，其中白菜TT10基因家族包括BrTT10-1A基因(SEQ ID No.1～2)、BrTT10-1B基因(SEQ ID No.3～4)和BrTT10-2基因(SEQ ID No.5～6)，甘藍(lán)TT10基因家族包括BoTT10-1基因(SEQ ID No.7～8)和BoTT10-1pse假基因(SEQ ID No.9)，甘藍(lán)型油菜TT10基因家族包括BnTT10-1基因(SEQ IDNo.10～11)、BnTT10-2基因(SEQ ID No.12)和BnTT10-3基因(SEQ ID No.13～14)；上述基因家族可應(yīng)用于蕓薹屬作物種子性狀的分子育種。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101942456SQ201010281910
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者盧坤, 張凱, 曲存民, 李加納, 柴友榮, 梁穎, 王敬喬, 王瑞, 陳薇 申請(qǐng)人:西南大學(xué)