本發(fā)明涉及生物領域中的一種柔嫩梭菌及其培養(yǎng)方法與應用。
背景技術：
柔嫩梭菌類群是人糞便菌群中數(shù)量最占優(yōu)勢的三大類群之一，而柔嫩梭菌作為該類群的優(yōu)勢菌，在腸道細菌中所占的比例約為16%±7%，能夠從健康人的糞便中分離得到。作為益生菌，它對我們的人體健康發(fā)揮著重要的作用：第一，促進上皮細胞的生長與分化。柔嫩梭菌產(chǎn)生的丁酸，可最終代謝產(chǎn)生丁酸鈉抑制結(jié)腸上皮細胞系的增殖、促進結(jié)腸上皮細胞系的分化。第二，促進食物的消化及營養(yǎng)代謝。柔嫩梭菌具有人體所不具備的酶（如纖維素酶），能夠代謝宿主自身不能利用的非消化性碳水化合物，產(chǎn)生單糖或短鏈脂肪酸被人體所利用。第三，調(diào)節(jié)人體的免疫功能。柔嫩梭菌可以誘導免疫抑制細胞Treg，能夠改善炎癥性腸病，包括克羅恩病和潰瘍性腸炎，同時高效的治療過敏性肺部炎癥、氣道炎癥等，大大維持人體的免疫功能。第四，調(diào)節(jié)細菌的多樣性，維持腸道細菌的穩(wěn)態(tài)。第五，能夠發(fā)酵產(chǎn)生乙酸和氫氣，乙酸可用作酸度調(diào)節(jié)劑、酸化劑、腌漬劑、增味劑、香料等，同時也是很好的抗微生物劑，而氫氣在工業(yè)和醫(yī)學領域均有重要的用途。因此，對于人體的保健，柔嫩梭菌具有巨大的研究意義。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是提供一種柔嫩梭菌，該梭菌能夠降解膳食纖維產(chǎn)生益生因子丁酸鹽，梭菌本身可以誘導免疫抑制細胞Treg的產(chǎn)生。
本發(fā)明所提供的梭菌，被鑒定為柔嫩梭菌（Clostridium leptum），來源于健康人體的糞便。
所述柔嫩梭菌，其分類命名為柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319，已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（簡稱GDMCC，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓），保藏編號為：GDMCC No：60042，保藏日期為：2016年5月25月。
本發(fā)明所提供的柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319具有以下特征：
1）菌落特征：菌落呈圓形，直徑為0.2～0.5mm，呈白色，表面凸起，邊緣光滑。
2）細胞形態(tài)特征：細胞呈桿狀，稍彎曲，近終端孢子很少，兩端圓鈍，細胞約為（1.3～2.8）×（0.6～0.8）μm；革蘭氏染色呈陽性；。
3）生理生化特征：專性厭氧生長；不水解明膠，不消化血清蛋白，能夠代謝抗性淀粉、纖維素、半纖維素、膠質(zhì)等多糖以及一些寡糖，由此產(chǎn)生的單糖或短鏈脂肪酸能夠被宿主所利用。
4)柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的16S rRNA基因序列長度為1278bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所提供的柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的培養(yǎng)方法，是將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319接種于RCM培養(yǎng)基，32℃~38℃，pH 6~8.5條件下厭氧培養(yǎng)。
在1000 mL RCM液體培養(yǎng)基中含有：胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；余量為蒸餾水；
RCM固體培養(yǎng)基是向上述RCM培養(yǎng)基中加入16g瓊脂，蒸餾水定容至1000 mL。
上述RCM培養(yǎng)基還包括氧化還原指示劑刃天青，其含量為0.5 g/L。
本發(fā)明培養(yǎng)方法中，所需的厭氧環(huán)境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合氣組成，一般注入達到1個大氣壓的量。
本發(fā)明所提供的培養(yǎng)柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的方法，培養(yǎng)效率高，可達4.67×109 CFU/mL。
本發(fā)明的柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319是從健康人體的糞便中分離得到的，是人體腸道的益生菌，在腸道菌類群上占有絕對優(yōu)勢，約占16%±7%。該梭菌可以降解膳食纖維產(chǎn)生人體所需的益生因子丁酸鹽，丁酸鹽對于人體的能量供應及腸上皮細胞的發(fā)育有重要作用，并在一定程度上抑制結(jié)腸癌的發(fā)生。另外，該梭菌還可以誘導免疫抑制細胞Treg，有效的治療炎癥及人體自身免疫性疾病。目前，就有研究通過口服柔嫩梭菌的方式來治療小鼠的過敏性炎癥、氣道炎癥。由此看來，柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319具有廣闊的研究意義及背景。
本發(fā)明所述的菌種，其分類命名為柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319，已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），保藏編號為：GDMCC No：60042，保藏日期為：2016年5月25日，保藏地址為：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。
實驗中所使用的RCM液體培養(yǎng)基的基本組成為（/ 升）：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸餾水定容至1000 mL。
實驗中所使用的RCM固體培養(yǎng)基是向上述RCM液體培養(yǎng)基中加入16g瓊脂，使其終濃度為1.6%。
實施例1、菌株柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的分離制備
取健康人體糞便的水解液，制備成懸菌液，后將其接種于以抗性淀粉為底物的RCM液體培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，得到富集物；將富集物作為接種源，將其接種于以纖維素為底物的RCM固體培養(yǎng)基，用Hungate滾管技術進行分離，最后得到純化菌種。
將其保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），保藏編號為：GDMCC No：60042，保藏日期為：2016年5月25日，保藏地址為：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。
實施例2、菌種鑒定
一、形態(tài)及生理生化特征
將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319接種于以纖維素為底物的RCM固體培養(yǎng)基，在pH為7，溫度為37 ℃，混合氣為80% N2、10% H2和10%CO2的條件下進行厭氧培養(yǎng)72 h。
觀察菌落及細胞的形態(tài)特征，并進行如下生理生化實驗：1 革蘭氏染色試驗；2液化明膠試驗；3 血清蛋白試驗；4 底物利用試驗。
觀察結(jié)果及實驗結(jié)果如下：
1）菌落特征：菌落呈圓形，直徑為0.2～0.5mm，呈白色，表面凸起，邊緣光滑。
2）細胞形態(tài)特征：細胞呈桿狀，稍彎曲，近終端孢子很少，兩端圓鈍，細胞約為（1.3～2.8）×（0.6～0.8）μm；革蘭氏染色呈陽性。
3）生理生化特征：專性厭氧生長；不水解明膠，不消化血清蛋白，能夠代謝抗性淀粉、纖維素、半纖維素、膠質(zhì)等多糖以及一些寡糖，由此產(chǎn)生的單糖或短鏈脂肪酸能夠被宿主所利用。
二、柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的16S rRNA基因的PCR擴增和序列測定：
1）提取DNA（參照TAKARA提基因組試劑盒）：
將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319接種于RCM液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；通過測OD值，取生長至對數(shù)晚期的發(fā)酵液，12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去除上清液；加入500 μL的Buffer BS重懸細胞，加入50 μL的Lysozyme（20 mg/mL），充分吸打混勻，于37 ℃水浴溫育1小時（每隔20分鐘顛倒混勻一次）；12,000 rpm離心5分鐘，棄上清；加入180 μL的Buffer GL、20 μL的Proteinase K（20 mg/mL）和10 μL的RNase A（10 mg/mL），充分吸打混勻，于56 ℃水浴溫育10分鐘；加入200 μL的Buffer GB和200 μL的100%乙醇，充分吸打混勻；將Spin Column安裝在Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000 rpm離心2分鐘，棄濾液；將500 μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液；將700 μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液，重復一次；將Spin Column安置在Collection Tube上，12,000 rpm離心2分鐘；將Spin Column安置在新的1.5 mL離心管上，在Spin Column膜的中央處加入70 μL的65℃滅菌蒸餾水，室溫靜置5分鐘；12,000 rpm離心2分鐘洗脫DNA。
2）16S rRNA基因的PCR擴增及測序
用于PCR擴增的正向引物為5’-CTGGCTTCGGGTATTACCGGCTCCC-3’，反向引物為5’-TTCAGAGGGGGATAACGTTCTGAAA-3’。PCR反應體系（25 μL）為：Mix 12.5 μL；正向引物1 μL；反向引物1 μL；DNA模板2 μL；ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min30 s，72 ℃ 7 min ，30個循環(huán)，4 ℃保存。
PCR產(chǎn)物的測序送至金唯智公司完成。
測序結(jié)果表明，柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的16S rRNA基因序列長度為1278bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
將16S rRNA基因序列在GenBank中進行序列比對分析，結(jié)果表明，其序列與Clostridium leptum的16S rRNA基因序列的相似性為100%。
綜上，根據(jù)《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》（第二版），根據(jù)其形態(tài)特征和生理生化特征，以及根據(jù)其16S rRNA基因序列在GenBank中的比對結(jié)果，柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319被鑒定為新種柔嫩梭菌（Clostridium leptum）。
實施例3、柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的培養(yǎng)
1）將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319以6%的比例接種于50 mL RCM液體培養(yǎng)基中，在27℃，pH 6.0的條件下培養(yǎng)。
RCM液體培養(yǎng)基的組成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸餾水定容至1000 mL。
培養(yǎng)所需的厭氧環(huán)境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合氣組成，一般注入達到1個大氣壓的量。
實驗進行三次重復，菌體的平均濃度達（2.1±0.4）×109 CFU/mL。
2）將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319以6%的比例接種于50 mL RCM液體培養(yǎng)基，在32 ℃，pH 6.5的條件下培養(yǎng)。
RCM液體培養(yǎng)基的組成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸餾水定容至1000 mL。
所需的厭氧環(huán)境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合氣組成，一般注入達到1個大氣壓的量。
實驗進行三次重復，菌體的平均濃度達（3.0±0.4）×109 CFU/mL。
3）將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319以6%的比例接種于50 mL RCM液體培養(yǎng)基，在37 ℃，pH 7.0的條件下培養(yǎng)。
RCM液體培養(yǎng)基的組成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸餾水定容至1000 mL。
所需的厭氧環(huán)境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合氣組成，一般注入達到1個大氣壓的量。
實驗進行三次重復，菌體的平均濃度達（4.2±0.4）×109 CFU/mL。
4）將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319以6%的比例接種于50 mL RCM液體培養(yǎng)基，在42 ℃，pH 7.5的條件下培養(yǎng)。
RCM液體培養(yǎng)基的組成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸餾水定容至1,000 mL。
所需的厭氧環(huán)境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合氣組成，一般注入達到1個大氣壓的量。
實驗進行三次重復，菌體的平均濃度達（3.3±0.4）×109 CFU/mL。
5）將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319以6%的比例接種于50 mL RCM液體培養(yǎng)基，在47 ℃，pH 8.0的條件下培養(yǎng)。
RCM液體培養(yǎng)基的組成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸餾水定容至1000 mL。
所需的厭氧環(huán)境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合氣組成，一般注入達到1個大氣壓的量。
實驗進行三次重復，菌體的平均濃度達（2.3±0.3）×109 CFU/mL。
6）將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319以6%的比例接種于50 mL RCM液體培養(yǎng)基，在47℃，pH 8.5的條件下培養(yǎng)。
RCM液體培養(yǎng)基的組成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸餾水定容至1000 mL。
所需的厭氧環(huán)境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合氣組成，一般注入達到1個大氣壓的量。
實驗進行三次重復，在三次重復中，菌體均不生長。
實驗結(jié)果表明：柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319進行厭氧生長，在27℃-42℃ 溫度下菌株生長，在47℃ 下不生長，菌株的最適生長溫度為32℃-38℃；pH生長范圍6-8.5，最適生長pH為6.5-7.0。在最適生長條件下，菌體濃度可達（4.2±0.4）×109CFU/mL。
實施例4、柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319中纖維素酶的酶活測定
一、制備酶液
將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319接種于RCM液體培養(yǎng)基，pH為7，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)72h后，離心，去除上清；用PBS緩沖液重懸細胞沉淀，得到酶液。
RCM培養(yǎng)基組成為（/ 升）：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸餾水定容至1000 mL。
所需的厭氧環(huán)境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合氣組成，一般注入達到1個大氣壓的量。
二、標準曲線的繪制
1）分別吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的葡萄糖于比色管中，均用蒸餾水稀釋至1mL，加3.5-二硝基水楊酸顯色劑3mL，在沸水浴中煮沸顯色10分鐘，冷卻，加蒸餾水21mL，搖勻。
2）以1mL蒸餾水代替糖作空白管，在550nm處比色。以光密度為縱坐標，以葡萄糖微g數(shù)為橫坐標，繪出標準曲線。
三、空白管的測定
取1mL酶液，沸水浴5分鐘，冷卻加3Ml 0.5%CMC，與樣品管同時放入50℃水浴30分鐘。其它操作同樣品管。
四、樣品的測定
取0.5%羧甲基纖維素鈉溶液3mL，酶液1mL，于50℃水浴中糖化30分鐘，取出，立即于沸水浴中煮沸10分鐘使酶失活，得糖化液，冷卻加入3mL顯色液，再沸水浴10分鐘，冷卻后加水定容至25mL，混勻，550nm測OD值。
分別進行三次重復實驗，取平均值。
相較于使用CM斜面培養(yǎng)基和PY-麥芽糖肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)柔嫩梭菌ATCC 29065，使用RCM培養(yǎng)基培養(yǎng)的柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319酶活更高，為2450 U/mL。
實施例5、柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319中氫氣的測定
柔嫩梭菌中能夠產(chǎn)生豐富的氫氣，而氫氣在工業(yè)和醫(yī)學領域均有著重要的用途。
將柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319接種于50 mL RCM液體培養(yǎng)基，在37 ℃，pH 7.0的條件下培養(yǎng)。
RCM培養(yǎng)基組成為（/ 升）：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化鈉，5 g；酵母膏，3 g；乙酸鈉，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸餾水定容至1000 mL。
所需的厭氧環(huán)境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合氣體組成，一般注入達到1個大氣壓的量。
實驗裝置選用E-Switch的采樣袋和Thermo的氣相裝置。
一、氣體的采集
使用采集袋同時采集10瓶液體培養(yǎng)基的氣體，密封。
二、氫氣的檢測
1）通過轉(zhuǎn)動進樣閥V1，樣品中的H2，O2，N2，，CO2組分很快進入Porapak N 色譜柱。
2）在Porapak N 色譜柱上，CO2和其他組分完全分離，其他未分離組分進入MolSieve 5A 分子篩色譜柱。
3）H2先從MolSieve 5A 分子篩色譜柱流出，進入TCD 檢測器檢測。
4）當H2從MolSieve 5A 分子篩色譜柱流出進入檢測器后，轉(zhuǎn)動V2 至ON 狀態(tài)，被分離的CO2組分不經(jīng)過MolSieve 5A 色譜柱直接進入檢測器檢測。
5）當CO2進入檢測器后，V2、V1 轉(zhuǎn)為OFF 的狀態(tài)，CO2后面的組分被反吹出去，被隔離在分子篩色譜柱中的O2，N2， 組分得到分離進入檢測器檢測。
6）V1 和V2 回復至初始狀態(tài)OFF，準備下次進樣分析。
經(jīng)過三次重復的實驗，最終分析得氫氣的產(chǎn)量為3.84×105~4.61×105ppm。
序列表
<110> 南京工業(yè)大學
<120> 一種柔嫩梭菌及其培養(yǎng)方法與應用
<130> xb16082203
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1278
<212> DNA
<213> Clostridium leptum
<400> 1
ctggcttcgg gtattaccgg ctcccatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa 60
cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcaat tccgacttca cgcaggcggg 120
ttgcagcctg cgatccgaac tgggactgct tttagggttt tgctccacct cgcggctttg 180
cttccctctg tttacagcca ttgtagtacg tgtgtggccc aggtcataag gggcatgatg 240
atttgacgtc gtccccacct tcctccgttt tgtcaacggc agtctctcta gagtgctctt 300
gcgtagcaac tagaaacaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac 360
acgagctgac gacaaccatg caccacctgt ctcgcctttc cccgaagggc acctaatgca 420
tctctgcttc gttagacgga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta 480
aaccacatac tccactgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt caaccttgcg 540
gccgtactcc ccaggtggat tacttattgt gttaactgcg gcacggaggg ggtcagaccc 600
cccacaccta gtaatcatcg tttacggcat ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct 660
acccatgctt tcgtgcttca gcgtcagtta aagcccagta ggccgccttc gccactggtg 720
ttcctcccga tctctacgca tttcaccgct acaccgggaa ttccgcctac ctctacttca 780
ctcaagcaag acagtttcaa gcgcagttta tgggttaagc ccatagattt cacgcctgac 840
ttgcctcgcc gcctacgcac cctttacacc cagtaaatcc ggacaacgct cgctccctac 900
gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccggagcttt ctccttagct accgtcatta 960
tcgtcactaa gaacagaggt ttacaatccg aaaaccttct tccctcacgc ggcgttgctg 1020
catcagggtt tcccccattg tgcaatatcc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1080
cgtgtctcag tcccaatgtg gccgttcaac ctctcagtcc ggctaccgat cgtcgctttg 1140
gtgggccgtt accccgccaa ctggctaatc ggacgcgagt ccatcttcca gcggattgct 1200
cctttgatca acctatcatg cgataaattg atgttatgcg gtattagcgt tcttttcaga 1260
acgttatccc cctctgaa 1278