技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，涉及過繼免疫治療中的一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞(CAR20-NKT細(xì)胞)、其制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

臨床將TCR^-、mIg^-、CD56⁺、CD16⁺、CD3⁺淋巴樣細(xì)胞鑒定為NKT細(xì)胞。NKT細(xì)胞既表達(dá)T細(xì)胞表面標(biāo)志，又表達(dá)NK細(xì)胞的表面標(biāo)志，NKT細(xì)胞能夠識(shí)別和殺傷突變的腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，而對(duì)正常自身組織細(xì)胞無細(xì)胞毒作用。NKT細(xì)胞通過自身表面的CD16與特異性抗體的Fc段結(jié)合，發(fā)揮ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用。但是，在抗體介導(dǎo)的ADCC作用過程中，抗體能與靶細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，可殺傷任何已與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，抗體與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，NKT細(xì)胞等對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用是非特異性的。通常情況下，輸注的NKT細(xì)胞在患者體內(nèi)半衰期一般為2周左右，有效期短暫，需要反復(fù)多次輸注。另外，NKT細(xì)胞本身缺少非特異性抗體，不足以在腫瘤周圍或者瘤巢中富集，制約了NKT細(xì)胞對(duì)進(jìn)展期惡性腫瘤的靶向治療。

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)是由抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域(配體或單鏈抗體)和胞內(nèi)的一系列信號(hào)結(jié)構(gòu)域依次連接而成，具體包括抗原特異性的受體(如單鏈抗體ScFv)，間隔序列(spacer)，跨膜序列(TM Domain)和胞內(nèi)共刺激信號(hào)分子。在體內(nèi)CAR修飾的淋巴細(xì)胞能夠通過其單鏈抗體特異的識(shí)別相關(guān)腫瘤表面抗原，然后通過胞內(nèi)共刺激信號(hào)分子將識(shí)別的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞的殺傷性，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。

CD20單克隆抗體療法在治療B細(xì)胞淋巴瘤中已取得了令人滿意的效果，但是很多患者最終會(huì)產(chǎn)生耐藥性。CD20分子是一種B細(xì)胞分化抗原，僅表達(dá)于前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞表面，表達(dá)于95％以上的B細(xì)胞性淋巴瘤，而在造血干細(xì)胞、漿細(xì)胞和其他正常組織細(xì)胞中不表達(dá)。重要的是，CD20分子在膜上比較暴露，容易接近，與單克隆抗體結(jié)合后無顯著內(nèi)化及脫落，也不會(huì)因?yàn)榕c抗體的結(jié)合而發(fā)生抗原調(diào)變，故成為治療B細(xì)胞淋巴瘤的理想靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞及其制備方法，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤制劑中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，該細(xì)胞是嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞，該嵌合抗原受體由CD20ScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。

如上所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的核苷酸序列如序列表中SEQID NO.2所示。

一種如上所述NKT細(xì)胞的制備方法，該方法包括以下步驟：通過RT-PCR從NKT細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，以及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，酶切、膠回收后通過T4DNA連接酶連接到載體pWPT-GFP，構(gòu)建得到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ；再通過全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和CD20ScFv的核苷酸序列，酶切、膠回收后克隆到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ，測(cè)序驗(yàn)證序列正確性，得到pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ；然后包裝成攜帶pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ編碼基因的慢病毒；利用該慢病毒感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。

一種如上所述NKT細(xì)胞的制備方法，優(yōu)選地，該方法包括以下步驟：

1)NKT細(xì)胞的制備：分離靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)獲得NKT細(xì)胞；

2)重組質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的構(gòu)建：以提取步驟1培養(yǎng)后NKT細(xì)胞cDNA為模板，利用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核苷酸序列如序列表中SEQID NO.3所示，兩端分別含有MluI和BglⅡ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；利用引物P3、P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得基因CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID NO.4所示，兩端分別含有BglⅡ和EcoRI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基；利用引物P5、P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID NO.5所示，兩端分別含有EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，將獲得的PCR產(chǎn)物電泳分離純化后分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后與MluI/SalI雙酶切后的慢病毒表達(dá)載體pWPT-GFP通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Trans1-T1Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pWPT-CD8-CD137-CD3ζ；

3)嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的構(gòu)建：將含有大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和CD20ScFv的質(zhì)粒pGSI-CD20ScFv進(jìn)行BglⅡ/MluI雙酶切，回收DNA片段；其中，該大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽核苷酸序列如序列表中SEQID NO.6，5’端含有BglⅡ、kozak序列，該CD20ScFv核苷酸序列如序列表中SEQID NO.7，其3’端含有MluI酶切位點(diǎn)；將步驟2回收的重組質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ進(jìn)行BamHI/MluI雙酶切，回收載體片段；將酶切后的DNA片段和質(zhì)粒載體片段連接后轉(zhuǎn)入Trans1-T1Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞大量擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒即為嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ；

4)嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾NKT細(xì)胞：慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ與輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G按4:2:1的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h、72h時(shí)收集病毒上清，離心并用4.5μm濾器過濾，在濾液中添加1/4體積的5×PEG6000-NaCl進(jìn)行混勻，離心后棄上清，沉淀用4℃預(yù)冷的無菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液；

5)嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾NKT細(xì)胞：取1×10⁷-5×10⁷NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入2-4mL新鮮GT-T551培養(yǎng)液，加入200-400μL步驟4)得到的病毒濃縮液、2-4μL 1×10^-6單位魚精蛋白、終濃度為1000U/mL IL-2，置于37℃，5％CO₂孵箱中感染12-16小時(shí)后，棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵箱繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)8-15天后，感染獲得嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞，該嵌合抗原受體的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID NO.1所示。

如上所述工程化CD20靶向性的制備方法，優(yōu)選地，所述步驟5)轉(zhuǎn)染后的NKT細(xì)胞用終濃度為1000U IL-2的GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞量占培養(yǎng)瓶80-90％時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔2天加入終濃度為1000U/mL IL-2的新鮮GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到1×10⁹左右后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)感染的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定。

一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，優(yōu)選地，該細(xì)胞是采用如上所述的方法制備的。

如上所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤制劑中的應(yīng)用。

如上所述的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述腫瘤是指進(jìn)展期CD20陽性惡性腫瘤。

本發(fā)明的研究者發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)展期CD20陽性惡性腫瘤免疫治療中，工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞比NKT細(xì)胞具有更突出的優(yōu)勢(shì)，包括特異的靶向性，CD20嵌合抗原受體依賴的腫瘤殺傷活性以及輸注后的長(zhǎng)效性。工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞所擁有的這些特性，源于嵌合抗原受體的功能結(jié)構(gòu)，主要包含抗體識(shí)別區(qū)域以及細(xì)胞激活區(qū)域，抗體識(shí)別區(qū)域使工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞靶向于進(jìn)展期CD20陽性惡性腫瘤，另外，細(xì)胞內(nèi)激活區(qū)能延長(zhǎng)細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時(shí)間?？梢?，工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞為治療進(jìn)展期CD20陽性惡性腫瘤提供一個(gè)新的選擇。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞可特異性結(jié)合CD20，在進(jìn)展期CD20陽性惡性腫瘤治療中采用工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞明顯的延長(zhǎng)免疫細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時(shí)間，增強(qiáng)免疫細(xì)胞靶向識(shí)別腫瘤抗原的能力，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。此外，本發(fā)明通過優(yōu)化制備工藝，提供一種高效制備CD20靶向性NKT細(xì)胞的方法，該方法制備的NKT細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染率，并可規(guī)模化生產(chǎn)，具有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離培養(yǎng)的NKT細(xì)胞表型分析結(jié)果。

圖2為本發(fā)明所述慢病毒表達(dá)載體pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性內(nèi)切酶MluI/SalI雙酶切片段電泳鑒定圖。

圖3為本發(fā)明所述嵌合抗原受體的慢病毒表達(dá)載體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD 137-CD3ζ的限制性內(nèi)切酶BamHI/SalI雙酶切片段電泳鑒定圖。

圖4為本發(fā)明所述的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，逆時(shí)針序列為正向基因片度，順時(shí)針為反向基因片段。

圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)CAR20-NKT細(xì)胞表型鑒定結(jié)果。

圖6為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)含有CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒濃縮液對(duì)NKT細(xì)胞的感染效率。

圖7為PT-PCR檢測(cè)CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ在NKT細(xì)胞中的表達(dá)效率。

圖8為本發(fā)明所述的CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)人腫瘤細(xì)胞的殺傷作用的細(xì)胞毒性分析圖。

圖9為本發(fā)明所述的CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)CD20陽性的B細(xì)胞惡性腫瘤患者的治療效果。

圖10為本發(fā)明所述的CAR20-NKT細(xì)胞治療前(上圖)與治療后1月CT的對(duì)比圖。

圖11為本發(fā)明所述的CAR20-NKT治療前后患者病變淋巴結(jié)增速圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，它是在NKT細(xì)胞基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的一種工程化細(xì)胞，是由嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞。嵌合抗原受體前體蛋白由信號(hào)肽、CD20ScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成，蛋白質(zhì)翻譯后在細(xì)胞內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)切除信號(hào)肽后成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于NKT細(xì)胞的細(xì)胞膜上。該嵌合抗原受體的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID NO.1所示，其對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如序列表中SEQID NO.2所示。該嵌合抗原受體特異地識(shí)別CD20的胞外區(qū)LOOP環(huán)44個(gè)氨基酸的一段，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO.8所示。該嵌合抗原受體以基因CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO.9所示，其對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如序列表中SEQID NO.10所示。

利用該嵌合抗原受體修飾的NKT細(xì)胞，能夠通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的CD20抗原，消除CD20抗原陽性的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行腫瘤治療。

本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是通過RT-PCR從人NKT細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，酶切、膠回收后通過T4DNA連接酶連接到載體pWPT-GFP，構(gòu)建得到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ，再通過全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和CD20ScFv的核苷酸序列，酶切、膠回收后克隆到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ，測(cè)序驗(yàn)證序列正確性，得到pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。然后包裝成攜帶pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ編碼基因的慢病毒。利用該慢病毒感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。通過細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)證明該嵌合抗原受體修飾的NKT細(xì)胞對(duì)CD20陽性的腫瘤細(xì)胞具有特異殺傷作用。因此本發(fā)明所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞可應(yīng)用于CD20陽性的腫瘤治療。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以下所舉實(shí)施例是為便于更好地理解本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種修改或改動(dòng)，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)權(quán)利要求書所限定的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到。

本發(fā)明的實(shí)施例中所用的試劑如下：

GT-T551細(xì)胞培養(yǎng)基，TaKaRa公司

淋巴細(xì)胞分離液，TBD公司

NK細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551、CD3單克隆抗體、retronectin，TAKORA公司

重組人蛋白干擾素-γ、重組人白介素2，protech公司

總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶(HS DNA Polymerase)、T4DNA連接酶，TaKaRa公司

RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas公司

BglⅡ、EcoRI、MluI、BamHI，F(xiàn)ermentas公司

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技有限公司

pWPT-GFP，Addgene公司

Trans1-T1Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，北京全式金生物技術(shù)有限公司

Lipofectamine^TM 2000Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑，Invitrogen公司

羧基熒光素琥珀酰亞胺酯，圣地亞哥，CA，USA

膜聯(lián)蛋白V-RPE試劑盒，南方生物技術(shù)，AL，USA

實(shí)施例1NKT細(xì)胞的制備

(1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心方法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。

(2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6％常規(guī)血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)整細(xì)胞終濃度為2×10⁶cell/mL；將細(xì)胞接種于預(yù)先經(jīng)過終濃度為5μg/mLCD3單克隆抗體及終濃度為10μg/mL的retronectin(購自TAKORA公司)包被的75厘米細(xì)胞培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)基里加入終濃度為1000U/mL的重組人蛋白干擾素-γ和1000U/mL的重組人白介素2，37℃，飽和濕度為5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

(3)第四天，向瓶中補(bǔ)加100mL含有0.6％常規(guī)血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基，加入終濃度為1000U/mL的重組人白介素2。于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，得到NKT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)NKT細(xì)胞表型進(jìn)行分析。結(jié)果見圖1，其中CD3：98.76％；CD3CD4:26.03％；CD3CD8:68.65％；CD3CD56:4.73％；CD8CD56:3.33％。

實(shí)施例2:嵌合抗原受體(pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ)慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)NKT細(xì)胞cDNA的制備

離心沉淀實(shí)施例1培養(yǎng)的NKT細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent提取細(xì)胞的總RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。提取的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄得NKT細(xì)胞cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)慢病毒質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的制備

所用引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物序列如下(其中，下劃線標(biāo)記為保護(hù)堿基，方框?yàn)槊盖形稽c(diǎn))：

以步驟(1)中NKT細(xì)胞cDNA為模板，用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)287bp的CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核苷酸序列如序列表中SEQID NO.3所示；兩端分別含有MluI和BglⅡ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，用引物P3、P4進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增長(zhǎng)146bp的CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID NO.4所示，兩端分別含有BglⅡ和EcoRI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基；用引物P5、P6進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID NO.5所示，兩端分別含有EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。各步PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相同，以擴(kuò)增CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件參照HS DNA Polymerase的說明書，反應(yīng)體系(50μL)如下：

雙蒸水：32.5μL

5×反應(yīng)buffer：10μL

dNTP Mixture(2.5mM each)：4μL

P3(10mM):1μL

P4(10mM):1μL

NKT細(xì)胞cDNA(200ng/ul)：1μL

HS DNA Polymerase：0.5μL

將上述PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行DNA片段回收。得到片段分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒回收備用。

慢病毒表達(dá)載體pWPT-GFP用MluI/SalI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、CD137、CD3ζ片段通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)16h后挑取單克隆，37℃，250rpm培養(yǎng)12h后質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和SalI雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見圖2，其中，1泳道：DNA分子量標(biāo)記D2000；2泳道：質(zhì)粒pWPT-GFP的酶切片段(835bp)；3泳道：質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(756bp)。將鑒定正確的質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pWPT-CD8-CD137-CD3ζ。

(3)慢病毒質(zhì)粒pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制備

全基因合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和CD20ScFv的核苷酸序列，序列如序列表中SEQID NO.6所示，由天一輝遠(yuǎn)科技有限公司合成，其5’端含有BglⅡ、kozak序列，3’端含有MluI酶切位點(diǎn)，克隆在質(zhì)粒pGSI中，命名為pGSI-CD20ScFv。質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ/MluI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段備用。

pWPT-CD8-CD137-CD3ζ質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/MluI進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收的含有大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和CD20ScFv的DNA片段通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接，具體方法見說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)16h后挑取單克隆，37℃，250rpm培養(yǎng)12h后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/MluI雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，其中，1泳道：DNA分子量標(biāo)記D15000；2泳道：質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(756bp)；3泳道：質(zhì)粒pWPT-GFP的酶切片段(835bp)；4泳道：質(zhì)粒pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(1305bp)。將鑒定正確的質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，亦稱為CAR-CD20，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示，其中包括信號(hào)肽、抗CD20單鏈抗體、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。

實(shí)施例3嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞的制備

(1)慢病毒的包裝和濃縮

用質(zhì)粒小提試劑盒分別提取慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ和輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G。分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，三種質(zhì)粒以4:2:1的質(zhì)量比用Lipofectamine^TM 2000Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞。分別在轉(zhuǎn)染48h、72h時(shí)收集病毒上清于EP管中，4℃，2000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清至新EP管中，用4.5μm濾器過濾病毒上清；過濾的病毒上清與5×PEG6000-NaCl按照4:1的體積比混勻，4℃靜置2h，然后4℃，10000g離心20min，棄上清，沉淀用4℃預(yù)冷的無菌PBS溶解，即得病毒濃縮液，進(jìn)行分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)慢病毒感染NKT細(xì)胞及感染后細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)

取實(shí)施例1在25cm²培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)的1×10⁷NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入2mL新鮮GT-T551培養(yǎng)液，200μL病毒液，2μL 1×10^-6單位魚精蛋白，終濃度為1000U/mL IL-2，置于37℃，5％CO₂孵箱中感染12小時(shí)后，棄培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置含GFP綠色熒光標(biāo)記的嵌合抗原受體病毒濃縮液對(duì)對(duì)照組NKT細(xì)胞進(jìn)行同步感染，用于計(jì)算該病毒的感染效率。將感染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)至未包被的75cm²培養(yǎng)瓶中，加入20mL的培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵箱繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。該嵌合抗原受體病毒濃縮液對(duì)NKT細(xì)胞的感染效率，設(shè)置含GFP綠色熒光標(biāo)記的嵌合抗原受體病毒濃縮液對(duì)對(duì)照組NKT細(xì)胞進(jìn)行同步感染，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并計(jì)算該病毒的感染效率，結(jié)果如圖6所示，感染效率為33.63％。

(3)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增成富含CD3CD56雙陽性的CAR20-NKT細(xì)胞群

將感染后的NKT細(xì)胞應(yīng)用含有終濃度為1000U/mL IL-2的GT-T551培養(yǎng)液對(duì)CART細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)、待細(xì)胞量占培養(yǎng)瓶80-90％時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔2天加入終濃度為1000U/mL IL-2的GT-T551培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到1×10⁹左右后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)感染的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定，細(xì)胞表型一般達(dá)到：CD3陽性細(xì)胞比例＞90％；CD3CD8陽性細(xì)胞比例>70％；CD3CD56雙陽性細(xì)胞比例>5％，結(jié)果見圖5，CD3:96.9％；CD3CD4:20.93％；CD3CD8:70.52％；CD3CD56:6.24％；CD8CD56:5.09％。

(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ在NKT細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

分別收集1×10⁶感染pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζNKT細(xì)胞(即CAR20-NKT細(xì)胞)及未感染病毒對(duì)照組細(xì)胞(NKT)，用2％多聚甲醛固定，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(cè)基因的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果如圖7，圖中陽性參照物(陽參)指單獨(dú)pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ重組質(zhì)粒；NKT為未感染pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ重組質(zhì)粒的NKT細(xì)胞；CAR20-NKT為感染pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ重組質(zhì)粒的NKT細(xì)胞。結(jié)果表明，嵌合抗原受體在NKT細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，該嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.1所示。

實(shí)施例4 CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)人腫瘤細(xì)胞殺傷作用的細(xì)胞毒性分析

分別取實(shí)施例3中制備的CAR20-NKT細(xì)胞和實(shí)施例1中培養(yǎng)的NKT細(xì)胞接種于96孔板，用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)進(jìn)行染色，與Molt-4，K562，K562-CD20+和Reji細(xì)胞以1:1，5:1，10:1，20:1比率進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過24小時(shí)的共培養(yǎng)后，將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V-RPE試劑盒染色。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞死亡的量根據(jù)下面的公式計(jì)算：死亡率＝(對(duì)照-樣品)/對(duì)照×100％)，對(duì)照為未加CAR20-NKT的腫瘤細(xì)胞；樣本為加入效靶比(殺傷細(xì)胞：靶細(xì)胞)為20:1的CAR20-NKT的腫瘤細(xì)胞，見圖8。嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞對(duì)高表達(dá)CD20的腫瘤細(xì)胞具有特異殺傷活性。

實(shí)施例5 CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)CD20陽性的惡性腫瘤患者的治療效果

取5×10⁸個(gè)CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT淋巴細(xì)胞，連續(xù)三天靜脈回輸?shù)紺D20陽性的腫瘤患者體內(nèi)，治療一個(gè)月后進(jìn)行分析。

如圖9所示，免疫組化檢測(cè)工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)的歸巢情況，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)活檢顯示靶向免疫細(xì)胞治療后大量CD3，CD20陽性細(xì)胞出現(xiàn)在腫瘤組織，說明CD20靶向性的NKT細(xì)胞能夠歸巢到病灶部位發(fā)揮殺傷作用。

如圖10所示，CT顯示工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞對(duì)CD20惡性腫瘤患者的治療效果，結(jié)果表明靶向免疫細(xì)胞治療前(上圖)與治療后1月CT(下圖)對(duì)比：腫大淋巴結(jié)縮小(具體見箭頭所示)。

如圖11所示，工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞治療后患者病變淋巴結(jié)增速較前明顯減慢，并于治療3周后，腫大淋巴結(jié)開始自行消退(圖中以腫大的鎖骨上淺表淋巴結(jié)最長(zhǎng)經(jīng)為代表)。