本發(fā)明涉及腫瘤相關抗原肽及其應用，特別涉及腫瘤相關抗原XAGE-1b短肽及其應用。

背景技術：

眾所周知，T細胞過繼治療腫瘤是目前最令人矚目的技術，尤其是受體工程化T細胞的應用正成為振奮人心的癌癥治療方法，同樣對病毒感染及自身免疫性疾病具有廣泛的應用前景。

人體免疫監(jiān)視系統(tǒng)在抵抗腫瘤生長過程中的重要作用，免疫監(jiān)視系統(tǒng)通過協調各類免疫細胞得以實現抑制腫瘤生長的目的，其中細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTLs)扮演極其重要的角色，是最關鍵的殺傷效應細胞。腫瘤抗原特異性CD8⁺T細胞可以特異性識別并直接殺傷腫瘤細胞而不對正常細胞造成傷害。T細胞治療因此成為最理想的腫瘤治療策略。美國NIH曾預言，細胞治療可能會成為“能夠徹底治愈腫瘤的唯一手段”。因此，獲得能夠特異性識別、殺傷腫瘤細胞的CTL是治療腫瘤的核心。利用腫瘤相關抗原(Tumor-associated antigen，TAA)多肽誘導建立腫瘤抗原肽特異性CTL，即可獲得具有特異性殺傷腫瘤細胞的CTL克隆，并為下一步開發(fā)具有臨床實際應用價值的T細胞過繼治療腫瘤奠定了重要基礎，同時發(fā)明人還可以獲得如下成果：

1)這些經過鑒定篩選出的腫瘤相關抗原肽氨基酸序列，將可被用于構建有效的抗腫瘤肽疫苗、DC疫苗；

2)通過分子克隆技術可以使發(fā)明人獲得明確的具有特異性識別腫瘤抗原的TCR編碼基因，用于TCR基因修飾T細胞的建立。

3)通過合成與短肽特異性結合的熒光探針，可開發(fā)具有自主知識產權的分子探針試劑盒，用于非小細胞肺癌的早期診斷與治療。

目前，T細胞受體(T cell receptor，TCR)基因修飾T細胞(TCR-T)，如同嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾T細胞(CAR-T)技術一樣倍受關注。CAR-T應用于血液腫瘤治療已取得令人矚目的療效。CAR由單鏈Fv融合CD3信號單元，其功能活性依賴于信號單元的敏感性，信號單元由共刺激分子和(或)細胞因子組成。然而，有研究顯示，表達CAR的T細胞對多肽的敏感性不如表達αβTCR異源二聚體的T細胞。TCR-T即通過TCR基因修飾T細胞技術，將已獲得的具有特異性識別腫瘤抗原多肽的TCR編碼基因轉導循環(huán)CD8⁺T細胞，通過這一方法可在極短的時間內獲得大量的穩(wěn)定高表達特異性TCR的、具有與親代CTL同樣的腫瘤特異性識別與殺傷效應的基因修飾T細胞，從而滿足實際臨床應用所需。

發(fā)明人從2005年就開始從事腫瘤相關抗原肽特異性CTL的誘導建立，TCR相關研究(Int J Hematol.2011，93:176–185)及TCR基因修飾T細胞的研究，分別成功將腫瘤相關抗原WT1及Aurora kinase A特異性TCR轉導循環(huán)CD8⁺T細胞(Blood，2011，118:1495-1503；Blood，2012，119:368-376)，獲得TCR-T克隆，經體外、體內鑒定，證實了其抗肺癌或白血病細胞的有效性。

TCR基因修飾T細胞技術越來越顯現出它在腫瘤免疫治療中的重要價值及美好前景，而生成TCR-T的關鍵前提是獲得具有特異識別腫瘤抗原的TCR，通過體外誘導建立腫瘤相關抗原肽特異性CTL是實現這一目標的一個重要途徑。

XAGE-1(X antigen family member 1)是癌-睪丸抗原(Cancer-Testis antigen，CTA)家族成員之一，CTA又稱腫瘤-生發(fā)系(Tumor-Germline，TG)抗原。該類抗原，只表達于睪丸精原細胞，而不表達于正常組織細胞，同時，研究發(fā)現CTA表達于多種不同組織類型的腫瘤，因而又稱為腫瘤特異共享抗原(tumor-specific shared antigens，TSSA)。由于睪丸精原細胞不表達主要組織相容性抗原復合物(major histocompatibility complex，MHC)I類分子，因此CTA誘導的CTL的免疫應答對睪丸細胞無傷害，只殺傷腫瘤細胞。正是因為這種特性使得CTA成為腫瘤免疫治療的理想抗原。人類XAGE-1屬于GAGE/PAGE家族，XAGE-1基因定位于Xp11.21-Xp11.22，包括XAGE-1a、XAGE-1b、XAGE-1c、XAGE-1d四種剪接體，XAGE-1b(X antigen family，member 1b)基因全長622bp，編碼由81個氨基酸組成的蛋白前體。

XAGE-1b在多種腫瘤包括乳腺癌、前列腺癌、各種類型的肺癌(腺癌、鱗癌和小細胞肺癌等)、卵巢癌、黑色素瘤、惡性膠質瘤、淋巴瘤以及白血病等中均有表達。該基因有XAGE-1a、XAGE-1b、XAGE-1c和XAGE-1d4種轉錄異構體，其中XAGE-1b是能夠被免疫細胞識別的優(yōu)勢抗原，免疫原性很強，在NSCLC中特別是肺腺癌中高表達，已成為肺癌免疫治療的一個新靶點。然而，目前尚未有已建立XAGE-1b抗原肽特異性CTL的報道。盡管一些CTA多肽特異性CTL已經建立并通過鑒定，如：NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)抗原特異性CTL，MAGE抗原(melanoma-associated antigens)，MAGE-1特異性CTL等。但由于腫瘤的異質性以及腫瘤患者間的個體差異，獲得足夠多的腫瘤抗原肽特異性CTL克隆是非常必要的。

一般認為多肽的長度越短，其能誘導的特異性免疫能力越弱，甚至完全無法誘導出具有治療價值的CTL克??；反之，多肽長度越長，越能誘導出特異性CTL克隆。然而多肽的長度越長，合成難度越大，越難以獲得純的多肽，雜質肽的存在對克隆的形成存在不可預知的影響，而多肽的純化成本極高但是依然難以避免雜質肽的存在，這種方案的成本極其高昂。因此，人們希望在盡可能保留多肽抗原性的情況下縮短多肽的長度。CN102428102A公開的技術方案中嘗試截取XAGE-1b抗原中的一部分來誘導對腫瘤的體液免疫或細胞免疫，但是其結果并不能令人滿意，其多肽的長度依然不短于16AA。

短肽還可能存在特異性差的問題，如何獲得特異性好的且具有良好免疫原性的短肽是一項極具挑戰(zhàn)性的工作。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供腫瘤相關抗原XAGE-1b短肽及其應用。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

XAGE-1b短肽，其序列為SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13中一條。

如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13所示的XAGE-1b短肽可誘導腫瘤特異性細胞毒性T細胞的產生。

腫瘤特異性細胞毒性T細胞的誘導方法，使用SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13的XAGE-1b短肽中的至少一條經樹突狀細胞提呈與CD8⁺T細胞共培養(yǎng)，誘導篩選得到腫瘤特異性細胞毒性T細胞。

一種腫瘤多肽疫苗，由活性抗原成分和輔劑組成，活性抗原成分為如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13XAGE-1b短肽中的至少一條。

一種用于腫瘤治療的DC疫苗，主要由SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13的XAGE-1b短肽中的至少一條和樹突狀細胞加載得到。

由于本發(fā)明所選短肽在非小細胞肺癌中的高度特異性表達，通過合成與SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13所示XAGE-1b短肽特異性結合的熒光探針，可開發(fā)具有自主知識產權分子探針的試劑盒，用于非小細胞肺癌的早期診斷與治療，并建立相關的研究平臺。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的XAGE-1b抗原肽誘導建立的CTL對睪丸細胞不會產生免疫應答，只殺傷腫瘤細胞。誘導得到的CTL克隆具有良好的腫瘤細胞特異性殺傷效應。同時在建立CTL過程中，發(fā)明人發(fā)現篩選出的XAGE-1b抗原肽具有與DC細胞上HLA適當的親和力并能有效地刺激、誘導產生特異性CTLs，說明其具備良好的多肽疫苗及DC疫苗的潛力。通過克隆XAGE-1b抗原肽特異性TCR基因，構建病毒載體，轉導外周循環(huán)CD8+T細胞，獲得TCR基因修飾的T細胞(TCR-T)克隆，同樣具有與親代CTL相似的腫瘤細胞特異性殺傷效應，提示其具有良好的臨床轉化及實際應用前景。

附圖說明

圖1是XAGE-1b在肺腺癌細胞中的表達情況；

圖2是XAGE-1b(51-59)特異性CTL IFN-γ釋放試驗；

圖3是XAGE-1b(62-70)特異性CTL IFN-γ釋放試驗。

具體實施方式

腫瘤抗原選用XAGE-1b抗原，XAGE-1b基因位于X染色體(Xp11.21-Xp11.22)，全長622bp，編碼由81個氨基酸組成的蛋白前體。氨基酸序列如下(源自GenBank:NM_001097594.2)：

MESPKKKNQQLKVGILHLGSRQKKIRIQLRSQCATWKVICKSCISQTPGINLDLGSGVKVKIIPKEEHCKMPEAGEEQPQV(SEQ ID NO：1)

下面結合實驗，進一步說明本發(fā)明的技術方案。

XAGE-1b在非小細胞肺癌中的表達

XAGE-1是CTA家族中重要成員，除在非小細胞肺癌中有較廣泛的表達外，在多種惡性腫瘤中有表達，建立XAGE-1b抗原肽特異性CTL克隆具有極其重要的意義。前期研究中發(fā)明人隨機選取外科手術切除肺癌標本(均經病理檢查確診并征得患者同意)，常規(guī)行RT-PCR檢測XAGE-1b mRNA在NSCLC中的表達水平(PCR引物：F：5'-TTTCTCCGCTACTGAGACAC-3'(SEQ ID NO：14)，R：5'-CAGGTGCTGGGAAGGGAAAT-3'(SEQ ID NO：15))。結果如圖1，顯示XAGE-1b在肺腺癌細胞中有較廣泛的表達。

發(fā)明人通過自有方法，對XAGE-1b抗原的CTL表位進行綜合評分，以不同的兩個數據庫(美國國立衛(wèi)生研究所BIMAS，http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/和德國海德堡生物醫(yī)學信息中心SYFPEITHI，http://www.syfpeithi.de/)評分之乘積為該預測表位的總評分，根據總評分預測其CTL的表位。所得候選肽由專業(yè)公司合成。具體多肽序列根據與不同HLA亞型結合分類，具體如下：

HLA-A*1101組：

基于預測結果，發(fā)明人隨機選擇其中的2條進行結果驗證，具體實驗如下。

XAGE-1b短肽特異性CTL克隆建立的操作如下：

同一健康捐獻者的10⁵個CD8+T細胞通過負載XAGE-1b(57-65)肽的10⁴個Mo-DCs間隔1周刺激2次后，再通過自體10⁵個絲裂霉素C處理過的負載XAGE-1b短肽的PBMC刺激1次后，經標準細胞毒試驗篩選獲得。

T2細胞加載5uM XAGE-1b短肽作為靶細胞，CTL的XAGE-1b短肽特異性細胞毒性通過LDH釋放試驗得以證實。

采用以上體外誘導建立XAGE-1b短肽特異性CTL克隆的方法，發(fā)明人還建立了HLA-A*1101限制性XAGE-1b(51-59)(SEQ ID NO：5)及XAGE-1b(62-70)(SEQ ID NO：7)特異性CTL克隆，通過IFN-γ釋放試驗證實其多肽特異性免疫應答效應(如圖2，3)。

上述實驗數據表明，發(fā)明人建立的CTL表位是極其有效的，預測結果與實驗結果符合性非常好。

可見，通過將上述XAGE-1b短肽中的至少一條(SEQ ID NO：2～13)經樹突狀細胞提呈與細胞毒性淋巴T細胞共培養(yǎng)，可誘導篩選得到腫瘤抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞。這種腫瘤抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞可用于腫瘤的治療。

將上述XAGE-1b短肽中的至少一條(SEQ ID NO：2～13)與樹突狀細胞(dendritic cell，DC)加載回輸，可以作為DC疫苗用于腫瘤免疫，刺激機體產生多肽特異性抗腫瘤T細胞，進而實現腫瘤的治療。

上述XAGE-1b短肽中的至少一條(SEQ ID NO：2～13)可以用于測定受試體樣本中針對多肽的抗體水平，進而用于非小細胞肺癌的診斷。

本發(fā)明的XAGE-1b短肽長度僅為9個氨基酸，化學合成難度小，可以直接合成得到高純的產物，應用成本大大降低，同時效果明確，具有很好的應用潛力。

<110> 安, 軍

張, 蓓

<120> 一種腫瘤相關抗原XAGE-1b短肽及應用

<130> XAGE-1b*1101

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

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<212> DNA

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