本發(fā)明屬于生物催化技術領域，涉及一種制備琥珀酰芒柄花苷的菌株及方法，特別涉及一種解淀粉芽孢桿菌及在非水相中制備琥珀酰芒柄花苷的方法。

背景技術：

黃酮類化合物(flavonoids compounds)是植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛地存在于自然植物中，以游離態(tài)或與糖結合為苷的形式存在，不僅數(shù)量種類繁多，而且結構類型復雜多樣，表現(xiàn)出多種多樣的藥理活性，能防治心腦血管系統(tǒng)的疾病和呼吸系統(tǒng)的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗輻射、抗癌、抗腫瘤以及增強免疫能力等藥理作用。近年來，黃酮類化合物的研究進入了一個新的層次，隨著對其構效關系的深入研究，發(fā)現(xiàn)了部分藥理作用的作用機制，為其在醫(yī)藥、食品領域的應用提供了理論依據(jù)，加快了黃酮類化合物的開發(fā)利用。

芒柄花素作為具有代表性的黃酮類化合物之一可以通過調(diào)節(jié)血管張力，起到調(diào)節(jié)血壓的作用，從而對相關心血管疾病進行有效的預防和治療。然而芒柄花素的水溶性較低，這在一定程度上限制了芒柄花素的使用。而芒柄花素的糖基化產(chǎn)物——芒柄花苷及衍生物具有較高的水溶性。同時，芒柄花苷是中藥黃芪、甘草、紅芪、葛根等藥材中黃酮類化合物的代表性成分，具有促進皮膚生長、清除氧自由基、抑制脂質過氧化、維持血中NO濃度和保護缺血再灌注損傷、增強免疫等多種藥理活性(張蔚,等.藥學學報,2014,49(8):1162-1168)。芒柄花苷可以實現(xiàn)有效預防心血管疾病、調(diào)節(jié)腸道環(huán)境等功能。目前，制備芒柄花苷及衍生物主要采用的是化學法合成，成本高，步驟繁瑣。因此，如何轉化制備成芒柄花苷或其衍生物是本發(fā)明的關鍵所在。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌及在非水相中制備琥珀酰芒柄花苷的方法，應用上述菌株在非水相中通過糖基化及琥珀酰化制備琥珀酰芒柄花苷的方法，通過非水相中的糖基化反應提高芒柄花素的水溶性，通過琥珀?；苽涞玫界牾Ｃ⒈ㄜ铡Ｗ鳛樾禄衔?，此前未有報道。

為解決本發(fā)明的技術問題，本發(fā)明的技術方案是：

一種解淀粉芽孢桿菌，保藏名稱：解淀粉芽孢桿菌FJ18(Bacillus amyloliquefaciens FJ18)，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢大學，保藏日期：2016年5月20日；保藏號為：CCTCC NO：M 2016272。

本發(fā)明的另一技術方案是：一種解淀粉芽孢桿菌的用途，在非水相中制備琥珀酰芒柄花 苷中的應用。

本發(fā)明的另一技術方案是：一種使用解淀粉芽孢桿菌在非水相中?；苽溏牾Ｃ⒈ㄜ盏姆椒?，該方法以芒柄花素和糖基供體為原料，在解淀粉芽孢桿菌FJ18的催化作用下，芒柄花素7位酚羥基發(fā)生糖基化反應，形成芒柄花素-7-O-葡萄糖苷；芒柄花素-7-O-葡萄糖苷繼而在解淀粉芽孢桿菌FJ18的催化作用下，葡萄糖基5位羥基發(fā)生琥珀酰化，形成琥珀酰芒柄花苷。

優(yōu)選的，包括以下三個步驟：

步驟(1)：將所述的解淀粉芽孢桿菌FJ18，進行常規(guī)培養(yǎng)、發(fā)酵，發(fā)酵液過濾獲得濕菌體；

步驟(2)：以芒柄花素和糖基供體為原料，用磷酸緩沖溶液及非水相溶劑配制得到原料溶液；

步驟(3)：將步驟(1)的濕菌體或用載體固定化后的濕菌體加入到步驟(2)的溶液中進行催化反應。

優(yōu)選的，步驟(2)中所述的磷酸緩沖溶液濃度為100～150mmol/L，pH為8.0。

優(yōu)選的，步驟(2)中所述的原料溶液，其組分中，芒柄花素的濃度為0.01～0.5g/L，糖基供體的溶液濃度為5～50g/L，非水相溶劑體積百分比為5％～20％。

優(yōu)選的，所述的非水相溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮中的任意一種。

優(yōu)選的，所述的非水相溶劑為二甲基亞砜或乙醇。

優(yōu)選的，所述的糖基供體選自麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、糊精中的任意一種。

優(yōu)選的，所述的糖基供體為蔗糖或乳糖。

有益效果：

1.本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌FJ18，難溶于水的底物芒柄花素在非水相中可以以相對較高的濃度下與糖供體之間在生物催化劑存在下發(fā)生糖基化反應，提高反應的催化效率，解決芒柄花苷類化合物稀缺的問題，改善溶解度，為進一步研究黃酮類化合物的生物活性奠定基礎；與化學法合成相比，具有極高的催化位置與立體選擇性，成本較低，糖基化產(chǎn)物單一，分離簡單，具備一定的工業(yè)化前景；

2.相比傳統(tǒng)解淀粉芽孢桿菌，在該菌株的非水相催化體系中，可以進一步得到琥珀?；a(chǎn)物，即本發(fā)明首次利用解淀粉芽孢桿菌催化得到琥珀酰芒柄花苷；

3.本發(fā)明不僅解決了芒柄花素的水溶性低、使用受限的問題，而且所得催化產(chǎn)物琥珀酰芒柄花苷為新化合物，作為一種新的芒柄花苷衍生物，在心血管疾病等領域具有很高的潛在 研究價值。

附圖說明

圖1是琥珀酰芒柄花苷的¹H NMR譜圖。

圖2是琥珀酰芒柄花苷的¹³C NMR譜圖。

圖3是琥珀酰芒柄花苷的HMBC譜圖。

本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌FJ18已經(jīng)于2016年5月20日提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱為CCTCC，位于中國武漢大學)進行保藏，保藏號為CCTCC NO：M2016272。

具體實施方式

為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權利要求的限制。

實施例1

非水相中制備琥珀酰芒柄花苷的菌株的篩選與菌種鑒定

菌種分離土樣為來自江蘇省各地區(qū)化學污染嚴重的土壤和藥用植物園的土壤，從所述土樣中篩選分離獲得耐有機溶劑極端微生物。取約1g土樣，加入到盛有20mL篩選培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃，180r·min^-1水浴振蕩培養(yǎng)24h，再以5％接種量轉接3次。將培養(yǎng)菌液適當稀釋后，以LB平板培養(yǎng)基稀釋涂布，于30℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)，然后挑取單菌落在LB平板培養(yǎng)基進行劃線分離獲得單克隆，對篩選獲得的菌株編號并于超低溫凍存保藏。

以蔗糖為耐有機溶劑菌的生長碳源，加入20％(v/v)二甲基甲酰為篩選壓力，從受化工污染的土樣中篩選分離獲得耐有機溶劑極端微生物。

LB液體培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，pH 7.0；LB平板培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉20g/L。

篩選培養(yǎng)基組成為：芒柄花素0.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L，硫酸鎂0.5g/L，蔗糖20g/L，DMSO 10％(v/v)，初始pH 7.0。

將保藏的菌株，從凍存管接種到LB平板培養(yǎng)基，于30℃，培養(yǎng)24h后接種到篩選培養(yǎng)基中(40mL培養(yǎng)液/250mL三角瓶)，于30℃，200rpm條件下培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基中的熒光變化，并分別取0，12，24h的樣品進行HPLC檢測。反應后，經(jīng)HPLC檢測，獲得4株具有生物轉化芒柄花素的耐有機溶劑菌株。其中一株菌株具有糖基化結構修飾芒柄花素及琥珀酰基化結構修飾芒柄花苷的能力，所獲琥珀酰基化的芒柄花苷產(chǎn)物單一，優(yōu)化后此菌株對底物芒柄花素的轉化率達94.2％。

該菌株在肉湯培養(yǎng)基中生長24h后，菌落大小直徑為1.8mm～2.8mm，生長溫度范圍為20℃～37℃，最適生長溫度為30℃，生長pH范圍為7.0～9.0，最適生長pH為8.0。菌體呈 短桿狀，染色均勻，具運動性，兼性厭氧，可形成內(nèi)生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染色表明此菌株為革蘭氏陽性菌。通過16SRNA同源性鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定此菌株為解淀粉芽孢桿菌，命名為解淀粉芽孢桿菌FJ18。

實施例2

解淀粉芽孢桿菌FJ18的發(fā)酵及靜息細胞的制備

將解淀粉芽孢桿菌FJ18的發(fā)酵接種到種子培養(yǎng)基中：酵母膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH7.0，于30℃，200rpm培養(yǎng)12小時。擴大培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分和含量均為：蔗糖20g/L，酵母粉15g/L.KH₂PO₄ 1.0g/L，CaCl₂ 0.8g/L。以NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0。種子液按0.5％(v/v)接種到擴大培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃，200rpm培養(yǎng)12小時。10000rpm離心15分鐘后收集菌體細胞，以生理鹽水洗滌l～2次，得解淀粉芽孢桿菌FJ18的靜息細胞。

實施例3

將實施例2中的菌體細胞發(fā)酵液過濾，得到濕菌體。以二甲基亞砜、芒柄花素、蔗糖、磷酸緩沖配置原料溶液，即反應溶液。反應溶液中有機溶劑二甲基亞砜的比例為20％(v/v)，芒柄花素0.5g/L，磷酸緩沖的摩爾濃度為150mmol/L，磷酸緩沖的pH 8.0，蔗糖濃度為50g/L。將上述所得的濕菌體分散于反應溶液中，加入到反應器中，于30℃，200rpm條件下培養(yǎng)24h后，10000rpm離心10分鐘得反應溶液上清，HPLC檢測分析測得芒柄花素轉化率為97.2％。

產(chǎn)物用大孔樹脂進行分離，取適量樹脂，用乙醇浸泡24h后，除去樹脂碎片和雜物。濕法裝柱用1L乙醇沖洗，再用蒸餾水洗至無醇味；接行酸堿處理，即先后用體積分數(shù)5％的HCl溶液與質量分數(shù)2％的NaOH溶液分別以2BV/h流速通過樹脂柱，并靜止置2～4h后，用蒸餾水洗至pH值中性。為避免DMSO溶解轉化產(chǎn)物降低上樣吸附率，所以轉化液用5倍體積的去離子水(pH4.0，冰醋酸調(diào)節(jié))稀釋至DMSO<2％后加樣。加樣量20mg/g濕樹脂，加樣流速20mL/min。用10倍柱床體積的去離子水(pH4.0，冰醋酸調(diào)節(jié))淋洗過量未反應的糖基供體(蔗糖)，直到洗脫液用濃硫酸檢測不出糖為止，流速20mL/min。選用甲醇加去離子水作流動相進行洗脫，調(diào)整甲醇和去離子水的體積比，在洗脫流速20mL/min時，確定洗脫液中甲醇比例。濃縮干燥：經(jīng)HPLC檢測，合并洗脫液，用旋轉蒸發(fā)儀對其減壓真空濃縮，加熱溫度40℃。最后將固體置于真空干燥箱中，40℃干燥6h。

解淀粉芽孢桿菌FJ18非水相中制備琥珀酰芒柄花苷的反應化學式見下式：

經(jīng)核磁共振質譜分析鑒定從NMR圖譜上看，獲得的結構與預期產(chǎn)物的結構一致。以上結果證實該反應中生成了葡萄糖基化的芒柄花素，即琥珀酰芒柄花苷。琥珀酰芒柄花苷的核磁共振波譜數(shù)據(jù)為：

¹H-NMR(MeOH-d₆,600MHz)δ：8.39(1H,s，2-H),8.07(1H,d,J＝8.9Hz，5-H),7.52(2H,d,J＝8.6Hz，2'and 6'-H),7.24(1H,d,J＝2.3Hz，8-H),7.15(1H,dd,J＝8.9Hz,2.4Hz,6-H),7.0(2H,d,J＝8.6Hz,3'and 5'-H),5.15(1H,d,J＝7.4Hz，1”-H),4.42(1H,dd,J＝11.0Hz，2.4Hz,6”-H_A),4.04(1H,dd,J＝11.0Hz，7.2Hz,6”-H_B),3.79(3H,s,-OCH₃),2.47-2.57(4H,m,2”'and 3”'-H)。

¹³C NMR(MeOH-d₆,600MHz)δ：174.7(C-4),173.4(C-4”'),172.0(C-1”'),161.2(C-7),159.1(C-4'),157.0(C-9),153.6(C-2),130.1(C-2',6'),127.0(C-5),124.0(C-3),123.4(C-1'),118.6(C-10),115.6(C-6),113.7(C-3',5'),103.5(C-8),99.8(C-1”),76.3(C-3”),74.0(C-5”),73.1(C-2”),69.9(C-4”),63,6(C-6”),55.2(C-OCH₃)28.7(C-2”'),28.7(C-3”')。

實施例4

將實施例2中的菌體細胞發(fā)酵液過濾，得到濕菌體。以二甲基亞砜、芒柄花素、蔗糖、磷酸緩沖配置原料溶液，即反應溶液。反應溶液中有機溶劑二甲基亞砜的比例為15％(v/v)，芒柄花素1.0g/L，磷酸緩沖的摩爾濃度為125mmol/L，磷酸緩沖的pH 8.0，蔗糖濃度為25g/L。將上述所得的濕菌體分散于反應溶液中，加入到反應器中，于30℃，200rpm條件下培養(yǎng)24h后，10000rpm離心10分鐘得反應溶液上清，HPLC檢測分析測得芒柄花素轉化率為95.8％。

產(chǎn)物用大孔樹脂進行分離，方法同實施例3；產(chǎn)物檢測方法同實施例3。

實施例5

將實施例2中的菌體細胞發(fā)酵液過濾，得到濕菌體。以二甲基亞砜、芒柄花素、蔗糖、磷酸緩沖配置原料溶液，即反應溶液。反應溶液中有機溶劑二甲基亞砜的比例為5％(v/v)，芒柄花素0.1g/L，磷酸緩沖的摩爾濃度為100mmol/L，磷酸緩沖的pH 8.0，蔗糖濃度為5g/L。將上述所得的濕菌體分散于反應溶液中，加入到反應器中，于30℃，200rpm條件下培養(yǎng)36h后，10000rpm離心10分鐘得反應溶液上清，HPLC檢測分析測得芒柄花素轉化率為95.6％。產(chǎn)物用大孔樹脂進行分離，方法同實施例3；產(chǎn)物檢測方法同實施例3。

實施例6

將實施例2中的菌體細胞發(fā)酵液過濾，得到濕菌體。以乙醇、芒柄花素、蔗糖、磷酸緩 沖配置原料溶液，即反應溶液。反應溶液中有機溶劑乙醇的比例為15％(v/v)，芒柄花素1.0g/L，磷酸緩沖的摩爾濃度為125mmol/L，磷酸緩沖的pH 8.0，乳糖濃度為30g/L。將上述所得的濕菌體分散于反應溶液中，加入到反應器中，于30℃，200rpm條件下培養(yǎng)48h后，10000rpm離心10分鐘得反應溶液上清，HPLC檢測分析測得芒柄花素轉化率為94.2％。產(chǎn)物用大孔樹脂進行分離，方法同實施例3；產(chǎn)物檢測方法同實施例3。