本發(fā)明涉及一種藍(lán)藻胞外多糖的制備和使用方法，屬于微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：藍(lán)藻多糖備受關(guān)注，在醫(yī)學(xué)、工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域都有一定應(yīng)用。自20世紀(jì)50年代以來,已報道有33個屬超過100種藍(lán)藻被發(fā)現(xiàn)具有分泌胞外多糖的能力,按照伯杰氏分類手冊,這些藍(lán)藻廣泛分布于5個亞屬中。目前,對其中的念珠藻屬(Nostoc)、螺旋藻屬(Spirulina)、節(jié)螺藻屬(Arthrospira)、微鞘藻屬(Microcoleus)等的多糖研究較多。藍(lán)藻胞外多糖是一種酸性雜多糖。在藍(lán)藻胞外多糖中共發(fā)現(xiàn)4大類單糖:有己糖類的葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖；有戊糖類的核糖、木糖和阿拉伯糖；脫氧己糖類的巖藻糖、鼠李糖和甲基鼠李糖；以及酸性己糖類的葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。在藍(lán)藻胞外多糖中葡萄糖是出現(xiàn)頻率最高的單糖，其次是半乳糖,鼠李糖和甘露糖，但也有一些藍(lán)藻產(chǎn)生的胞外多糖中，木糖、阿拉伯糖、半乳糖或海藻糖高于葡萄糖的含量，核糖較少。藍(lán)藻胞外多糖的性質(zhì)差異很大,多數(shù)藍(lán)藻的胞外多糖上有糖醛酸和硫酸基團(tuán)等帶電基團(tuán)的存在,硫酸基團(tuán)同時也是多糖呈抗病毒特性的基礎(chǔ),而乙?；鶊F(tuán)、縮氨酸部分及脫氧糖等疏水基團(tuán)的存在使多糖呈乳化特性。近來,出于環(huán)境保護(hù)與工業(yè)生產(chǎn)需要,研究者對新型微生物類多糖進(jìn)行了大量研究，這些研究結(jié)果顯示,利用藍(lán)藻生產(chǎn)胞外多糖具有一些優(yōu)于植物或大型藻類的特性。但截至目前,仍沒有藍(lán)藻胞外多糖類產(chǎn)品出現(xiàn),理論研究與大批量工業(yè)生產(chǎn)之間仍然有很多技術(shù)性問題亟待解決。國內(nèi)研究者考察了普通念珠藻的多糖類物質(zhì)等對蔬菜類的促生長作用。但是多糖成分比較復(fù)雜，促生長的機(jī)理和發(fā)揮作用的成分還不明確。這些實驗也僅針對普通念珠藻提取物對水稻、大豆、綠豆、小白菜、蘿卜和生菜的發(fā)芽率實驗。盛家榮等發(fā)現(xiàn)普通念珠藻的水提物可以促進(jìn)水稻、綠豆和大豆的出芽率，而其堿提物卻會對蔬菜發(fā)芽產(chǎn)生抑制作用。過量的化肥施用對我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成嚴(yán)重的威脅。發(fā)展生物肥既可以增加土壤肥力，減少化肥用量，還能進(jìn)行一定程度上達(dá)到土壤改良的目的。目前，農(nóng)業(yè)部正式登記的微生物肥料有1352種?；谒{(lán)藻胞外多糖的有機(jī)共混肥料大有可為。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種全新的藍(lán)藻胞外多糖制備方法和使用方法，為胞外多糖作為肥料用于種植蔬菜提供了依據(jù)，為藍(lán)藻多糖作為肥料實現(xiàn)工業(yè)化的生產(chǎn)開辟道路。為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種藍(lán)藻胞外多糖制備方法，所述藍(lán)藻胞外多糖制備方法至少包括：1)對固氮藍(lán)藻進(jìn)行培養(yǎng)，總干重控制在0.02-0.20g/L的起始接種濃度，接種到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度20-32℃，光循環(huán)(10-24h/14-0h)，光強(qiáng)度為50-200μmol/m2/s；2)將培養(yǎng)過的固氮藍(lán)藻液離心、過濾膜、濃縮、加入沉淀劑沉淀后棄上清得到的沉淀凍干即為固氮藍(lán)藻的胞外多糖的粗品；優(yōu)選地，所述固氮藍(lán)藻選自念珠藻藻株或魚腥藻藻株中的任意一種單一藻株。優(yōu)選地，所述固氮藍(lán)藻選自不同念珠藻藻株和不同魚腥藻藻株中的至少兩種藻株。優(yōu)選地，所述胞外多糖包括以下物質(zhì):葡萄糖30-40重量份、半乳糖30-45重量份、鼠李糖10-15重量份、阿拉伯糖10-20重量份和海藻糖0-10重量份。優(yōu)選地，所述步驟1)中的培養(yǎng)的時間為5-7天。優(yōu)選地，所述步驟2)中濾膜的孔徑為0.22μm。優(yōu)選地，所述步驟2)中濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的方法。優(yōu)選地，還包括步驟3)向胞外多糖中加入去離子水重溶、加入沉淀劑得到胞外多糖的精品。更優(yōu)選地，所述步驟3)至少重復(fù)兩次。優(yōu)選地，所述步驟2)和步驟3)中的沉淀劑為4℃預(yù)冷的等體積的丙酮，所述沉淀在4℃下進(jìn)行；或沉淀劑為乙醇，使得加入乙醇后乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)75-80％。本發(fā)明的另一個方面，提供了一種含有藍(lán)藻包外多糖的肥料，所述肥料包括藍(lán)藻胞外多糖1重量份和有機(jī)肥料500-10000重量份。優(yōu)選地，所述有機(jī)肥為動物糞便。本發(fā)明的另一個方面提供了一種含有藍(lán)藻胞外多糖的肥料用于種植蔬菜的方法。如上所述，本發(fā)明的藍(lán)藻多糖的制備和使用方法，具有以下有益效果：在降低化肥用量的前提下，可以有效提高蔬菜產(chǎn)量10％以上。具體實施方式以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。實施例1步驟1)選用念珠藻F280(購自中國科學(xué)院FACHB淡水藻種庫)，總干重為0.02g/L的起始接種濃度，將藻種庫中的藻種接種到300mLBG11培養(yǎng)基，光強(qiáng)度為88μmol/m2/s，光暗循環(huán)，光暗時間比為14h:10h，室溫下培養(yǎng)5天。步驟2)將培養(yǎng)過的固氮藍(lán)藻液離心、過0.22μm的濾膜、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、加入等 體積的4℃預(yù)冷的丙酮，4℃下沉淀并棄上清，沉淀后棄上清得到的沉淀凍干即為固氮藍(lán)藻的胞外多糖的粗品；步驟3)向胞外多糖粗品中加入去離子水重溶后，加入等體積的4℃預(yù)冷的丙酮，4℃下沉淀并棄上清，沉淀后棄上清，再重復(fù)一次，得到的沉淀凍干即為固氮藍(lán)藻的胞外多糖的純品。步驟4)配制1.0mg/mL的胞外多糖純品溶液，使用苯酚硫酸法測定胞外多糖溶液中糖濃度，計算純度；使用1M稀硫酸95℃下酸解2h，之后稀釋5倍使用HPLC分析，過HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm)分析其單糖組成。測定結(jié)果為，35.14％葡萄糖、35.14％半乳糖、12.16％鼠李糖、13.06％阿拉伯糖和4.5％海藻糖。步驟5)將上述的胞外多糖10克與動物(豬)糞便5000克混合，用于種植生菜。實施例2步驟1)選用魚腥藻B1611(購自美國德州大學(xué)UTEX藻種庫)和念珠藻F280(購自中國科學(xué)院FACHB淡水藻種庫)，其中魚腥草0.05g/L，念珠藻0.05g/L接種到BG11培養(yǎng)基，光強(qiáng)度為50μmol/m2/s，光暗循環(huán)，光暗時間比為20h:4h，室溫下培養(yǎng)5天。步驟2)將培養(yǎng)過的固氮藍(lán)藻液離心、過0.22μm的濾膜、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、加入等體積的4℃預(yù)冷的丙酮，4℃下沉淀并棄上清，沉淀后棄上清得到的沉淀凍干即為固氮藍(lán)藻的胞外多糖的粗品；步驟3)向胞外多糖粗品中加入去離子水重溶后，加入等體積的4℃預(yù)冷的丙酮，4℃下沉淀并棄上清，沉淀后棄上清得到的沉淀凍干即為固氮藍(lán)藻的胞外多糖的純品。步驟4)配制1.0mg/mL的胞外多糖純品溶液，使用苯酚硫酸法測定胞外多糖溶液中糖濃度，計算純度；使用1M稀硫酸95℃下酸解2h，之后稀釋5倍使用HPLC分析，過HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm)分析其單糖組成。測定定結(jié)果為，36.72％葡萄糖、45％半乳糖、10.94％鼠李糖和7.34％阿拉伯糖。步驟5)將上述的胞外多糖5克與動物(牛)糞便10千克混合，用于種植白菜。實施例3步驟1)選用念珠藻F280和魚腥藻F243(都購自中國科學(xué)院FACHB淡水藻種庫)，其中總干重為0.2g/L，接種到300mLBG11培養(yǎng)基，光強(qiáng)度為200μmol/m2/s，光暗循環(huán)，光暗時間比為12h:12h，室溫下培養(yǎng)7天。步驟2)將培養(yǎng)過的固氮藍(lán)藻液離心、過0.22μm的濾膜、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、加入無水乙醇至最終體積分?jǐn)?shù)80％，沉淀并棄上清，沉淀后棄上清得到的沉淀凍干即為固氮藍(lán)藻的 胞外多糖的粗品；步驟3)向胞外多糖粗品中加入去離子水重溶后，加入等體積的4℃預(yù)冷的丙酮，4℃下沉淀并棄上清，沉淀后棄上清，再重復(fù)兩次，得到的沉淀凍干即為固氮藍(lán)藻的胞外多糖的純品。步驟4)配制1.0mg/mL的胞外多糖純品溶液，使用苯酚硫酸法測定胞外多糖溶液中糖濃度，計算純度；使用1M稀硫酸95℃下酸解2h，之后稀釋5倍使用HPLC分析，過HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm)分析其單糖組成。測定結(jié)果為，34.70％葡萄糖、36.53％半乳糖、13.53％鼠李糖、13.20％阿拉伯糖和2.04％海藻糖。步驟5)將上述的胞外多糖1克與動物(雞)糞便10千克混合，用于種植黃瓜。實施例4步驟1)選用魚腥藻B1611(購自美國德州大學(xué)UTEX藻種庫)，念珠藻F280和魚腥藻F243(都購自中國科學(xué)院FACHB淡水藻種庫)，總干重為0.10g/L，將藻種庫中的藻種涂布于BG11無氮瓊脂平板，光強(qiáng)度為88μmol/m2/s，光暗循環(huán)，光暗時間比為24h:0h，32℃下培養(yǎng)7天。步驟2)將培養(yǎng)過的固氮藍(lán)藻液離心、過0.22μm的濾膜、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、加入無水乙醇至最終乙醇體積分?jǐn)?shù)75％，沉淀并棄上清，沉淀后棄上清得到的沉淀凍干即為固氮藍(lán)藻的胞外多糖的粗品；步驟3)向胞外多糖粗品中加入去離子水重溶后，加入等體積的4℃預(yù)冷的丙酮，4℃下沉淀并棄上清，沉淀后棄上清得到的沉淀凍干即為固氮藍(lán)藻的胞外多糖的純品。步驟4)配制1.0mg/mL的胞外多糖純品溶液，使用苯酚硫酸法測定胞外多糖溶液中糖濃度，計算純度；使用1M稀硫酸95℃下酸解2h，之后稀釋5倍使用HPLC分析，過HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm)分析其單糖組成。測定定結(jié)果為，30.75％葡萄糖、39.38％半乳糖、11.87％鼠李糖、17.0％阿拉伯糖和1.0％海藻糖。步驟5)將上述的胞外多糖10克與動物(鴨)糞便10千克混合，用于種植西紅柿。效果實施例分別將上述4個實施例中制備的固氮藍(lán)藻的胞外多糖與有機(jī)肥料混合，混合后的肥料用于生菜，同時設(shè)定對照組(除了采用的有機(jī)肥料不含有胞外多糖外，其他栽培防范與實施例組相同)的生菜的，測定肥料的使用量和每畝生菜的產(chǎn)量。實施例1實施例2實施例3實施例4每畝生菜產(chǎn)量(Kg)1206426736554370對照組產(chǎn)量1089386132603890從上述實施例可以看出，由于在有機(jī)肥料中添加了胞外多糖，每畝生菜的產(chǎn)量明顯提高。從而說明胞外多糖在用于種植素菜具有很大的優(yōu)勢，值得進(jìn)一步的研究和投入生產(chǎn)。以上的實施例是為了說明本發(fā)明公開的實施方案，并不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實施例對本發(fā)明進(jìn)行了具體的描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說顯而易見的修改來獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3