本發(fā)明涉及基因工程及遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，涉及馬藺耐鹽相關(guān)液泡膜H⁺-PPsae基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前我國土壤鹽漬化日益嚴(yán)重，已經(jīng)嚴(yán)重影響到農(nóng)作物的生產(chǎn)，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力下降，增強(qiáng)植物耐鹽性或改良土壤鹽堿化已成為現(xiàn)階段面臨的主要問題。馬藺(Iris lactea Pall.var.chinensis(Fisch.)Koidz.)是鳶尾科鳶尾屬多年草本植物，主要分布于我國東北、西北、華北等地區(qū)的低地鹽堿化草甸、荒漠草原草地、山坡荒野等，具有極強(qiáng)的抗旱耐鹽性，并已成為退化鹽化低地草甸的指示植物之一，因其葉色青綠，綠期長，花色淡雅美麗，管理粗放，已經(jīng)成為城市園林景觀配置和郊野公園綠地建設(shè)的優(yōu)良地被植物。

大量研究表明，造成植物的生理干旱的原因是土壤中鈉離子濃度過高，破壞了細(xì)胞的離子平衡，細(xì)胞膜的功能和代謝活動都將受到抑制，嚴(yán)重的可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而Na⁺外排和區(qū)域化是植物細(xì)胞抵御Na⁺毒害的主要策略。細(xì)胞質(zhì)中過多Na⁺將區(qū)域化到液泡中，H⁺-ATPase和H⁺-PPase共同構(gòu)成的液泡膜質(zhì)子泵能形成H⁺跨膜電化學(xué)梯度，為液泡膜Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能的實現(xiàn)提供驅(qū)動力，降低Na⁺對細(xì)胞質(zhì)中代謝酶的損害，維持細(xì)胞膨壓，最終提高植物的抗旱耐鹽能力。與液泡膜H⁺-ATPase相比，H⁺-PPase僅由單基因編碼，且在建立跨膜電化學(xué)勢梯度上的作用與H⁺-ATPase相當(dāng)，甚至貢獻(xiàn)更大，因此對H⁺-PPase的研究更具現(xiàn)實意義。據(jù)報道，已從擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大麥(Hordeum vulgare)、甜菜(Beta valgaris)、水稻(Oryza sativa)、梭梭(Haloxylon ammodendron)等諸多植物中克隆得到H⁺-PPsae基因。H⁺-PPase的活性通常被高濃度的Na⁺抑制，而低濃度的Na⁺反而會提高其轉(zhuǎn)錄水平。植物種類、器官類型、發(fā)育狀態(tài)以及鹽溶液中的Na⁺濃度影響著植物液泡膜H⁺-PPase活性或轉(zhuǎn)錄水平的變化。在對胡蘿卜(Daucus carota)、向日葵(Helianthus annuus)、大麥等植物H⁺-PPase對鹽脅迫響應(yīng)的研究表明，在不同NaCl處理條件下，H⁺-PPase活性均比對照高，表明NaCl可誘導(dǎo)H⁺-PPase活性上升。而大麥經(jīng)200mM NaCl處理后，根部H⁺-PPase活性比對照降低一倍。此外，NaCl對H⁺-PPase的抑制作用可被外源Ca²⁺緩解，降低細(xì)胞內(nèi)Na⁺、Cl^-含量和K⁺外滲，抑制Na⁺吸收是Ca²⁺緩解鹽害的作用機(jī)理之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供馬藺耐鹽相關(guān)液泡膜H⁺-PPsae基因及其編碼蛋白。

本發(fā)明的另一目的是提供馬藺耐鹽相關(guān)液泡膜H⁺-PPsae基因的應(yīng)用，該基因可用于農(nóng)作物和優(yōu)良牧草的耐鹽抗旱遺傳改良。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的馬藺耐鹽相關(guān)液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP，所述基因IlVP的cDNA序列為：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或

iii)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴(yán)格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

所述馬藺耐鹽相關(guān)液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發(fā)明還提供含有所述基因IlVP的表達(dá)盒。

本發(fā)明還提供含有所述基因IlVP或所述表達(dá)盒的載體。

本發(fā)明還提供含有所述基因IlVP、所述表達(dá)盒或所述載體的工程菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

攜帶有所述目的基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463頁；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

本發(fā)明還提供所述基因IlVP在提高植物(例如煙草、擬南芥等)耐鹽性中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含有所述基因IlVP的載體轉(zhuǎn)入煙草中，轉(zhuǎn)化后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選過表達(dá)基因IlVP的轉(zhuǎn)基因煙草。優(yōu)選地，所用出發(fā)載體為植物表達(dá)載體pBI121。

本發(fā)明還提供所述基因IlVP在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述基因IlVP在植物抗逆遺傳改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明首次從耐鹽性較強(qiáng)的馬藺中克隆獲得耐鹽相關(guān)液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP，并將該基因?qū)霟煵荩篃煵莸哪望}性得到明顯提高。本發(fā)明的耐鹽基因IlVP為農(nóng)作物和優(yōu)良牧草的耐鹽遺傳改良和新品種選育提供重要的科學(xué)理論依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中馬藺耐鹽相關(guān)基因IlVP的cDNA克隆結(jié)果。以馬藺cDNA為模板，PCR擴(kuò)增核心區(qū)、3’端、5’端、ORF片段。M1：DL2000；1：核心片段；2:3’端片段；3:5’端片段；4-5：ORF片段。

圖2為本發(fā)明實施例1中馬藺IlVP基因cDNA核酸序列及其推測的氨基酸序列。左側(cè)的數(shù)字分別代表核苷酸和氨基酸的位點(diǎn)，陰影處為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)以及三個保守片段。

圖3為本發(fā)明實施例1中馬藺基因IlVP編碼蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。

圖4為本發(fā)明實施例1中馬藺基因IlVP與海棗PdVP、水稻OsVP及擬南芥AtVP氨基酸的多重比對結(jié)果。

圖5為本發(fā)明實施例2中鹽脅迫下馬藺基因IlVP表達(dá)模式的分析結(jié)果。(a)：Real time PCR分析200mM NaCl處理馬藺幼苗24h基因IlVP在地上部和根中的表達(dá)模式；(b):在0，25，50，100，200mM NaCl分別處理0、6、12、24和48h后對幼苗地上部IlVP基因表達(dá)水平的影響。圖中每個點(diǎn)均代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n＝3)，Actin為內(nèi)參。

圖6為本發(fā)明實施例3中植物表達(dá)載體pBI121-IlVP的質(zhì)粒圖譜。

圖7為本發(fā)明實施例3中轉(zhuǎn)IlVP基因煙草的制備及鑒定。a：葉盤預(yù)培養(yǎng)；b：葉片邊緣膨大；c：愈傷組織分化；d：抗性芽培養(yǎng)；e：抗性苗生長；f：抗性植株。

圖8為本發(fā)明實施例3中轉(zhuǎn)IlVP基因陽性煙草植株的鑒定結(jié)果。A：轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA PCR檢測；B：轉(zhuǎn)基因煙草植株Southern Blot雜交鑒定；C：轉(zhuǎn)基因煙草植株Northern Blot雜交鑒定。

圖9為本發(fā)明實施例3中轉(zhuǎn)IlVP基因煙草耐鹽性鑒定結(jié)果。A：鹽脅迫7d后對野生型與轉(zhuǎn)基因煙草生長情況的影響(WT：野生型煙草，T：轉(zhuǎn)基因煙草)；B：鹽脅迫7d后對野生型與轉(zhuǎn)基因煙草生長狀況及根、莖、葉中Na⁺(a)、K⁺(b)、Ca²⁺(c)變化的影響；C：NaCl脅迫處理7d對野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株根、莖、葉的鮮重(a)和干重(b)的影響；D：NaCl脅迫處理7d對野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片相對含水量的影響；E：NaCl脅迫處理7d對野生型和轉(zhuǎn)基因煙草相對質(zhì)膜透性的影響。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1 馬藺耐鹽相關(guān)液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP克隆與鑒定

根據(jù)已知植物的液泡膜H+-PPsae基因VP的高度保守區(qū)設(shè)計一對簡并引物，用Takara RNA提取試劑盒(Takara MiniBEST Plant RNA Extraction Kit)提取馬藺根總RNA，以總RNA為模板用PrimeScript TM RT reagent kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到馬藺VP基因核心片段為893bp；再以馬藺VP基因核心序列為基礎(chǔ)，分別設(shè)計5’和3’EACE引物，利用5’RACE試劑盒(SMARTer RACE 5’/3’Kit User Manual)和3’RACE試劑盒(TAKARA3’-Full RACE Core Set with PrimeScript^TMRTase)獲得5’和3’片段長度分別為881bp和1117bp。最后將以上3個片段拼接得到SEQ ID NO:1所示的IlVP基因的全長cDNA序列，大小為2738bp，包含2316bp的開放閱讀框(ORF)，103bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)和319bp的3’-UTR(圖1)，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列中含有GGG、DVGADLVGK和KAADVGADLVGKVE三個高度保守片段，是液泡膜H⁺-PPase的PPI結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。

馬藺基因IlVP編碼蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)見圖3。馬藺基因IlVP與海棗PdVP、水稻OsVP及擬南芥AtVP氨基酸的多重比對結(jié)果見圖4。

引物序列如下：

①擴(kuò)增基因IlVP cDNA序列核心片段的簡并引物：

P1：5’-TATGGTGATGAYTGGGAAGG-3’

P2：5’-GCAATRCCWCCAGCATTRTCA-3’

②用于5’RACE試劑盒的，擴(kuò)增基因IlVP cDNA序列5’端的引物：

UPM：

Long(0.4μM)：

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'

Short(2μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'

P3：5′-GTCAGCAATCACAGCTGGGTTTCTA-3′

NUP：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

P4：5′-CAACATCAGCAGCTTTAGTGTAGATA-3′

③用于RACE試劑盒的，擴(kuò)增基因IlVP cDNA序列3’端的引物：

P5：5′-GCTGATGTTGGTGCTGATCTTGT-3′

3’O：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’

P6：5′-TATGGCCCCATCAGTGACAATGCT-3′

3’I：5’-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’

④用于擴(kuò)增基因IlVP cDNA全長的引物：

P7:5′-TCCCCCGGGATGGTGGCGGCGATGCT-3′(下劃線為Sma I酶切位點(diǎn))

P8:5′-CGAGCTCTTAGAAGATCTTGAAGAGGATGCC-3′(下劃線為Sac I酶切位點(diǎn))

實施例2 馬藺耐鹽相關(guān)液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP在鹽脅迫下的表達(dá)分析

6周齡的馬藺幼苗用200mM NaCl處理24h，分別取根和葉各200mg提取RNA，分析IlVP在組織中特異性的表達(dá)，并進(jìn)一步分析不同濃度(0、25、50、100及200mM)NaCl處理0、6、12、24和48h后對其IlVP基因表達(dá)模式的影響。以馬藺IlActin為內(nèi)參，設(shè)計兩對基因表達(dá)引物：

Actin-F：5′-TATTGTGCTGGATTCTGGTGATG-3′

Actin-R：5′-GGAGGATAGCATGGGGAAGAG-3′

VP-F：5′-CGAACTGACTGCTATGATGTACCC-3′

VP-R：5′-CCAACTAACAACCGCAATACCA-3′

利用 Premix Eix Taq^TM(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行Real Time PCR，其反應(yīng)體系：cDNA 1,Primers 1.6μL,ROX Reference Dye 0.4μL, PremixEix Taq 10μL,dH₂O 7μL。結(jié)果顯示，馬藺地上部IlVP表達(dá)受NaCl鹽處理的誘導(dǎo)，且隨著NaCl鹽濃度及處理的時間增加地上部IlVP轉(zhuǎn)錄豐度顯著上調(diào)，這有利于將其地上部細(xì)胞質(zhì)中的Na⁺及時有效地區(qū)域化在液泡中，從而減輕鹽對植物的傷害(圖5)。

實施例3 馬藺耐鹽相關(guān)液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP增強(qiáng)煙草的耐鹽性

1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將含有馬藺IlVP基因ORF框的質(zhì)粒經(jīng)Sma I與Sca I雙酶切后，用1.2％凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，膠回收載體小片段，命名為IlVP-A。用Sma I與Sca I對植物真核表達(dá)載體pBI121進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，得到pBI121線性載體，將pBI121線性載體進(jìn)行膠回收大片段，命名為pBI121-B。將片段pBI121-B與IlVP-A參照DNA Ligation試劑盒說明書(Takara)進(jìn)行連接，構(gòu)建得到植物表達(dá)載體pBI121-IlVP(圖6)。將pBI121-IlVP轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli DH5α中，篩選陽性克隆，進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物使用Sac I和Sma I進(jìn)行雙酶切檢測，結(jié)果得到2316bp大小的特異條帶，說明成功構(gòu)建馬藺IlVP基因植物表達(dá)載體。

2、轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及陽性鑒定

1)轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

用凍融法將構(gòu)建的植物表達(dá)載體pBI121-IlVP導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，挑取陽性菌落搖菌后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)雙酶切鑒定得到與預(yù)期一致的兩條帶，說明植物表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。將煙草W38葉盤接種于MS分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)至邊緣膨大，置于農(nóng)桿菌液中侵染后共培養(yǎng)2～3d，接種于MS篩選分化培養(yǎng)基(MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+50mg/L Kan+500mg/L Carb)中培養(yǎng)。待分化出的抗性苗長至1～3cm時，即可移入MS培養(yǎng)基(MS+50mg/L Kan+500mg/L Carb)中培養(yǎng)。當(dāng)生長空間不足時，并將陽性植株移入裝有珍珠巖和蛭石(1:3)的花盆中繼續(xù)培養(yǎng)(圖7)。

2)轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株的鑒定

以野生型煙草為陰性對照，YCF1/YCR1為引物，以轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，按照Tks Gflex^TM DNA Polymerase試劑盒說明進(jìn)行PCR檢測，鑒定轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株(圖8A)。

引物序列如下：

YCF1:5′-CATTGCTGGGATGGGTTC-3′

YCR1:5′-TCGTGGCTGCTCCTGTTC-3′

進(jìn)一步通過Southern Blot(圖8B)和Northern Blot(圖8C)檢測鑒定轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株。隨機(jī)選擇4株轉(zhuǎn)基因煙草植株，以葉片為材料提取DNA，根據(jù)PCR法DIG標(biāo)記試劑盒制備Southern Blot探針，用Dra I酶切30μg DNA樣品，純化后加樣至1％瓊脂糖凝膠中，于20V電壓電泳過夜。利用向上毛細(xì)管法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，預(yù)雜交2h后加入變性探針雜交過夜，洗膜顯色后的結(jié)果顯示馬藺IlVP基因已成功整合到煙草植株中。

隨機(jī)選擇8株轉(zhuǎn)基因煙草植株，以葉片為材料提取RNA，根據(jù)Northern Blot DIG-PCR擴(kuò)增標(biāo)記探針，在1.1％的瓊脂糖甲醛變性膠上以50V電泳3h。利用向上毛細(xì)管法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，預(yù)雜交2h后加入變性探針雜交過夜。使用DIGD-210地高辛雜交檢測試劑盒II進(jìn)行洗膜及信號檢測，顯色后的結(jié)果說明IlVP基因在煙草18號材料中表達(dá)豐度最高，在3號材料中表達(dá)豐度最低。

3、轉(zhuǎn)IlVP基因煙草耐鹽性鑒定

1)鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草形態(tài)變化

分別用0mM和200mM的NaCl對轉(zhuǎn)基因煙草植株和野生型植株處理7d后，觀察其生長狀況。正常條件下(0mM NaCl)野生型和轉(zhuǎn)基因植株在生長形態(tài)上沒有明顯差異，但在200mM NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株生長基本正常，只有靠近根部的老葉片有發(fā)黃的現(xiàn)象，而野生型植株生長則受到抑制，長勢變緩，葉片枯黃萎蔫嚴(yán)重。說明轉(zhuǎn)基因型煙草具有較強(qiáng)的耐鹽性(圖9A)。

2)鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)測定

將長勢一致的野生型煙草、轉(zhuǎn)基因煙草株系3和株系18分別使用含0、50、100、200mM NaCl的Hoagland營養(yǎng)液澆灌，6次重復(fù)，每重復(fù)3株，7天后分別測定根、莖、葉的鮮重和干重，葉片相對含水量、相對電導(dǎo)率、Na⁺、K⁺、Ca²⁺含量。每個處理稱取煙草植株根、莖、葉鮮重，80℃下烘干，每12h稱重一次，直到重量恒定，稱其干重。按照高俊鳳的方法測定葉片的相對含水量及質(zhì)膜透性(相對電導(dǎo)率)。使用火焰分光光度計分別測定其根、莖、葉中的Na⁺、K⁺、Ca²⁺含量。測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株對NaCl脅迫具有較強(qiáng)的耐受性，說明過量表達(dá)馬藺IlVP提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性(圖9B-圖9E)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

參考文獻(xiàn)

SPAC水分熱力學(xué)函數(shù)及幼苗各葉位水分狀況,高俊鳳等，《西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》，1989(01):34-38