本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種特效干細(xì)胞致活因子的制備方法。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞；根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能分為三類:全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和專能干細(xì)胞。干細(xì)胞是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬(wàn)用細(xì)胞”。干細(xì)胞致活因子（NGCF）為20肽環(huán)狀化合物，干細(xì)胞致活因子是從人體胎盤中提取的，干細(xì)胞致活因子能夠刺激干細(xì)胞大量動(dòng)員到外周血中，應(yīng)用干細(xì)胞動(dòng)員劑將骨髓干細(xì)胞驅(qū)趕到外周血中，使外周血干細(xì)胞達(dá)到治療數(shù)量。

SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）在分離、鑒定和純化特效細(xì)胞因子時(shí)，其有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，其孔徑隨著雙丙烯酰胺與丙烯酰胺比率的增加而減小，比率接近于1：20時(shí)，孔徑達(dá)到最小值。分子量低于10kD的小分子肽類，即使用較高濃度的聚丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE也不能完全分離，或是顯不出色，或是顯帶較弱，帶型彌散。且分子量越小，效果也越差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種特效干細(xì)胞致活因子的制備方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明為了能在SDS-PAGE上顯示測(cè)定小分子量的多肽而采取的方法是：增加凝膠的濃度和交聯(lián)度，在制膠時(shí)加入一些可以降低聚丙烯酰胺凝膠網(wǎng)限孔徑的溶質(zhì)分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物質(zhì)。

本發(fā)明特效干細(xì)胞致活因子的制備方法包括如下步驟：

1）電泳緩沖液的制備：緩沖液包括三羥甲基氨基甲烷和三甲基甘氨酸，用HCl調(diào)節(jié)pH，將pH調(diào)節(jié)至8.25；

2）膠的制備：配制分離膠和濃縮膠，原料包括丙烯酰胺溶液、膠緩沖液、脲、甘油、水、10%過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺；

3）樣品緩沖液的制備：樣品緩沖液包括質(zhì)量百分?jǐn)?shù)4%SDS、12%甘油、2%巰基乙醇、0.01% Serva blue染料和50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷；

4）將多肽樣品與樣品緩沖液混合沸煮2min，或者在40℃條件下溫浴30min；

5）將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖封邊，倒入陰極緩沖液，并依次加樣；

6）將電泳裝置放入電泳槽內(nèi)，倒入陽(yáng)極緩沖液，將正極和負(fù)極與電泳儀相接，保持恒壓50～60V，待指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓升至70～90V，恒壓3h，待指示劑走出凝膠下緣停止電泳；

7）最后進(jìn)行染色、脫色和膠的保存步驟。

本發(fā)明的有益效果是：通常情況下，干細(xì)胞在生理或病理情況下被征募到循環(huán)中參與遠(yuǎn)處多種組織的再生，但這種作用相對(duì)較弱，可應(yīng)用本發(fā)明中的特效干細(xì)胞致活因子（Activation of factor）將干細(xì)胞驅(qū)趕到外周血中，使外周血干細(xì)胞達(dá)到治療數(shù)量。本申請(qǐng)中的特效干細(xì)胞致活因子扮演了干細(xì)胞動(dòng)員劑的作用，將能自我增殖的未成熟細(xì)胞動(dòng)員到缺血部位，在人體器官微環(huán)境下因環(huán)境依賴作用橫向分化為器官的靶細(xì)胞，達(dá)到修復(fù)細(xì)胞損傷的作用。使用了本發(fā)明中的特效干細(xì)胞致活因子后，細(xì)胞表面的Wnt-3蛋白表達(dá)水平升高，說(shuō)明在使用了特效干細(xì)胞致活因子后使干細(xì)胞增殖機(jī)制與Wnt信號(hào)有關(guān)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明特效干細(xì)胞致活因子的作用機(jī)理圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。

如圖1所示，一種特效干細(xì)胞致活因子的制備方法，具體包括如下步驟：1）電泳緩沖液的制備：緩沖液包括三羥甲基氨基甲烷和三甲基甘氨酸，用HCl調(diào)節(jié)pH，將pH調(diào)節(jié)至8.25；2）膠的制備：配制分離膠和濃縮膠，原料包括丙烯酰胺溶液、膠緩沖液、脲、甘油、水、10%過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺；3）樣品緩沖液的制備：樣品緩沖液包括質(zhì)量百分?jǐn)?shù)4%SDS、12%甘油、2%巰基乙醇、0.01% Serva blue染料和50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷；4）將多肽樣品與樣品緩沖液混合沸煮2min，或者在40℃條件下溫浴30min；5）將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖封邊，倒入陰極緩沖液，并依次加樣；6）將電泳裝置放入電泳槽內(nèi)，倒入陽(yáng)極緩沖液，將正極和負(fù)極與電泳儀相接，保持恒壓50～60V，待指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓升至70～90V，恒壓3h，待指示劑走出凝膠下緣停止電泳；7）最后進(jìn)行染色、脫色和膠的保存步驟。

本發(fā)明中特效干細(xì)胞致活因子的使用方法有：肌肉注射、靜脈滴注和穴位注射。

最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上內(nèi)容僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行的簡(jiǎn)單修改或者等同替換，均不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。