技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枸杞多糖提取物、提取方法及其在制備降血脂藥物中的應(yīng)用，屬于天然產(chǎn)物提取
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：枸杞是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，素有“紅寶”美稱，富含植物多糖、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分。枸杞的主要功效為滋補肝腎，益精明目；用于虛癆精虧、腰膝酸痛；眩暈耳鳴、內(nèi)熱肖渴、血虛萎黃，目昏不明。枸杞多糖是從枸杞中提取而得的一種水溶性多糖。已明確該多糖系蛋白多糖，分子量為22～25kD，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖成分組成，詳細的結(jié)構(gòu)分析尚在進行之中。經(jīng)研究表明，枸杞多糖是枸杞子調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老的主要活性成分，其對惡性腫瘤、艾滋病的預(yù)防與治療也能起到積極作用。另外其可改善老年人易疲勞、食欲不振和視力模糊等癥狀，并具有降血脂、抗脂肪肝、抗腫瘤、抗衰老等作用。CN104231097A公開一種植物多糖的制備方法，包括以下步驟：（1）將枸杞篩選除雜后進行熱風(fēng)干燥脫水，經(jīng)粗顆粒粉機破碎后三級篩分離出果肉粉和枸杞籽；（2）將果肉粉過20目篩后裝料進行超臨界CO2萃??；（3）在提取罐中加入純水加熱浸提，浸提后期將溫度降到45℃時加入果膠酶和纖維素酶保溫，進行離心分離；（4）將分離后的汁液用電滲析脫鹽，然后進行四級超濾處理，反滲透濃縮，再進行冷凍升華干燥，低溫粉碎，經(jīng)包裝后即為成品枸杞多糖。CN104558229A一種枸杞多糖的分離純化方法，該方法使用新型溫敏嵌段共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷與無機鹽形成雙水相體系，去除枸杞多糖中的蛋白質(zhì)，色素等小分子雜質(zhì)。使用透析法去除下相中的無機鹽，乙醇沉淀得到多糖成品。但是上述的多糖存在著提取率不高，活性低的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：解決常規(guī)的枸杞提取物的多糖活性不高、純度低的問題，提供了一種新的枸杞多糖提取物，也提供了該提取物的提取方法以及其在制備降血脂藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案是：一種枸杞多糖提取物，其中多糖純度是56～62%，重均分子量Mw范圍是18000～32000。上述的枸杞多糖提取物的提取方法，包括如下步驟：第1步，按重量份計，取200～220份已干燥的枸杞，加入至石油醚100～120份中，攪拌均勻后，靜置10～20min，抽濾，將固體物在減壓干燥箱中干燥1～3h，得到第一枸杞粉末；第2步，將第一枸杞粉末在20～40℃的范圍下進行高壓處理，得到第二枸杞粉末；第3步，第二枸杞粉末加入蒸餾水中，控制料液比為1g/30～35ml，再在料液中加入0.1～0.2%的酶，進行酶解并提取，抽濾后收集提取液；第4步，提取液中加入乙醇，使乙醇體積濃度大于80%，靜置2～3h，收集沉淀，再用乙醇和丙酮的混合溶液洗滌沉淀，得到粗提物；第5步，將粗提物加水溶解，將料液用納濾膜進行濃縮，得到的濃縮液噴霧干燥后，得到枸杞多糖提取物。所述的第1步中，減壓干燥溫度范圍40～60℃。所述的第2步中，高壓范圍是指壓力0.5～1Mpa。所述的第3步中，酶解并提取的溫度范圍是60～70℃，時間是2～4h。所述的第3步中，所述的酶選自堿性果膠酸裂解酶、堿性纖維素酶、堿性木聚糖酶和漆酶的按照重量比2：3：2：0.5的混合物。所述的第5步中，加水重量是粗提物重量的20～35倍，所述的納濾膜的截留分子量范圍是500～800Da。枸杞多糖提取物在制備治療高血脂藥物中的應(yīng)用。枸杞多糖提取物在制備降解哺乳動物血清中總膽固醇、甘油三酯或者高密度脂蛋白膽固醇藥物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明提供了一種新的枸杞多糖提取物，可以解決常規(guī)的枸杞提取物的多糖活性不高、純度低的問題，枸杞多糖提取物具有較好的降血脂應(yīng)用效果。具體實施方式本發(fā)明中所稱的百分比在無特別說明情況下是指質(zhì)量百分比。實施例1枸杞多糖提取物的提取方法，包括如下步驟：第1步，按重量份計，取200份已干燥的枸杞，加入至石油醚100份中，攪拌均勻后，靜置10min，抽濾，將固體物在40℃減壓干燥箱中干燥1h，得到第一枸杞粉末；第2步，將第一枸杞粉末在20℃的范圍下進行0.5Mpa高壓處理，得到第二枸杞粉末；第3步，第二枸杞粉末加入蒸餾水中，控制料液比為1g/30ml，再在料液中加入0.1%的酶，進行酶解并提取，所述的酶選自堿性果膠酸裂解酶、堿性纖維素酶、堿性木聚糖酶和漆酶的按照重量比2：3：2：0.5的混合物，酶解并60℃提取的溫度范圍是，時間是2h，抽濾后收集提取液；第4步，提取液中加入乙醇，使乙醇體積濃度80%，靜置2h，收集沉淀，再用乙醇和丙酮的混合溶液洗滌沉淀，得到粗提物；第5步，將粗提物加水溶解，加水重量是粗提物重量的20倍，將料液用截留分子量500Da納濾膜進行濃縮，得到的濃縮液噴霧干燥后，得到枸杞多糖提取物。上述得到的枸杞多糖提取物，其中多糖純度是58.2%，重均分子量Mw是22125。實施例2枸杞多糖提取物的提取方法，包括如下步驟：第1步，按重量份計，取220份已干燥的枸杞，加入至石油醚120份中，攪拌均勻后，靜置20min，抽濾，將固體物在60℃減壓干燥箱中干燥3h，得到第一枸杞粉末；第2步，將第一枸杞粉末在40℃的范圍下進行1Mpa高壓處理，得到第二枸杞粉末；第3步，第二枸杞粉末加入蒸餾水中，控制料液比為1g/35ml，再在料液中加入0.2%的酶，進行酶解并提取，所述的酶選自堿性果膠酸裂解酶、堿性纖維素酶、堿性木聚糖酶和漆酶的按照重量比2：3：2：0.5的混合物，酶解并70℃提取的溫度范圍是，時間是4h，抽濾后收集提取液；第4步，提取液中加入乙醇，使乙醇體積濃度80%，靜置3h，收集沉淀，再用乙醇和丙酮的混合溶液洗滌沉淀，得到粗提物；第5步，將粗提物加水溶解，加水重量是粗提物重量的35倍，將料液用截留分子量800Da納濾膜進行濃縮，得到的濃縮液噴霧干燥后，得到枸杞多糖提取物。上述得到的枸杞多糖提取物，其中多糖純度是61.2%，重均分子量Mw是28479。實施例3枸杞多糖提取物的提取方法，包括如下步驟：第1步，按重量份計，取210份已干燥的枸杞，加入至石油醚110份中，攪拌均勻后，靜置15min，抽濾，將固體物在45℃減壓干燥箱中干燥2h，得到第一枸杞粉末；第2步，將第一枸杞粉末在30℃的范圍下進行0.8Mpa高壓處理，得到第二枸杞粉末；第3步，第二枸杞粉末加入蒸餾水中，控制料液比為1g/32ml，再在料液中加入0.15%的酶，進行酶解并提取，所述的酶選自堿性果膠酸裂解酶、堿性纖維素酶、堿性木聚糖酶和漆酶的按照重量比2：3：2：0.5的混合物，酶解并65℃提取的溫度范圍是，時間是3h，抽濾后收集提取液；第4步，提取液中加入乙醇，使乙醇體積濃度80%，靜置3h，收集沉淀，再用乙醇和丙酮的混合溶液洗滌沉淀，得到粗提物；第5步，將粗提物加水溶解，加水重量是粗提物重量的30倍，將料液用截留分子量700Da納濾膜進行濃縮，得到的濃縮液噴霧干燥后，得到枸杞多糖提取物。上述得到的枸杞多糖提取物，其中多糖純度是58.4%，重均分子量Mw是29647。對照例1與實施例3的區(qū)別在于：未對枸杞進行第1步的石油醚萃取操作。枸杞多糖提取物的提取方法，包括如下步驟：第1步，按重量份計，取210份已干燥的枸杞，在45℃減壓干燥箱中干燥2h，得到第一枸杞粉末；第2步，將第一枸杞粉末在30℃的范圍下進行0.8Mpa高壓處理，得到第二枸杞粉末；第3步，第二枸杞粉末加入蒸餾水中，控制料液比為1g/32ml，再在料液中加入0.15%的酶，進行酶解并提取，所述的酶選自堿性果膠酸裂解酶、堿性纖維素酶、堿性木聚糖酶和漆酶的按照重量比2：3：2：0.5的混合物，酶解并65℃提取的溫度范圍是，時間是3h，抽濾后收集提取液；第4步，提取液中加入乙醇，使乙醇體積濃度80%，靜置3h，收集沉淀，再用乙醇和丙酮的混合溶液洗滌沉淀，得到粗提物；第5步，將粗提物加水溶解，加水重量是粗提物重量的30倍，將料液用截留分子量700Da納濾膜進行濃縮，得到的濃縮液噴霧干燥后，得到枸杞多糖提取物。上述得到的枸杞多糖提取物，其中多糖純度是51.9%，重均分子量Mw是45771。對照例2與實施例3的區(qū)別在于：在第3步的酶解中堿性果膠酸裂解酶未加入，其重量被堿性木聚糖酶所替代。枸杞多糖提取物的提取方法，包括如下步驟：第1步，按重量份計，取210份已干燥的枸杞，加入至石油醚110份中，攪拌均勻后，靜置15min，抽濾，將固體物在45℃減壓干燥箱中干燥2h，得到第一枸杞粉末；第2步，將第一枸杞粉末在30℃的范圍下進行0.8Mpa高壓處理，得到第二枸杞粉末；第3步，第二枸杞粉末加入蒸餾水中，控制料液比為1g/32ml，再在料液中加入0.15%的酶，進行酶解并提取，所述的酶選自堿性纖維素酶、堿性木聚糖酶和漆酶的按照重量比2：3：4：0.5的混合物，酶解并65℃提取的溫度范圍是，時間是3h，抽濾后收集提取液；第4步，提取液中加入乙醇，使乙醇體積濃度80%，靜置3h，收集沉淀，再用乙醇和丙酮的混合溶液洗滌沉淀，得到粗提物；第5步，將粗提物加水溶解，加水重量是粗提物重量的30倍，將料液用截留分子量700Da納濾膜進行濃縮，得到的濃縮液噴霧干燥后，得到枸杞多糖提取物。上述得到的枸杞多糖提取物，其中多糖純度是51.5%，重均分子量Mw是56227。用高膽固醇和脂類飼料喂養(yǎng)動物并輔以脂肪乳灌胃可快速穩(wěn)定的形成脂代謝紊亂動物模型，給予動物本發(fā)明以上實施例1～3、對照例1～2的枸杞多糖提取物，以檢測枸杞多糖提取物對高血脂癥的影響。實驗材料藥品：實施例1～3、對照例1～2的枸杞多糖提取物。實驗動物種系：SD大鼠。級別：SPF級。性別和數(shù)量：80只，雌雄各半。動物體重：50～80g。飼養(yǎng)條件：為便于觀察動物每日飲水量和進食量，實驗動物單籠飼養(yǎng)，室溫20～25℃，相對濕度為40～70%，照明時間12小時。定時定量添加飼料，食用鼠專用顆粒飼料，飲自來水，每日更換墊料。其他試劑和藥品陽性藥：辛伐他汀片。高脂飼料：10%蛋黃粉、10%豬油、1%膽固醇、0.2%膽鹽和78.8%基礎(chǔ)飼料。脂肪乳劑：10%膽固醇、20%豬油、2%膽酸鈉、1%甲基硫氧嘧啶。實驗儀器：全自動生化分析儀實驗方法脂肪乳劑的配制參照文獻，取豬油20g置于500ml燒杯中，在電爐上加熱融化，加入10g膽固醇溶化，再加入2g膽酸鈉和1g甲基硫氧嘧啶，充分?jǐn)噭?；然后放?0ml吐溫80、20ml丙二醇及30ml蒸餾水，不斷攪拌。待甲基硫氧嘧啶溶解后，冷卻至室溫，再加蒸餾水至100ml，并充分混勻，即成10％膽固醇、20％豬油、2％膽酸鈉、1％甲基硫氧嘧啶的脂肪乳劑。冰箱保存，使用時先于37℃水浴中融化。實驗分組及造模方法SD大鼠80只，適應(yīng)飼養(yǎng)一周后稱重，實驗環(huán)境下，正常組給予正常大鼠飼料飼喂。其余各組大鼠均飼喂高脂飼料，同時每天按1ml/100g劑量灌胃脂肪乳劑，連續(xù)15天后禁食16小時，取血，測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，根據(jù)血清總膽固醇(TC)水平選擇造模成功的實驗動物，隨機分成8組：正常對照組、模型組、陽性對照組、實施例1～3組、對照例1～2組，每組各10只。在繼續(xù)給予高脂飼料和脂肪乳劑的同時，分別給予不同受試物。于給藥開始后第15天禁食16小時后，采血，測血清TC、TG、HDL-C水平。觀察指標(biāo)及檢測方法：一般情況觀察每天上午觀察記錄一次動物的一般表現(xiàn)、行為、中毒表現(xiàn)和死亡情況。根據(jù)每周測定的體重及食物攝入量，根據(jù)計算結(jié)果調(diào)整各組動物給藥量，以保證各組動物受試物需要量。針對普洱茶飲用組，根據(jù)每周測定的飲水量均值，計算每周平均給藥量。出現(xiàn)異常時，每天至少觀察兩次。對嚴(yán)重中毒的動物密切觀察記錄。生化指標(biāo)檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，全自動生化分析儀檢測。數(shù)據(jù)統(tǒng)計：各組數(shù)據(jù)均采用SPSS方差分析進行統(tǒng)計分析，方差不齊者采用數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，如轉(zhuǎn)換后仍不齊則采用非參數(shù)統(tǒng)計。提取物自由飲用及灌胃降脂作用血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測結(jié)果見下表。枸杞多糖提取物對高脂血癥動物血清總膽固醇(TC)的影響（單位mmol/L）組藥劑量給藥前第15天第30天正常組----2.58±0.682.51±0.382.26±0.25模型組----23.58±1.5123.11±1.5223.36±1.58陽性藥組20.5mg/kg/日22.20±1.5818.22±1.3214.52±1.14**實施例1組0.50g/kg/日22.12±1.2517.25±1.25*12.33±1.15*實施例2組0.50g/kg/日22.25±1.8218.25±1.6214.52±1.18*實施例3組0.50g/kg/日22.05±1.5817.17±1.25*13.15±1.02*對照例1組0.50g/kg/日22.58±1.5419.01±1.58*▲16.59±1.42*▲對照例2組0.50g/kg/日22.58±1.6121.28±1.58*15.92±1.57**與模型組比較，P<0.05，**與模型組比較，P<0.01；▲與實施例3組相比，p<0.05；對高脂血癥動物血清甘油三酯(TG)的影響（單位mmol/L）組藥劑量給藥前第15天第30天正常組----0.55±0.190.52±0.170.52±0.44模型組----0.67±0.451.15±0.571.54±0.95陽性藥組20.5mg/kg/日0.62±0.641.14±0.94*1.08±0.64**實施例1組0.50g/kg/日0.63±0.631.17±0.51*1.11±0.52*實施例2組0.50g/kg/日0.63±0.751.15±0.74*1.08±0.47*實施例3組0.50g/kg/日0.64±0.251.14±0.51*1.11±0.42*對照例1組0.50g/kg/日0.65±0.561.45±0.63*1.65±0.67*對照例2組0.50g/kg/日0.66±0.461.24±0.37*▲1.54±0.85*▲*與模型組比較，P<0.05，**與模型組比較，P<0.01；▲與實施例3組相比，p<0.05；對高脂血癥動物血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的影響（單位mmol/L）組藥劑量給藥前第15天第30天正常組----0.63±0.290.68±0.350.63±0.62模型組----3.63±0.523.22±0.755.02±1.58陽性藥組20.5mg/kg/日3.33±0.472.33±0.64*2.33±1.25**實施例1組0.50g/kg/日3.22±0.462.54±0.64*2.51±1.08*實施例2組0.50g/kg/日3.23±0.592.59±0.74*2.42±1.18*實施例3組0.50g/kg/日3.18±0.622.39±0.58*2.32±1.22*對照例1組0.50g/kg/日3.21±0.472.92±0.54*2.64±1.51*對照例2組0.50g/kg/日3.11±0.752.68±0.81*▲2.72±1.33*▲*與模型組比較，P<0.05，**與模型組比較，P<0.01；▲與實施例3組相比，p<0.05；從上表中可以看出，本發(fā)明提供的枸杞多糖提取物具有較好的降低血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的作用，實施例3相對于對照例1來說，通過石油醚萃取操作可以有效地去除雜質(zhì)，提高產(chǎn)物純度，使藥物的降膽固醇效果提高；實施例3相對于對照例2，通過采用堿性果膠酸裂解酶可以有效地促進多糖分解，提高降低甘油三酯的作用活性。當(dāng)前第1頁1 2 3