本發(fā)明提供了能夠與結(jié)核病陽性血清特異結(jié)合的多肽，以及基于多肽的診斷試劑盒，更涉及了一種基于噬菌體展示多肽的結(jié)核病診斷試劑盒，屬于生物制劑領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)是由德國細(xì)菌學(xué)家柯赫(Robert Koch)于1882發(fā)現(xiàn)并證實為引起結(jié)核病(Tuberculosis,TB)的病原菌。本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界約每3個人中就有1個人感染了Mtb，在某些發(fā)展中國家中，成人Mtb攜帶率高達(dá)80％，其中約5％～10％攜帶者可發(fā)展為活動性結(jié)核病。

目前，結(jié)核病診斷方法主要有以下幾種：(1)細(xì)菌學(xué)診斷：包括痰涂片鏡檢法和痰樣本培養(yǎng)法，其中痰涂片鏡檢法簡單、快速和可靠，但其敏感性差；痰樣本培養(yǎng)法是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時長，假陰性率較高；(2)血清學(xué)診斷：結(jié)核病血清學(xué)診斷方法主要是利用免疫學(xué)技術(shù)檢測血清中特異性抗Mtb的抗體。(3)結(jié)核菌素皮膚試驗：是用于診斷Mtb感染所致IV型超敏反應(yīng)的皮膚試驗，對診斷活動性結(jié)核病和測定機(jī)體細(xì)胞免疫功能有參考價值，但其特異性差，常與環(huán)境分枝桿菌和卡介苗(BCG)產(chǎn)生交叉反應(yīng)。(4)Mtb核酸擴(kuò)增檢測：該方法敏感性好，即使標(biāo)本中拷貝數(shù)低的細(xì)菌也能被檢出，但臨床應(yīng)用會有偏差，如標(biāo)本處理不當(dāng)，靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染等易造成假陰性。(5)IFN-γ釋放試驗：是結(jié)核病體外免疫檢測的新方法，一般釆用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或者酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)測定機(jī)體全血或者外周血單核細(xì)胞中產(chǎn)生的IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞因子變化量，但該方法成本高，對技術(shù)要求高。

以上方法中，血清學(xué)檢測是體外診斷結(jié)核病的有效方法，其檢測方法簡單、快速、高效和低廉，成為近年來結(jié)核病診斷的研究熱點。該方法通過基因工程獲取重組抗原，結(jié)合間接ELISA方法檢測病人血清中的特異抗體，已在結(jié)核病的血清學(xué)診斷中顯示出較好的診斷價值，如ESAT-6、CFP-21、Ag85復(fù)合物等。但現(xiàn)有的血清學(xué)診斷方法中所用的抗原很少能同時滿足高靈敏性和特異性的需求，常將兩種或者多種抗原結(jié)合用于結(jié)核病血清學(xué)診斷。但是傳統(tǒng)的用蛋白抗原用于血清學(xué)診斷方法，必須先對相關(guān)基因進(jìn)行克隆表達(dá)，再用親和層析方法對蛋白進(jìn)行純化，這樣比較費(fèi)時費(fèi)力，并且蛋白的表達(dá)與純化過程易受多方面因素的影響。

噬菌體展示技術(shù)(Phage display technology)是由Smith等創(chuàng)建的一種分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)將編碼外源目的蛋白或多肽的DNA片段插入到噬菌體一個特定的衣殼蛋白基因中，插入基因編碼的蛋白與噬菌體的衣殼蛋白形成融合蛋白而呈現(xiàn)在噬菌體的表面，通過表型篩選即可獲得相應(yīng)的目的蛋白或多肽的DNA序列。目前，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于抗原及表位篩選、細(xì)胞表面受體和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決了背景技術(shù)中的不足，提供了一種能夠與結(jié)核病陽性血清特異結(jié)合的多肽和展示該多肽的核心噬菌體，所述多肽和其相應(yīng)的核心噬菌體的靈敏度和特異度高，具有良好的臨床診斷價值。

實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：一種能夠與結(jié)核病陽性血清特異結(jié)合的多肽，所述的多肽為A和B中的一種或兩種的組合，其中A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Arg-Pro，B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：Thr-Met-Gly-Phe-Thr-Ala-Pro-Arg-Phe-Pro-His-Tyr。

本發(fā)明還提供了一種結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑盒，該試劑盒中至少包括包被液、洗滌液、封閉液和終止液，所述試劑盒中含有上述與結(jié)核病陽性血清特異結(jié)合的多肽。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種基于噬菌體展示多肽的結(jié)核病診斷試劑盒，該試劑盒中至少包括包被液、洗滌液、封閉液和終止液，試劑盒中還包含有核心噬菌體P1和核心噬菌體P4，其中核心噬菌體P1為展示多肽A的噬菌體，核心噬菌體P4為展示多肽B的噬菌體。

以上試劑盒中，所述包被液為0.05M的碳酸鹽緩沖液，pH為9.6，所述的洗滌液為含0.05％Tween-20的TBST緩沖液，其pH為7.6，所述封閉液為含5％BSA的TBS緩沖液，所述的終止液為2mol/L的H₂SO₄溶液。

將本發(fā)明所提供的噬菌體及其相應(yīng)的多肽進(jìn)行ELISA反應(yīng)，結(jié)果表明：代表性噬菌體克隆均能與結(jié)核病陽性血清發(fā)生特異結(jié)合，展示核心序列A的核心噬菌體P1和展示核心序列B的核心噬菌體P4能與不同的臨床血清發(fā)生結(jié)合，靈敏度分別為78.57％和72.62％，特異度分別為95.31％和93.75；固相合成的多肽A和B與不同的臨床血清發(fā)生反應(yīng)，其靈敏度分別為89.41％和85.88％，特異度分別為90.63％和93.75％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中將噬菌體應(yīng)用于血清學(xué)診斷具有以下顯著的優(yōu)勢：噬菌體侵染大腸桿菌，繁殖速度快，易于實現(xiàn)大批量生產(chǎn)；噬菌體結(jié)構(gòu)緊密，耐惡劣環(huán)境強(qiáng)，對檢測的條件要求不高，使試驗易于操作；敏感度和特異度高，能夠達(dá)到快速、靈敏的診斷要求。因此，將噬菌體用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷，對提高結(jié)核病的臨床診斷效率具有重要意義。

附圖說明

圖1為瓊脂糖凝膠電泳分析提取的部分噬菌體單鏈DNA圖；

圖2為噬菌體克隆與結(jié)核病陽性血清及牛血清白蛋白的ELISA反應(yīng)性圖；

圖3為斑點免疫印跡法檢測噬菌體與結(jié)核病陽性血清的特異結(jié)合圖；

圖4為核心噬菌體P1和不同的臨床血清的ELISA反應(yīng)圖；

圖5為核心噬菌體P4和不同的臨床血清的ELISA反應(yīng)圖；

圖6為核心噬菌體P1和不同臨床血清ELISA反應(yīng)的ROC分析圖；

圖7為核心噬菌體P4和不同臨床血清ELISA反應(yīng)的ROC分析圖；

圖8為多肽A和不同的臨床血清的ELISA反應(yīng)圖；

圖9為多肽B和不同的臨床血清的ELISA反應(yīng)圖；

圖10為多肽A和不同臨床血清ELISA反應(yīng)的ROC曲線圖；

圖11為多肽B和不同臨床血清ELISA反應(yīng)的ROC曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于以下實施例。

本實施例中利用純化的結(jié)核病陽性混合血清為靶分子，對噬菌體展示隨機(jī)12肽庫進(jìn)行3輪生物淘選，篩選到能與結(jié)核病陽性混合血清特異結(jié)合的噬菌體，然后用固相法合成噬菌體展示的外源多肽，檢測噬菌體以及外源多肽與不同臨床血清的反應(yīng)情況，以證明該噬菌體及其多肽在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。

主要試劑和儀器：噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(The Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library)、受體菌Escherichia coli ER2738、測序引物及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13pIII單克隆抗體均為美國New England Biolabs公司產(chǎn)品。經(jīng)飽和硫酸銨法進(jìn)行初步純化的結(jié)核病陽性混合血清為課題組前期制備并保存。85份結(jié)核病陽性血清和32份結(jié)核病陰性血清來自衡陽市第三人民醫(yī)院；32份肺炎支原體陽性血清和32份肺炎衣原體陽性血清來自南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科。

特異結(jié)合噬菌體的篩選：用包被緩沖液(pH9.6的0.1M NaHCO₃緩沖液)將純化的結(jié)核病陽性混合血清稀釋成100μg/mL，取150μL加入96孔微量滴定板(Corning公司)，輕輕旋轉(zhuǎn)使孔壁完全濕潤后，置于濕紙盒中于4℃過夜。甩掉包被液，將孔內(nèi)加滿封阻液于4℃封阻2h，去除封阻液，用含0.1％的吐溫-20的Tris緩沖液(TBST)快速洗板6～8次。將用100μL TBST稀釋的噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(噬菌體數(shù)為4×10¹⁰)加至包被封阻好的96孔板內(nèi)，室溫溫和搖動30～60min；倒掉未結(jié)合的噬菌體，用0.1％TBST洗滌液洗板10次。用100μL pH為2.2的洗脫緩沖液(0.2M甘氨酸-鹽酸，1mg/mL BSA)洗脫特異結(jié)合的噬菌體；并用15μL pH 9.1的Tris-HCl中和緩沖液中和洗脫物；取10μL進(jìn)行滴度測定，剩余部分進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的洗脫物加到空白的微孔板內(nèi)，室溫緩慢搖動1h以吸附非特異性噬菌體，吸取上清液，此即為第一輪噬菌體篩選的陽性產(chǎn)物。測定其滴度后用于下一輪的生物淘選。

第二、三輪的生物淘選過程與第一輪相同，但TBST中吐溫-20的含量增加為0.5％，第二輪得到擴(kuò)增物之后，用同樣的方式對結(jié)核病陰性血清進(jìn)行包被、封阻、洗板，并將第二輪擴(kuò)增后的洗脫物加至微孔板內(nèi)室溫?fù)u動1h以再次吸附非特異性噬菌體。由表1可知，第1輪淘選后的產(chǎn)率為5.0×10^-9，而第3輪淘選后其產(chǎn)率達(dá)到了2.3×10^-6，說明具有特異結(jié)合活性的噬菌體克隆得到明顯富集。

表1親和篩選的產(chǎn)出與投入比

噬菌體單鏈DNA的提取與測序分析：依照噬菌體展示隨機(jī)12肽庫試劑盒的說明書，采用碘化鈉法提取第3輪篩選后噬菌體的單鏈DNA，對所提取的部分噬菌體單鏈DNA采用瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示，圖1中M：DNA-Marker；1-20：從隨機(jī)挑取的噬菌體克隆中提取的單鏈DNA；21：空白對照。用瓊脂糖凝膠電泳驗證單鏈DNA提取成功后，送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，根據(jù)所測序列的反向互補(bǔ)序列推導(dǎo)出其相應(yīng)的外源氨基酸序列。推導(dǎo)結(jié)果如表2所示：在隨機(jī)挑取的37個噬菌體序列中，共出現(xiàn)7種不同的多肽序列(P1-P7)，其中P1重復(fù)出現(xiàn)19次、P2重復(fù)出現(xiàn)2次，P4出現(xiàn)12次，其它肽序列各出現(xiàn)1次。根據(jù)所有37個多肽序列氨基酸組成的不同，可以將其大致分為2組。第一組的22個噬菌體序列中有19個完全一致，其余3個噬菌體展示的外源氨基酸序列中僅有1個或2個氨基酸不同，因此，推導(dǎo)出第一組核心序列(A)：S-V-S-V-G-M-K-P-S-P-R-P；對第二組中的15個噬菌體展示的外源氨基酸序列進(jìn)行比較分析，將在不同序列之間出現(xiàn)較多次數(shù)的氨基酸歸屬于一致的核心序列(B)：T-M-G-F-T-A-P-R-F-P-H-Y。這2組核心序列初步判斷可能為能與結(jié)核病陽性混合血清特異結(jié)合的多肽。

表2噬菌體展示肽序列的分組與比對分析

ELISA檢測陽性噬菌體與結(jié)核病陽性混合血清的反應(yīng)：擴(kuò)增第3輪淘選的產(chǎn)物，用ELISA檢測噬菌體與結(jié)核病陽性混合血清的結(jié)合能力。將結(jié)核病陽性混合血清用包被緩沖液(pH 9.6的0.1M NaHCO₃)稀釋成100μg/mL以包被96孔板，4℃過夜，同時設(shè)空白陰性對照。次日，用封阻液于4℃封阻2h。TBST洗板6次，向孔內(nèi)加入以5倍稀釋梯度稀釋好的噬菌體，室溫震蕩作用2h后，洗板6次。加入HRP標(biāo)記的抗M13pIII單克隆抗體(用封阻液以1∶3000的比例稀釋)，室溫震蕩作用1h后用TBST洗板8次；依次加入A、B顯色劑各1滴，37℃避光顯色15～20min后加入終止液(2mol/L的H₂SO4溶液)，用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值，結(jié)果如圖2所示，圖2中P1～P7為7個代表性的噬菌體克隆。ELISA結(jié)果說明：7個代表性的噬菌體均能與結(jié)核病陽性混合血清結(jié)合(OD₄₅₀值大于0.5)，為陽性噬菌體克隆，說明這些噬菌體表面展示的12肽能特異識別結(jié)核病陽性混合血清。

斑點免疫印跡法鑒定陽性噬菌體：為更進(jìn)一步證明陽性噬菌體克隆能否與結(jié)核病陽性混合血清發(fā)生特異結(jié)合，利用斑點免疫印跡法對其進(jìn)行鑒定。方法如下：在PVDF膜上畫上面積約為1cm²的小格，每個待檢的陽性噬菌體各一格，取擴(kuò)增后并經(jīng)滴度測定的噬菌體上清1μL(約10¹¹個噬菌體)點在小格上，同時設(shè)立結(jié)核病血清陽性對照和空白對照，待室溫干燥；4℃封閉過夜，將膜用TBST洗滌液輕輕漂洗1～2次；用TBST以1∶200稀釋純化的結(jié)核陽性血清，取2mL于37℃浸膜2h，洗膜6次后，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG(1∶5 000)于37℃浸膜1h，用TBST洗膜6次后用TMB顯色、再進(jìn)行顯影與定影。

檢測結(jié)果如圖3所示，圖3中A1-A4：陽性噬菌體P1-P4，B1-B3：陽性噬菌體P5-P7，C1：空白對照；C2：結(jié)核病陰性血清對照；C3：野生型噬菌體vcsM13對照；B4和C4：結(jié)核病陽性混合血清對照。從圖3中可以看出，在所有陽性噬菌體克隆的點樣處顯示有明顯的斑點，而在其它對照處無明顯斑點。說明陽性噬菌體確實能與結(jié)核病陽性混合血清發(fā)生特異結(jié)合。

核心噬菌體的血清學(xué)檢測：為研制基于噬菌體的臨床診斷試劑，建立基于核心噬菌體的ELISA法，并檢測其與不同的臨床血清的反應(yīng)情況。用包被液按1∶14的比例稀釋血清，包被96孔板，4℃過夜。次日，用封阻液于4℃封阻2h。TBST洗板6次，向孔內(nèi)加入30倍稀釋的噬菌體(約10¹⁰個噬菌體)，同時分別設(shè)立野生型噬菌體對照、血清對照和空白對照，37℃孵育1h后，洗板8次。加入HRP標(biāo)記的抗M13pIII單克隆抗體(用封阻液以1∶3 000的比例稀釋)，37℃孵育1h后用TBST洗板8次；依次加入A、B顯色劑各1滴，37℃避光顯色15～20min后用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值。以(陽性噬菌體的A₄₅₀－空白的A₄₅₀)/(野生型噬菌體的A₄₅₀－空白的A₄₅₀)≥2.1判為陽性。

檢測結(jié)果如圖4和圖5所示，從圖4和圖5中可以看出：結(jié)核病陽性血清組與展示核心序列A的核心噬菌體P1和展示核心序列B的核心噬菌體P4的結(jié)合能力明顯高于肺炎支原體、肺炎衣原體血清組以及結(jié)核病陰性血清組，P1和P4的靈敏度分別為78.57％和72.62％，特異度分別為95.31％和93.75。圖6和圖7分別為P1和P4的ROC分析圖，其顯示AUC均大于0.9，說明兩種核心噬菌體有較高的臨床診斷價值。

多肽的固相合成與ELISA檢測：為了證實核心噬菌體與不同的結(jié)核病臨床血清的特異結(jié)合確實是由于其展示的外源性多肽所致，而并不是噬菌體本身能和結(jié)核病臨床血清發(fā)生結(jié)合，采用固相法成功合成了2條核心多肽A和B，對其進(jìn)行質(zhì)譜鑒定后用反向高效液相色譜(RP-HPLC)法進(jìn)行純化。

然后用ELISA法檢測合成的多肽能否與不同的臨床血清發(fā)生特異結(jié)合。將經(jīng)包被緩沖液(pH 9.6的0.1M NaHCO₃)稀釋的不同濃度的多肽(50、100、150μg/mL)包被微孔板，4℃過夜，同時設(shè)空白與陰性對照。用封阻液于4℃封阻2h。TBST洗板后分別向孔內(nèi)加入不同的臨床血清，37℃作用2h后，洗板6次。再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶4 000)于37℃孵育1h，加入A、B顯色劑，避光顯色15min后用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值。結(jié)果如圖8、9、10、11所示，圖8為多肽A和不同的臨床血清的ELISA反應(yīng)；圖9為多肽B和不同的臨床血清的ELISA反應(yīng)；圖10為多肽A和不同臨床血清ELISA反應(yīng)的ROC曲線；圖11為多肽B和不同臨床血清ELISA反應(yīng)的ROC曲線。由圖8和圖9可知，多肽A和B與不同的結(jié)核病陽性血清具有較高的結(jié)合力，其靈敏度分別為89.41％和85.88％；而與肺炎支原體、肺炎衣原體和結(jié)核病陰性血清具有較低的結(jié)合力，其特異度分別為90.63％和93.75％。由圖10和圖11可知其AUC值分別為0.9632和0.9246，說明核心多肽A和B具有較好的臨床診斷價值。

結(jié)論：本發(fā)明中，在對噬菌體展示隨機(jī)12肽庫進(jìn)行篩選時，分別以結(jié)核病陰性血清和空的ELISA板進(jìn)行兩輪負(fù)篩選以去除非特異噬菌體，并且在第二輪和第三輪篩選時采取了逐步降低血清的包被濃度、增加洗脫物中吐溫的濃度、降低孵育時間和延長洗脫時間等措施，因而使高度特異的噬菌體克隆得以明顯富集，根據(jù)其氨基酸的組成最終推導(dǎo)出兩組核心序列：第一組為Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Arg-Pro，第二組為Thr-Met-Gly-Phe-Thr-Ala-Pro-Arg-Phe-Pro-His-Tyr。經(jīng)ELISA鑒定，展示兩組核心序列A和B的兩種核心噬菌體P1和P4均能與結(jié)核病陽性血清發(fā)生特異結(jié)合，而與肺炎支原體陽性血清、肺炎衣原體陽性血清和結(jié)核病陰性血清的結(jié)合力較低，說明兩種核心噬菌體用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷具有較高的敏感性與特異性。經(jīng)固相合成的核心多肽也能與不同的結(jié)核病臨床血清發(fā)生特異結(jié)合，而與肺炎支原體陽性血清、肺炎衣原體陽性血清和結(jié)核病陰性血清的結(jié)合力較低，說明兩種核心噬菌體所展示的多肽A和多肽B可用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷，且具有較高的敏感性與特異性。