本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)為芽孢桿菌屬，是一種與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)親緣性很高的細(xì)菌，其在生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝物。
自Johnson等報(bào)道枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后從不同芽孢桿菌中分離得到多種抑菌物質(zhì)，包括多肽類(lèi)、脂肽類(lèi)及抑菌蛋白類(lèi)等。解淀粉芽孢桿菌作為一種益生菌，在其生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，為其在動(dòng)植物生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用提供了可能。
然而，目前在培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌分泌抑菌物質(zhì)方面，所用的培養(yǎng)基成分復(fù)雜，成本較高，培養(yǎng)方法也有較多限制因素，這極大限制了解淀粉芽孢桿菌的研究和實(shí)際應(yīng)用。
目前，我國(guó)馬鈴薯淀粉加工生產(chǎn)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的廢水，每生產(chǎn)1噸淀粉約產(chǎn)生7噸左右的廢水。廢水直接排放會(huì)導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化等環(huán)境問(wèn)題，必須經(jīng)處理達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)后才能排放入水體等環(huán)境中。如何處理馬鈴薯淀粉加工廢水是本領(lǐng)域的重要課題。
在通用培養(yǎng)基中，雖然馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基利用了馬鈴薯作為原 料，但并不能解決馬鈴薯淀粉加工廢液的處理問(wèn)題。
因此，本領(lǐng)域亟待尋求一種成本低廉、能利用馬鈴薯淀粉加工廢水作為原料且能促進(jìn)解淀粉芽孢桿菌分泌抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
(1)制備解淀粉芽孢桿菌種子液；
(2)將種子液接種于馬鈴薯淀粉廢水培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
所述馬鈴薯淀粉廢水培養(yǎng)基由如下組分組成：
如本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)例所示，按照本發(fā)明的培養(yǎng)方法，可使得解淀粉芽孢桿菌分泌抑菌物質(zhì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)指示菌金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌效果。
雖然“Bioconversion of potato starch wastewater into biofertilizer by Bacillus amyloliquefaciens for improving tea yield”和《檸檬酸廢水和馬鈴薯淀粉廢水資源化培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用》記載的培養(yǎng)方法能利用馬鈴薯淀粉廢水對(duì)解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，但卻無(wú)法使得解淀粉芽孢桿菌分泌抗菌物質(zhì)。
優(yōu)選的，步驟(1)中種子液的制備方法為：挑取解淀粉芽孢桿菌斜面接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，于37℃、160r/min條件下，培養(yǎng)24h。
所述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的制作方法為：取已去皮切塊的馬鈴薯200g，加水煮沸30min，紗布過(guò)濾，加入20g/L葡萄糖，補(bǔ)水至1L，調(diào)節(jié)pH＝7.0±0.2；所述馬鈴薯廢水的制作方法為：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水打汁，過(guò)濾后離心，取上清液，即得；優(yōu)選的，所述馬鈴薯廢水的制作方法為：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水絞碎打汁，靜置15min，用四層紗布過(guò)濾，濾液靜置2h后，在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，即得。
優(yōu)選的，在步驟(2)中，種子液的接種量為6％。
優(yōu)選的，在步驟(2)中，發(fā)酵初始pH為7.0。
優(yōu)選的，在步驟(2)中，發(fā)酵溫度為28-37℃，更優(yōu)選為30℃。
優(yōu)選的，在步驟(2)中，發(fā)酵時(shí)間為24-36小時(shí)，更優(yōu)選為24小時(shí)。
優(yōu)選的，在步驟(2)中，發(fā)酵時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為160-220r/min，更優(yōu)選為200r/min。
優(yōu)選的，在步驟(2)中，發(fā)酵瓶中的裝液量為30mL/250mL。
優(yōu)選的，所述馬鈴薯淀粉廢水培養(yǎng)基由如下組分組成：
更優(yōu)選的，所述馬鈴薯淀粉廢水培養(yǎng)基由如下組分組成：
本發(fā)明的有益效果：
1、本發(fā)明的培養(yǎng)方法能使得解淀粉芽孢桿菌分泌抑菌物質(zhì)；
2、本發(fā)明的培養(yǎng)方法所有的培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、廉價(jià)易得，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單易行，適于規(guī)模應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
下述實(shí)施例中，馬鈴薯廢水的制作方法為：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水絞碎打汁，靜置15min，用四層紗布過(guò)濾，濾液靜置2h后，在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，即得。
實(shí)施例1
培養(yǎng)基：
種子液制備：挑取解淀粉芽孢桿菌新鮮斜面接種于PDA液體培養(yǎng)基(搖瓶，裝液量100mL/250mL)，37℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h作為種子液。
培養(yǎng)基115℃滅菌20min，培養(yǎng)基裝液量30mL/250mL，30～50冷卻后，按6％接種量接種解淀粉芽孢桿菌種子液，28℃，220r/min搖床振蕩培養(yǎng)36h。
實(shí)施例2
培養(yǎng)基：
種子液制備：挑取解淀粉芽孢桿菌新鮮斜面接種于PDA液體培養(yǎng)基(搖瓶，裝液量100mL/250mL)，37℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h作為種子液。
培養(yǎng)基115℃滅菌20min，培養(yǎng)基裝液量30mL/250mL，30～50冷卻后，按6％接種量接種解淀粉芽孢桿菌種子液，37℃，160r/min搖床振蕩培養(yǎng)24。
實(shí)施例3
培養(yǎng)基：
種子液制備：挑取解淀粉芽孢桿菌新鮮斜面接種于PDA液體培養(yǎng)基(搖瓶，裝液量100mL/250mL)，37℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h作為種子液。
培養(yǎng)基115℃滅菌20min，培養(yǎng)基裝液量30mL/250mL，30～50冷卻后，按6％接種量接種解淀粉芽孢桿菌種子液，30℃，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h。
實(shí)施例4
培養(yǎng)基：
種子液制備：挑取解淀粉芽孢桿菌新鮮斜面接種于PDA液體培養(yǎng)基(搖瓶，裝液量100mL/250mL)，37℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h作為種子液。
培養(yǎng)基115℃滅菌20min，培養(yǎng)基裝液量30mL/250mL，30～50冷卻后，按6％接種量接種解淀粉芽孢桿菌種子液，30℃，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h。
對(duì)比實(shí)施例1
按“Bioconversion of potato starch wastewater into biofertilizer by Bacillus amyloliquefaciens for improving tea yield”的記載，對(duì)解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。
對(duì)比實(shí)施例2
按《檸檬酸廢水和馬鈴薯淀粉廢水資源化培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用》中第3.1.1部分的記載，對(duì)解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)例
抑菌實(shí)驗(yàn)
1.1供試菌株
解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens PC2，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO：M2015435(已公開(kāi)菌株)；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923(已公開(kāi)菌株)。1.2培養(yǎng)基
牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(g/L)：牛肉浸膏5.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、葡萄糖10.0、瓊脂10.0，pH 7.0±0.2。用于抑菌活性檢測(cè)。
馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：取已去皮切塊的馬鈴薯200g，加水煮沸30min，紗布過(guò)濾，20g/L葡萄糖，補(bǔ)水至1L，調(diào)節(jié)pH 7.0±0.2。用于解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)與活化。
1.3馬鈴薯淀粉廢水制備
實(shí)驗(yàn)室模擬制備馬鈴薯淀粉廢水：馬鈴薯削皮切塊后，按質(zhì)量比1:4加水絞碎打汁，靜置15min，用四層紗布過(guò)濾，濾液靜置2h后， 在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液作為實(shí)驗(yàn)廢水，調(diào)整pH到7.0±0.2。
1.4發(fā)酵液抑菌肽的制備
挑取解淀粉芽孢桿菌新鮮斜面接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(250mL搖瓶，裝液量100mL)，37℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h作為種子液。取解淀粉芽孢桿菌種子液接種于淀粉廢水發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)。取發(fā)酵液于4℃、10000r/min離心10min，上清液用孔徑0.45μm濾膜過(guò)濾獲得去細(xì)胞發(fā)酵液。取10mL無(wú)菌發(fā)酵液，緩慢加入硫酸銨調(diào)節(jié)飽和度至60％，4℃靜置12h，10000r/min、4℃離心20min，收集沉淀，加入0.02mol/LpH 7.0磷酸鹽緩沖液5mL溶解，透析12h除鹽，獲得抑菌肽溶液。
1.5抑菌活性檢測(cè)
挑取金黃色葡萄球菌新鮮斜面接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基250mL搖瓶，裝液量100mL，37℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h，獲得指示菌菌懸液。采用改良雙層平板法檢測(cè)抑菌活性：在直徑9cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入10mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，冷卻凝固作為底層平板。將無(wú)菌牛津杯(外徑8mm)均勻置于底層平板表面，再加入20mL冷卻至約50℃的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，冷卻凝固后取出牛津杯，作為抑菌活性檢測(cè)指示平板。在此平板上加200μL指示菌菌懸液，涂布均勻，然后在牛津杯孔中加入解淀粉芽孢桿菌抑菌肽溶液100μL，37℃培養(yǎng)12h，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑(mm)表示抑菌活性大小。
1.6發(fā)酵條件正交旋轉(zhuǎn)優(yōu)化
采取配方：蔗糖30.2g/L、谷氨酸鈉3.96g/L、(NH4)2SO46.0g/L，馬鈴薯淀粉廢水1000mL，作為培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵液初始pH、裝液量、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響進(jìn)行考察。各單因素最佳條件參數(shù)分別為：pH值7.0、裝液量20mL/250mL、接種量6％、搖床轉(zhuǎn)速200r/min、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間24h。選取對(duì)抑菌效果影響比較顯著的3個(gè)因素：裝液量，搖床轉(zhuǎn)速，發(fā)酵溫度作為自變量，設(shè)計(jì)3因素共20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件。通過(guò)回歸擬合獲得最佳發(fā)酵條件：裝液量為30mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，發(fā)酵溫度為30℃。此時(shí)預(yù)測(cè)最大抑菌圈直徑大小為28.87mm。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得抑菌圈直徑大小為28.26mm，與理論預(yù)測(cè)值相差很小，說(shuō)明采用正交旋轉(zhuǎn)法優(yōu)化得到的條件可靠。
表2發(fā)酵條件正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)得值
表2對(duì)比實(shí)施例抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果