藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域的克隆與表達(dá)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域的克隆與表達(dá)。
技術(shù)背景
[0002]藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，PC)是鈍頂螺旋藻含有的多種生物活性成分之一。它普遍存在于藍(lán)藻細(xì)胞中，是一種特殊的捕光色素蛋白，具有抗疲勞、抗輻射、抗病毒、抑制腫瘤、抗過(guò)敏、增強(qiáng)免疫力、清除自由基等多種活性功能。藻藍(lán)蛋白由α亞基和β亞基組成。α亞基由162個(gè)氨基酸殘基組成。β亞基由172個(gè)氨基酸殘基組成。研究發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)蛋白尤其是藻藍(lán)蛋白β亞基具有抗炎和抗腫瘤活性。同等摩爾濃度下，藻藍(lán)蛋白β亞基較藻藍(lán)蛋白和藻藍(lán)蛋白α亞基具有更好的抗腫瘤活性。藻藍(lán)蛋白β亞基由六段α螺旋組成，本發(fā)明將含有藻藍(lán)蛋白β亞基靠近C端的兩段α螺旋結(jié)構(gòu)域的基因片段用大腸桿菌克隆和表達(dá)，為研究該結(jié)構(gòu)域功能奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所述的藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域的融合蛋白是通過(guò)重組質(zhì)粒構(gòu)建后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)，純化所得蛋白而得。其制備方法如下:
[0004]從本實(shí)驗(yàn)室保存的含有藻藍(lán)蛋白全部β亞基和部分α亞基基因的重組質(zhì)粒，PCR法擴(kuò)增出β亞基C端結(jié)構(gòu)域的基因片段，用內(nèi)切酶BamH I,HindII 137°C雙酶切β亞基C端結(jié)構(gòu)域的基因片段和pET-32a質(zhì)粒1.5h，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的產(chǎn)物再16°C連接16h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中。工程菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)到細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG，20 °C誘導(dǎo)表達(dá)1h。誘導(dǎo)結(jié)束后，高速冷凍離心機(jī)于8000rpm，15min離心收集菌體，按照每收集Ig菌體加入40ml緩沖液的比例，用緩沖液重懸菌體。60 %功率超聲破碎，并在破碎前加入終濃度為100yg/mL的PMSF以減少蛋白酶的降解作用。12000rpm，30min收集破碎后的上清液。用鎳親和層析柱分離純化得到藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
【附圖說(shuō)明】
[0005]圖1為PCR擴(kuò)增出的藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域的基因序列。M:DNAMarker;l:藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域基因O
[0006]圖2為菌液PCR擴(kuò)增出的藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域的基因序列。M:DNAMarker； I:操監(jiān)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域基因。
[0007]圖3為提取的重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證。M:DNAMarker; 1:雙酶切得到的藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域基因。
[0008]圖4為融合蛋白鎳親和層析柱純化結(jié)果。M:蛋白marker;1:誘導(dǎo)前菌體;2:誘導(dǎo)后菌體;3:菌體超聲破碎離心后上清;4:菌體超聲破碎離心后沉淀;5:透析后融合蛋白鎳親和層析柱純化效果;6:透析前融合蛋白鎳親和層析柱純化效果。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面結(jié)合一些實(shí)例并參照?qǐng)D表數(shù)據(jù)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0010]實(shí)施例1
[0011]含藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0012]選擇藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的基因序列克隆，序列長(zhǎng)度為153bp。在目的基因的上下游引物中分別加入BamH 1、HindIII酶切位點(diǎn)。用本實(shí)驗(yàn)室保存的含藻藍(lán)蛋白全部β亞基和部分α亞基基因的重組質(zhì)粒pMD18-T-PC作為模板，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增β亞基C端結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)基因ICR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，如圖1，切下含有目的DNA的凝膠，按照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的DNA片段。目的基因片段與pET-32a質(zhì)粒載體同時(shí)雙酶切，取雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，切下含有目的DNA的凝膠，按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的片段。將目的基因片段與雙酶切后的原核表達(dá)載體pET-32a在16°C、16h條件下連接。
[0013]實(shí)施例2
[0014]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21中
[0015]取連接產(chǎn)物10μ1加入到50μ1已制備好的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻后冰浴30min; 42°C水浴中熱激90s后，迅速再次冰浴3min ；加入500μ1 LB液體培養(yǎng)基并充分混勻，37°C、220rpm振搖培養(yǎng)Ih;離心棄上清留取約ΙΟΟμΙ轉(zhuǎn)化菌液，涂布于含氨芐青霉素(Amp+，100yg/mL)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12-16h。挑取轉(zhuǎn)化成功的單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證(圖2)、提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證(圖3)，并測(cè)序。
[0016]實(shí)施例3
[0017]工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)
[0018]將保存的菌種在平板上劃線培養(yǎng)，37°C，12h。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素(Amp+，100yg/mL)的LB培養(yǎng)基的小試管中，37°C，220rpm，12h搖至菌液飽和。將飽和菌液按照1: 100的比例轉(zhuǎn)接到含LB培養(yǎng)基的大錐形瓶中，37 °C，220rpm搖至0D600nm值在0.6?0.8之間。加入終濃度為0.4臟01凡的1?16，20°(^誘導(dǎo)表達(dá)1011。8000印1]1，15111；[11離心收集菌體。
[0019]實(shí)施例4
[0020]融合蛋白的純化
[0021]收集的菌體用緩沖液重懸，加入終濃度為100yg/mL的PMSF，按超聲時(shí)間3s間隙時(shí)間5s、超聲功率60 %的程序超聲，至重懸菌液由乳白色到清澈為止，期間用冰水混合物冰浴。超聲結(jié)束后，用高速冷凍離心機(jī)于4<€、12000印111離心3()1]1；[11收集上清。鎳離子親和層析柱純化蛋白:用結(jié)合緩沖液平衡柱子，待緩沖液流盡時(shí)，加入已經(jīng)過(guò)0.45μπι微孔濾膜過(guò)濾后的超聲破碎后的上清液，待上清液即將流盡，再用結(jié)合緩沖液洗去未結(jié)合的雜蛋白。最后用含有150mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫液并濃縮處理，用0.22μπι無(wú)菌濾器過(guò)濾后加入終濃度為10%的無(wú)菌甘油，-80°C保存。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域基因在質(zhì)粒載體上的克隆，其特征在于:質(zhì)粒載體為pET-32a，酶切位點(diǎn)為BamH KHindIII。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21中以表達(dá)融合蛋白。3.—種權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于:PCR法擴(kuò)增出藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域基因，將擴(kuò)增出的基因片段和質(zhì)粒載體pET-32a同時(shí)用BamH I ,Hindi 11內(nèi)切酶于37°C雙酶切1.5h，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的產(chǎn)物，16°C連接16h。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述，一種構(gòu)建的工程菌表達(dá)的融合蛋白，其特征在于:融合蛋白用鎳親和層析柱純化后，達(dá)電泳純。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域基因的克隆表達(dá)。通過(guò)基因工程手段將藻藍(lán)蛋白β亞基C端結(jié)構(gòu)域基因克隆于pET-32a質(zhì)粒載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21中。構(gòu)建的工程菌的表達(dá)產(chǎn)物用鎳親和層析柱純化后，達(dá)電泳純。
【IPC分類(lèi)】C12N15/70, C07K19/00, C12N15/66, C07K14/795
【公開(kāi)號(hào)】CN105647951
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】歐瑜, 張子驥
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年2月22日