本發(fā)明涉及一種液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因及其應(yīng)用，具體涉及一種從剛毛檉柳中獲得的能提高植物抗旱耐鹽能力的液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因及其在培育抗旱耐鹽植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶(H⁺-pyrophosphatase，H⁺-PPase，EC3.6.1.1)是一種區(qū)別于H⁺-ATPase的H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)酶，廣泛存在于植物和少數(shù)藻類、原生動(dòng)物、細(xì)菌以及原始細(xì)菌中。液泡膜H⁺-PPase具有保存生物能，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的pH，促進(jìn)植物生長(zhǎng)并提高植物抗逆性的功能。高等植物中存在2種類型的液泡膜H⁺-PPase：I型和II型。I型依賴K⁺激活而適度被Ca²⁺激活，II型對(duì)K⁺不敏感而對(duì)Ca²⁺極其敏感。這2種類型的H⁺-PPase在氨基酸序列相似性僅有37％～39％，在細(xì)胞中參與不同的生理過(guò)程。迄今為止，已從許多植物中克隆到液泡膜H⁺-PPase基因，然而這些基因大多數(shù)都來(lái)自草本植物或農(nóng)作物上。

剛毛檉柳(T.hispida)是一種抗逆能力優(yōu)良的木本鹽生植物，是檉柳屬(Tamarix L.)植物中最耐逆境脅迫的物種之一，生態(tài)適應(yīng)性很強(qiáng)，在新疆分布范圍廣，具有耐干旱、抗鹽堿、耐貧瘠、耐風(fēng)蝕、沙埋等優(yōu)良性狀，是研究耐鹽機(jī)理和進(jìn)行耐鹽基因克隆的理想材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從抗逆性能力優(yōu)良的剛毛檉柳中克隆獲得一個(gè)能響應(yīng)非生物脅迫的剛毛檉柳(T.hispida)液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因及其應(yīng)用，命名為ThVP2，ThVP2基因cDNA全長(zhǎng)2295bp，基因序列如序列表Seq ID No：1所示。

本發(fā)明的一種剛毛檉柳液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因編碼的蛋白，該ThVP2基因的編碼區(qū)序列編碼764個(gè)氨基酸，氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

本發(fā)明的一種剛毛檉柳液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因的應(yīng)用，該基因用于培育抗鹽耐旱轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明包含以下有益效果：

本發(fā)明通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，研究ThVP2基因在響應(yīng)干旱及鹽的表達(dá)模式，結(jié)果表明ThVP2基因在植物響應(yīng)脅迫過(guò)程中起著重要的作用。將ThVP2基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pROK2，通過(guò)蘸花法轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥長(zhǎng) 勢(shì)基本一致；但在高鹽和干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯強(qiáng)于野生型擬南芥。在NaCl和Mannitol的脅迫下，擬南芥的根長(zhǎng)逐漸變短，而過(guò)表達(dá)株系在脅迫條件下的根長(zhǎng)顯著高于野生型擬南芥的根長(zhǎng)，以上結(jié)果說(shuō)明剛毛檉柳液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因具有明顯的抗鹽耐旱的能力，是用于林木基因工程育種的優(yōu)良基因。

雖然以上僅以擬南芥為例驗(yàn)證了剛毛檉柳ThVP2基因的功能及其用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的效果,但通過(guò)常規(guī)的轉(zhuǎn)基因手段將其轉(zhuǎn)入其他植物例如煙草,尤其是林木,例如楊樹(shù)和白樺等,同樣可以獲得類似的效果。

附圖說(shuō)明

圖1為ThVP2基因的核苷酸和氨基酸序列，*表示：終止密碼子；

圖2為ThVP2基因在NaCl脅迫不同時(shí)間的表達(dá)模式圖；其中，A為用0.4mol/L的NaCl脅迫地下部分的表達(dá)量；B為用0.4mol/L的NaCl脅迫地上部分的表達(dá)量；

圖3為ThVP2基因在PEG脅迫不同時(shí)間的表達(dá)模式圖；其中，A為用20％PEG脅迫地下部分的表達(dá)量；B為用用20％PEG脅迫地上部分的表達(dá)量；

圖4為ThVP2轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè)結(jié)果圖；

圖5為1/2MS條件下轉(zhuǎn)ThVP2基因和野生型擬南芥根長(zhǎng)比較圖；

圖6為干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)ThVP2基因和野生型擬南芥根長(zhǎng)比較圖；

圖7為鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)ThVP2基因和野生型擬南芥根長(zhǎng)比較圖；

圖8為脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥根長(zhǎng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖；其中，A為Col-0的根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)；B為OE1的根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)，C為OE2的根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種剛毛檉柳液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因，它的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式的一種剛毛檉柳液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因編碼的蛋白，該ThVP2基因的編碼區(qū)序列編碼764個(gè)氨基酸，氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式的一種剛毛檉柳液泡膜H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因的應(yīng)用，該基因用于培育抗鹽耐旱轉(zhuǎn)基因植物。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三不同的是：所述的植物為林木。其它與具體實(shí)施方式三相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三不同的是：所述的林木為楊樹(shù)或白樺。 其它與具體實(shí)施方式三相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三不同的是：所述的植物為擬南芥或煙草。其它與具體實(shí)施方式三相同。

本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)具體實(shí)施方式的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。

通過(guò)以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：

實(shí)施例1

剛毛檉柳液泡膜ThVP2基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆與序列分析

1、剛毛檉柳ThVP2基因的克隆

本實(shí)施方式從抗旱耐鹽能力非常優(yōu)良的檉柳中獲得1條液泡膜H⁺-PPase基因(ThVP2)的序列。以剛毛檉柳cDNA為模板對(duì)ThVP2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的條帶經(jīng)膠回收純化后連接到pMD18-T載體上進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的ThVP2序列進(jìn)行比對(duì)。保存陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，記為pMD18-ThVP2經(jīng)分析，最終獲得ThVP2基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列如下：

>ThVP2

ATGATTTCGGATCTAGTGACGGAGATTGTAATTCCGGTGTGTGCGGTGATCGGAATCGCATTTTCGTTAGTACAATGGGTGTTGGTTTCGAAGGTGAGGATGACTCCAGGGAGGGAAATGAAGAATGGGTCAAATGTAAATAAAAATGGTGGGTTTAATGATTACCTTATCGAAGAAGAAGATGGTGTTGATGGCCAAAATGTTGTTATTAAATGCGCTGAAATTCAAAACGCCATTTCTGAAGGTGCCACATCCTTTCTATTCACCGAATACCAGTATGTCGGTGTCTTCATGATTGCATTTGCAGTTCTGATCTTCCTCTTCCTGGGATCAGTCGAAGGCTTCAGCACCAGCAGCCAATCGTGCACATATGATCGTCAGAGGATGTGCAAGCCTGCTTTAGCAACAGCTGTCTTTAGCACCGTATCCTTCTTGCTTGGTGCTTTGACTTCTGTTGTCTCTGGTTTCTTGGGGATGAAGATTGCTACCTTTGCAAATGCAAGGACCACATTGGAAGCTAGAAAAGGTGTTGGGAGGGCTTTTAGTATCGCATTCAGATCTGGTGCCGTGATGGGTTTCCTCCTTGCTGCAAACGGTCTGTTGGTGCTCTACATTACTATCAATGTCTTCAAGCTGTACTATGGTGATGATTGGGAAGGATTGTTTGAGGCAATAACTGGTTATGGTCTTGGTGGCTCTTCAATGGCTCTTTTCGGGAGAGTTGGTGGAGGCATTTACACCAAAGCTGCTGATGTAGGCGCTGATCTTGTGGGGAAAGTTGAAAGGAACATTCCAGAAGACGACCCAAGAAACCCAGCTGTGATTGCTGACAATGTTGGTGATAATGTTGGAGATATAGCCGGGATGGGTTCTGATCTCTTTGGCTCGTATGCTGAATCATCGTGTGCAGCATTAGTTGTTGCCTCCATCTCTTCTTTTGGCGTCAACCATGAGTTCACTGCAATGTGCTATCCTCTCCTTATCAGTTCCATGGGTATTCTTGTCTGCTTGATGACCACTCTTTGTGCTACTGATTTCTTTGAGATCAAAA CTGTCAAGGAAATTGAGCCTGCATTGAAGAACCAGCTGATTATCTCAACCGTTCTTATGACACTGGGAATAGCTGTAATAAGTTGGATTGCTCTTCCATCTTCCTTCACAATCTTCAACTTTGGTGCTCAGAAAGTTGTCAAAAATTGGCAATTATTCTTGTGTGTGGGTGTTGGCCTTTGGGCTGGACTTATCATTGGGTTTGTGACCGAATACTACACCAGCAATGCATACAGTCCGGTGCAAGATGTTGCTGACTCATGCAGGACAGGAGCTGCCACAAATGTTATCTTTGGCCTGGCATTGGGCTATAAGTCTGTAATTATTCCTATTTTTGCTATAGCTGTGAGCATCTTTGTTAGTTTCAGCTTTGCTGCAATGTATGGAATTGCGATGGCTGCTCTTGGCATGTTGAGCACCATTGCTACTGGTTTGGCGATTGATGCTTATGGACCCATCAGTGATAACGCTGGAGGTATAGCTGAGATGGCTGGTATGAGCCACAGGATCCGTGAGAGGACTGATGCCCTAGATGCTGCTGGGAACACGACTGCTGCCATCGGAAAGGGTTTTGCCATAGGATCTGCAGCTTTGGTGTCACTGGCCCTATTCGGTGCCTTTGTGAGCCGGGCAGCAATTTCAACTGTTGATGTCTTGACTCCCAAAGTGTTTGTTGGTCTAATCGTTGGTGCAATGCTTCCCTACTGGTTCTCTGCCATGACCATGAAGAGTGTAGGAAGTGCTGCTTTGAAAATGGTTGAGGAAGTTCGTAGGCAATTCAACACTATCCCTGGTCTCATGGAAGGTACTGCCAAGCCTGACTATGCAAATTGTGTCAAGATATCAACTGATGCATCTATTAAAGAGATGATTCCTCCTGGTGCCTTGGTCATGCTCACGCCACTTATTGTTGGAACTCTATTTGGTGTCGAGACTCTTTCTGGTGTTTTGGCTGGTTCCCTTGTTTCTGGTGTCCAGATAGCCATATCTGCCTCCAATACTGGTGGTGCATGGGACAACGCAAAGAAGTACATTGAGGCTGGAGCTTCGGAGCATGCAAGGTCTCTTGGTCCAAAGGGCTCGGATCCACACAAGGCAGCAGTGATTGGTGACACAATTGGTGACCCCCTAAAGGACACTTCAGGACCATCTCTTAATATCCTCATCAAGTTGATGGCAGTGGAGTCACTTGTATTTGCTCCCTTCTTTGCCACTCACGGCGGCCTTCTCTTCAAAATCTTTTAA

2、利用生物信息學(xué)軟件和在線網(wǎng)絡(luò)資源對(duì)克隆獲得的ThVP2基因進(jìn)行序列特征分析：

運(yùn)用ExPASy(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)在線軟件，我們對(duì)剛毛檉柳ThVP2基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了基本理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)分析，如下：

編碼的氨基酸數(shù)：764

等電點(diǎn)(PI)：5.19

分子量(MW)：80.24KD

負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)：60

正電荷殘基(Arg+Lys)：49

分子式：C3643H5741N907O1051S37

不穩(wěn)定系數(shù)(II)：22.12

平均疏水性(GRAVY)：0.589

脂肪系數(shù)(AI)：104.84

實(shí)施例2

逆境脅迫后檉柳不同組織基因表達(dá)模式分析

1、檉柳的生長(zhǎng)與脅迫處理

將剛毛檉柳種子播種于V(泥炭土)∶V(沙)＝2:1的混合土壤中，并置于平均溫度24℃、光照/暗時(shí)間16h/8h，相對(duì)濕度70％～75％的溫室中培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好和長(zhǎng)勢(shì)一致的2月齡剛毛檉柳幼苗進(jìn)行20％(w/v)PEG6000、0.4mol/LNacl的脅迫處理。脅迫0h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、72h、96h后取剛毛檉柳的地上部分和地下部分，每個(gè)處理重復(fù)3次。每個(gè)樣品取15-20棵幼苗，將其充分混勻，用液氮速凍，置于-80℃冰箱用于RNA的提取。

采用CTAB法提取剛毛檉柳在20％(w/v)PEG6000、0.4mol/LNacl處理下的不同時(shí)間點(diǎn)的地上部分與地下部分的總RNA，按照PrimeScript^TM RT reagent Kit(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2、ThVP2基因在非生物脅迫下的抗逆分析

基于ThVP2全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以剛毛檉柳β-actin(FJ618517)、α-tubulin(FJ618518)和β-tubulin(FJ618519)基因作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR使用試劑盒TransStart Top Green qPCR SuperMix(TransGen)進(jìn)行，反應(yīng)體系：2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10μL，上游引物和下游引物(10μmol/L)各1μL，稀釋后的模板cDNA 2μL，加滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30s；94℃變性12s，58℃退火30s，72℃延伸45s，79℃讀板1s，45個(gè)循環(huán)。

待PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溫度以0.5℃/s的速度從55℃升到99℃。每個(gè)樣品重復(fù)3次，用2^－△△Ct方法進(jìn)行基因的相對(duì)定量分析。

表1實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，ThVP2在高鹽及干旱脅迫下均呈現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)， 但在各脅迫時(shí)間點(diǎn)和不同組織中的表達(dá)模式有所差異。

在Nacl脅迫下，地上部分與地下部分均有不同程度的上調(diào)(圖2)，地上部分3h時(shí)變化最大，上調(diào)了45倍；地下部分6h時(shí)變化最大，上調(diào)了15倍。在PEG6000脅迫下，地上部分和地下部分的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)(圖3)，地上部分96h上調(diào)最大，上調(diào)了22倍，而在12h時(shí)次之，上調(diào)了13倍；地下部分，24h時(shí)上調(diào)最大，上調(diào)了19倍。在24h，72h，96h地上部分和地下部分變化差異明顯。綜上所述，ThVP2對(duì)高鹽和干旱脅迫具有明顯的響應(yīng)，在剛毛檉柳地上部分和地下部分表達(dá)量顯著上升，表明ThVP2可能參與剛毛檉柳抗旱耐鹽生理過(guò)程。

實(shí)施例3：轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得和耐逆性鑒定

具體實(shí)施如下：

根據(jù)植物表達(dá)載體pROK2和目標(biāo)基因ThVP2的基因序列引入相應(yīng)同源序列，即：在ThVP2基因的5’端和3’端分別引入pROK2的Sma I核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)兩端同源序列，F(xiàn)：5’TCGAGCTCGGTACCCGGGATGATTTCGGATCTAGTGAC 3’和R：5’TCTAGAGGATCTCCCGGGTTAAAAGATTTTGAAGAGAAGG 3’。以pMD18-ThVP2為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得ThVP2基因編碼區(qū)序列。

PCR反應(yīng)體系為20μL：pMD18-ThVP2質(zhì)粒1μL，上游引物和下游引物(10μm)各1μL，10×ExTaq PCRbuffer 2μL，dNTPs(10mmol/l)0.4μL，ExTaq(5U/μL)0.3μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，循環(huán)35個(gè)；72℃保溫10min。

將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化后，用Sma I酶切，回收純化后，與同樣用Sma I酶切的載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10菌株(北京原平皓生物科技有限公司)，經(jīng)PCR驗(yàn)證和測(cè)序結(jié)果鑒定正確后，將重組的質(zhì)粒pROK2-ThVP2用電導(dǎo)法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中，得到陽(yáng)性重組菌。

用攜帶植物表達(dá)載體pROK2-ThVP2-EHA105的農(nóng)桿菌菌株，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Columbia生態(tài)型，以獲得過(guò)表達(dá)株系，收獲的T₀代擬南芥種子經(jīng)消毒后播種在1/2MS含終濃度50mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，篩選出的抗性植株移栽至土里正常培養(yǎng)，待葉片長(zhǎng)大后，取其葉片用CTAB法提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖4)，以野生型擬南芥葉片為陰性對(duì)照，以pROK2-ThVP2質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，篩選出的轉(zhuǎn)基因擬南芥為T₁代，繼續(xù)篩選，篩選方法同上，直至收獲T₃代轉(zhuǎn)基因純合系。

對(duì)獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行抗逆表型分析，將野生型和T₃代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子消毒后播種于l/2MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)5-7天后，轉(zhuǎn)移至分別含有150mM NaCl和175mM甘露醇 的脅迫培養(yǎng)基上進(jìn)行根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)(圖5-圖7)，結(jié)果表明在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥長(zhǎng)勢(shì)基本一致；但在高鹽和干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯強(qiáng)于野生型擬南芥。在NaCl和Mannitol的脅迫下，擬南芥的根長(zhǎng)逐漸變短，而過(guò)表達(dá)株系在脅迫條件下的根長(zhǎng)顯著高于野生型擬南芥的根長(zhǎng)，以上結(jié)果說(shuō)明剛毛檉柳液泡膜H+轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因具有明顯的抗鹽耐旱的能力，是用于林木基因工程育種的優(yōu)良基因。

在以上實(shí)施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明同樣進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)將剛毛檉柳ThVP2基因轉(zhuǎn)入其他植物例如煙草,尤其是林木,例如楊樹(shù)和白樺等,同樣可以獲得類似的效果。