本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體的說，涉及一種與人甘油三磷酸脫氫酶具有特異性結(jié)合的生物芯片，已經(jīng)相應(yīng)的制備得到的試劑盒。

背景技術(shù)：

高血壓(hypertension)是一種常見的以動脈血壓持續(xù)升高為主要表現(xiàn)的慢性疾病，指在靜息狀態(tài)下動脈舒張壓>90mmHg。而收縮壓在120-139mmHg和/或舒張壓在80-89mmHg之間稱為高血壓前期或正常高值。

高血壓是心腦血管病最主要的危險因素，其腦卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性腎臟病等主要并發(fā)癥，不僅致殘、致死率高，而且嚴重消耗醫(yī)療和社會資源，給家庭和國家造成沉重負擔(dān)。大量長期的臨床觀察表明高血壓前期也是心腦血管疾病和腎病的獨立危險因素。我國人群50年來高血壓患病率的明顯上升趨勢。根據(jù)2002年調(diào)查數(shù)據(jù)，我國18歲以上成人高血壓患病率為18.8％，估計目前我國約有2億高血壓患者，每10個成年人中就有2人患有高血壓，約占全球高血壓總?cè)藬?shù)的1/5。高血壓前期在我國的發(fā)病率約為44％-60％，以中青年為主；其中45％的高血壓前期在十年內(nèi)發(fā)展為高血壓，是我國高血壓患者的"后備軍"。國內(nèi)外的實踐證明，高血壓是可以預(yù)防和控制的疾病，降低高血壓患者的血壓水平，可明顯減少腦卒中及心臟病事件，顯著改善患者的生存質(zhì)量，有效降低疾病負擔(dān)。

高血壓發(fā)生的病理學(xué)基礎(chǔ)是血管重塑造成的血管結(jié)構(gòu)與功能改變，因此高血壓的本質(zhì)是一種血管性病變。高血壓導(dǎo)致的靶器官損傷也是以血管損傷為基礎(chǔ)的器官功能衰減過程。血管損傷是高血壓發(fā)生的病理基礎(chǔ)，也是高血壓維持、發(fā)展的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此如何采取簡便、快捷、準確的手段在高血壓早期即篩查出高血壓及血管損傷的高?；颊?，及早采取治療預(yù)防措施，對于提高心血管疾病的控制率、降低心血管并發(fā)癥的死亡率、改善病人的生活質(zhì)量、減少國家醫(yī)療費用支出等都具有重要意義，也是目前醫(yī)學(xué)研究及臨床應(yīng)用的重要課題。

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是最常見的心血管疾病，其發(fā)病率逐年上升，并可引起嚴重的心、腦、腎并發(fā)癥，是腦卒中和冠心病的主要危險因素。EH是一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找EH相關(guān)基因進而闡明高血壓發(fā)病的遺傳機制已經(jīng)成為目前研究的熱點(HarrapSB.Hypertension：genes versus environment.Lancet，1994，344：169-171)。

基因芯片(Gene chip)又稱DNA芯片(DNA CHIP)、DNA陣列(DNA arrays)、寡核苷酸微芯片(oligonucleotide micro-chip)，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對雜交信號的強度進行分析和處理，從而迅速得出所要的信息。目前，基因芯片技術(shù)正逐漸應(yīng)用到生命科學(xué)各個領(lǐng)域中。

基因芯片制備技術(shù)：基因芯片的實質(zhì)是高度集成的寡核苷酸陣列，制造基因芯片首先要解決的技術(shù)是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探針。目前，基因芯片的制備技術(shù)主要有原位合成與合成后點樣兩種。

基因芯片在臨床疾病診斷中的應(yīng)用：從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。這種基因芯片診斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。例如，Affymetrix公司和Oncormed公司合作研制的p53基因芯片可監(jiān)測50％以上腫瘤患者的p53基因突變，可在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。基因芯片在感染性疾病、遺傳性疾病、重癥傳染病和惡性腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨特的優(yōu)勢。與傳統(tǒng)檢測方法相比，它可以在一張芯片同時對病人進行多種疾病的檢測，勿需機體處于免疫應(yīng)答反應(yīng)期，能及早診斷，待測樣品用量?。荒芴禺愋詸z測病原微生物的亞型及變異；可幫助醫(yī)生及患者從“系統(tǒng)、血管、組織和細胞層次(第二階段醫(yī)學(xué))”轉(zhuǎn)變到“DNA、RNA、蛋白質(zhì)及其相互作用層次(第三階段醫(yī)學(xué))”上了解疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。這些特點使得醫(yī)務(wù)人員在短時間內(nèi)，可以掌握大量的疾病診斷信息，有助于醫(yī)生在短時間內(nèi)找到正確的治療措施。

大量研究表明，高血壓的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素相互作用所致。篩選與中國人群高血壓相關(guān)的易感基因片段，對于在人群中開展綜合防治項目有重要意義。將遺傳上相對易感的人作為高危人群，進行針對性的環(huán)境與行為干預(yù)，可以在有限的衛(wèi)生資源條件下，更好地達到預(yù)防高血壓的目的。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對目前對原發(fā)性高血壓疾病的診斷過程中，難以確定的狀況，提供一種方便、快捷的輔助檢測原發(fā)性高血壓的診斷芯片。

GPD2基因已經(jīng)報道是與原發(fā)性高血壓緊密相關(guān)的?，F(xiàn)有技術(shù)中檢測GPD2的表達量主要通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)進行檢測，所述檢測比較費時費力，效率低下。如果能篩選出甘油三磷酸脫氫酶的適配子，然后將其包被在生物芯片上，再結(jié)合SPR生物傳感器進行檢測，將非常的快捷和精確。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種與甘油三磷酸脫氫酶結(jié)合力更強、穩(wěn)定性好、精確性高、重復(fù)性好的適配子。

本發(fā)明目的之二在于提供一種與人甘油三磷酸脫氫酶GPD2具有特異性的適配子所構(gòu)成的生物芯片。

本發(fā)明目的之三在于提供一種試劑盒，所述試劑盒其含有上述的檢測芯片。

本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的：一種與人甘油三磷酸脫氫酶GPD2具有特異性的適配子，其特征在于：他具有SEQ ID No.1-SEQ ID No.26的序列之一。

一種由與人甘油三磷酸脫氫酶GPD2具有特異性的適配子構(gòu)成的的生物芯片，包括玻璃基底(1)，玻璃基底(1)上依次附著有金膜(2)、連接層(3)和表面基質(zhì)(4)，所述金膜(2)的流池包被有SEQ ID No.1-SEQ ID No.26序列的適配子。

上述金膜⑵在包被適配子前,先預(yù)處理，即在1.0mol/L NaOH中浸泡清洗20min，取出后用去離子水清洗3次,然后放入Piranha溶液中處理15min,取出后立即投入無水乙醇中浸泡5min,氮氣吹干。

上述適配子包被在金膜(2)上之前，先預(yù)處理，即先將適配子溶解到PBS緩沖液，95℃變性3min,迅速冰浴2min,隨后巰基法進行固定。

人甘油三磷酸脫氫酶GPD2適配子經(jīng)過以下方法制備篩選得到：

構(gòu)建隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫和引物：構(gòu)建ssDNA文庫，兩端為固定序列，中間35個核苷酸為隨機序列，其中N代表A，T，C，G中的任意一個：5’-ACTTTAGTAGCCAGTGAGAC-N35-GGAGCAGTACAGTGATCAGT-3’。

上游引物為5，-ACTTTAGTAGCCAGTGAGAC-3’，下游引物為5’-ACTGATCACTGTACTGCTCC-3’。下游引物序列5’端需用生物素標記。隨機單鏈DNA文庫和引物可由引物合成公司合成。

雙鏈DNA(dsDNA)文庫的PCR擴增及回收；

單鏈DNA文庫的PCR擴增及回收；

采用SELEX篩選，將純化后的目的基因PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-Tsimplevector連接，測序。

適配子包被生物芯片

我們在表面基質(zhì)上包被親和性最強的適配子，然后結(jié)合SPR生物傳感器進行檢測。

有益效果：本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒能夠快速的檢測人甘油三磷酸脫氫酶，通過檢測所述酶的量，可以用來鑒定樣本是否為原發(fā)性高血壓。本發(fā)明的試劑盒采用芯片的方式進行檢測，芯片檢測具有檢測效率高，靈敏度好，應(yīng)用范圍廣發(fā)的效果，可以大面積推廣使用。

具體實施方式：

實施例1適配子的獲得

重組人甘油三磷酸脫氫酶-2為市場上購買自ProSpec，產(chǎn)品貨號ENZ-437。

構(gòu)建隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫和引物：構(gòu)建ssDNA文庫，兩端為固定序列，中間35個核苷酸為隨機序列，其中N代表A，T，C，G中的任意一個：5’-ACTTTAGTAGCCAGTGAGAC-N35-GGAGCAGTACAGTGATCAGT-3’。

上游引物1為5，-ACTTTAGTAGCCAGTGAGAC-3’，下游引物2為5’-ACTGATCACTGTACTGCTCC-3’。下游引物序列5’端需用生物素標記。隨機單鏈DNA文庫和引物可由引物合成公司合成。

(1)利用引物1、引物2擴增單鏈DNA文庫：采用不對稱PCR，引物1/引物2濃度比100：1，擴增條件為：94℃預(yù)變性:3min，然后94℃變性30s，65℃退火45s，72℃延伸lmin，循環(huán)35次，最后72℃延伸7min。將獲得的產(chǎn)物(主要為ssDNA)于95℃作用3min，于冰中2min，室溫放置l0min，即為ssDNA文庫。

(2)反篩與篩選

1OOpmol隨機ssDNA文庫和5nmol(tRNA+鮭魚精DNA)加入10μl BSA反篩，在100μ1結(jié)合緩沖液中室溫孵育1h；然后轉(zhuǎn)移液體，與人甘油三磷酸脫氫酶25℃結(jié)合lh，用沖洗緩沖液洗6次，洗去未結(jié)合的ssDNA，再加洗脫緩沖液于80℃作用lOmin，洗脫下與人甘油三磷酸脫氫酶結(jié)合的ssDNA，經(jīng)酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。將ssDNA溶解于20μ1TE緩沖液中，用作擴增的模板，進行下一輪篩選，重復(fù)篩選20輪。

(3)測定親和性

將第20輪得到的ssDNA文庫經(jīng)過不對稱PCR擴增獲得生物素標記的ssDNA文庫，將純化獲得的人甘油三磷酸脫氫酶GPD2蛋白用碳酸鹽(pH9.6)緩沖液稀釋至10μg/ml包被酶聯(lián)板，4℃過夜，PBST(PBS+Tween)洗滌3次，3min/次；3％BSA37℃封閉1小時，PBST洗滌3次,3min/次；用SELEX binding buffer稀釋的第15輪生物素標記的ssDNA 0.05μg/孔，同時加入不同濃度梯度的人甘油三磷酸脫氫酶GPD2蛋白，37℃溫育60min，PBST洗滌4次，3min/次；1：2000稀釋的鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶37℃孵育30min，PBST洗滌4次，3min/次；加入四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)顯色液37℃顯色15min；2mol/L濃硫酸終止反應(yīng)，酶標儀于450nm處測定A值。A值為0.160.回收產(chǎn)物連接，20輪后，將篩選產(chǎn)物連接到PMD18-T simple vector(TaKaRa公司)。參考TaKaRa公司pMD18_Tsimple vector的產(chǎn)品說明，將純化后的目的基因PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-Tsimplevector連接，目的基因片段與載體片段反應(yīng)體系如下：

pMD18-T/PCR產(chǎn)物/連接緩沖液：1μl/9μ1/10μl 16℃連接過夜，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：

A、將目的基因片段與pMD18-T simple vector的連接產(chǎn)物20μl加入含有100μI的E.coli DH5a感受態(tài)細胞的EP管中，冰浴30min

B、放入42℃水浴熱休克lmin，快速將管取出冰浴2min

C、每管加SOC培養(yǎng)液600μl，37℃搖床，150rpm，培養(yǎng)60min，使細菌復(fù)蘇并表達質(zhì)

粒編碼的抗生素性標記基因。

D、將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布于含有氨芐青霉素100μg/ml的LB平板上，將平板置于室溫直至液體被吸收。

E、倒置平板，于37℃恒溫培養(yǎng)，12-16小時后出現(xiàn)菌落，隨機挑取幾個菌落PCR鑒定。

F、隨機挑取110個單克隆加入盛有600μl LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)的1.5ml EP管中，37℃搖床，200rpm，培養(yǎng)過夜。次日加入600μl(等量)80％高壓滅菌甘油，密封管口，于-70攝氏度保存菌種。

重組質(zhì)粒的提取，采用質(zhì)粒提取試劑盒快速提取。

PCR鑒定：

以提取質(zhì)粒為模板，加入引物1與引物2進行PCR擴增反應(yīng)，產(chǎn)物電泳。

適體親和性檢測

將挑取的單個克隆經(jīng)過不對稱PCR擴增后得到ssDNA，將此ssDNA與包被好的1μg/孔蛋白結(jié)合，酶聯(lián)法測定其親和性。

親和性如下表所示。

測序

挑取單克隆送測序公司測序

所述適配子的序列如SEQ ID NO：1-26所示。

采用本領(lǐng)域常用的Kd測量方法，測得本申請26個序列的Kd解離常數(shù)如下：

實施例3適配子包被生物芯片

我們在表面基質(zhì)上包被親和性最強的適配子SEQ ID NO：1-26，然后結(jié)合SPR生物傳感器進行檢測，具體方法如下：

生物芯片表面預(yù)處理將表面基質(zhì)鍍有鏈霉親和素的金膜電極的生物芯片放入1.0mol/LNaOH中浸泡清洗20min，取出后用去離子水清洗3次，然后將生物芯片放入Piranha溶液中處理15min,取出后立即將其投入無水乙醇中浸泡5min,氮氣吹干備用。

適配子預(yù)處理：PBS緩沖液溶解，95℃變性3min，迅速冰浴2min，隨后巰基法進行固定。

巰基法探針固定：經(jīng)過變性處理的生物素化的適配子覆蓋經(jīng)預(yù)處理的芯片表面基質(zhì)，使適配子牢固的固定在生物芯片上，適配子采用最佳濃度1.0umol/L,2h后PBS緩沖液清洗3次，0.02％BSA封閉約lh，PBS緩沖液清洗。

生物芯片制作完成后，再將包被好適配子的生物芯片載入SPR傳感器中，通入過量的蛋白，使其與芯片上的適配子進行反應(yīng)，最后記錄實驗結(jié)果如下：

根據(jù)檢測結(jié)果，我們可以得出流池1(陰性對照)的角度差為-5.8，流池2-27(檢測流池)的角度差依次為：290.5、289.6、278.6、284.9、297.6、287.7、284.0、286.3、286.0、284.1、288.9、284.8、279.6、274.0、290.3、279.1、277.4、286.5、277.5、280.2、278.7、284.3、288.6、289.6、287.5、286.6。兩者間有顯著差異(P<O.01)。說明通過SPR生物傳感器能夠?qū)θ巳烁视腿姿崦摎涿窯PD2進行定量的分析。

實施例4所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析

分別采用NADH脫氫酶、人Ⅲ型乙醇脫氫酶、BSA，人2型11β-羥基類固醇脫氫酶蛋白與26條適配子進行特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與人甘油三磷酸脫氫酶結(jié)合保持結(jié)合活性。

將所述的適配子，取0.5ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置四周。通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)四周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。說明適配子具有較強的穩(wěn)定性。

序列表

〈110〉朱繼平

〈120〉一種用于檢測高血壓的基因芯片及其試劑盒

〈160〉26

〈210〉1

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-1

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCAATTAATACTAATACCATAATACTTCCTTCTCTTGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉2

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-2

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCTTCTTTCTATACCCTTTAATTCTCCCTTTAACATGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉3

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-3

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACTCTATCATACCATATACATAAAAACTATTCATACTGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉4

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-4

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACTAATATTATATCCCTTCTTCATAATCATCCCTTTAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉5

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-5

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACTCTCAATACCATTTATACATTATACCTCTTAAACAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉6

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-6

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACAACCTCTACAAATATTATCTCTATTTATAATCCCTGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉7

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-7

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACTACCAATTTAATCTAAAACCCATATTTTCCACCACGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉8

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-8

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACACACATTCCCACCTAACTTCTTTAACTTAAATACTGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉9

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-9

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACATTTCCCTACTTATTCTCATCATCACTCCACCCTAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉10

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-10

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACTACAATATCTTTTATCTTAATACACTTACATTACCGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉11

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-11

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCATTATATAAACCTTAACTCAACTTCTTCCCCATAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉12

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-12

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACATCCCATACCATCCATAACCTCCATACCTCAAAACGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉13

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-13

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACATCATTATTTTTCTATAATTCTATTATATCCACTAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉14

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-14

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCACCCCACAAAATCTTACTCCACATTCAATCACTAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉15

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-15

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCAAATCATCTACTCTTCTCTCCAACTTCTACATAAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉16

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-16

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCTATTACTTTTCTACCAACTCCTTTTCCTTCTTCAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉17

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-17

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCAAAATCACCAACACAAACAATCTTTTTCCTTATCGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉18

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-18

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACTCCACTCTCTCAACTCTAACTACAACTCCTCTCTAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉19

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-19

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCATTCATTACCCTACCACATACCATACACCCCTTTGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉20

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-20

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACACTTACCCACTTTCTTTTAATAAACAATACCTCCCGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉21

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-21

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACTCATCTTATCATAAACTTTACATACCAAACATATCGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉22

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-22

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACTCAAAATACCAAAACTTATCACCCTCAACTTACATGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉23

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-23

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCACCTCACTCCTTATTCCCAACTATTTATAATATAGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉24

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-24

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCCCTATCCAAACAATCTATCTCCCACCTATCCCCTGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉25

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-25

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACTCTAAATAAACCACCCCAACTTTATATATTACTTCGGAGCAGTACAGTGATCAGT

〈210〉26

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GPD2-26

ACTTTAGTAGCCAGTGAGACCACTTTAACCACAAAACTTCATCCAATACTCAACCGGAGCAGTACAGTGATCAGT