高血壓易感性無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒（gnb3等基因）的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)高血壓易感基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)GNB3基因上C825T(rs5443)、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、TGF-Β1基因上T869C(rs1982073)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測(cè)序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測(cè)序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè)與高血壓發(fā)生密切相關(guān)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型從基因?qū)用鎭?lái)評(píng)估高血壓發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，指導(dǎo)人群提早預(yù)防疾病發(fā)生。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細(xì)胞采樣，無(wú)痛無(wú)創(chuàng)、避免了交叉感染。測(cè)序檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，不必購(gòu)置價(jià)格昂貴的進(jìn)口專(zhuān)用儀器，方法易普及推廣。
【專(zhuān)利說(shuō)明】高血壓易感性無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒(GNB3等基因)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本項(xiàng)目屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種高血壓易感基因檢測(cè)試劑盒，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬖u(píng)估高血壓發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并作為預(yù)防和治療高血壓的方向指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓是指在靜息狀態(tài)下動(dòng)脈收縮壓和/或舒張壓增高為主要臨床表現(xiàn)的綜合癥，可分為病因不明的原發(fā)性高血壓和由明確獨(dú)立疾病所引起的繼發(fā)性高血壓。其中，原發(fā)性高血壓患者占高血壓患者總數(shù)的95%以上。有調(diào)查結(jié)果顯示，59%的原發(fā)性高血壓患者都有家族史，說(shuō)明遺傳因素對(duì)于高血壓的發(fā)生具有重要影響。長(zhǎng)期高血壓是造成心腦血管疾病死亡的重要原因。因此開(kāi)發(fā)出一種高效、便捷的高血壓易感性檢測(cè)技術(shù)將對(duì)于預(yù)防和治療高血壓具有積極的意義。目前已經(jīng)有研究表明G蛋白β3亞基(GNB3)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β I (TGFβ I)等基因的多態(tài)性均與高血壓的易感性有直接關(guān)聯(lián)，在預(yù)防和治療高血壓中具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。
[0003]G蛋白是一種重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在細(xì)胞膜受體和效應(yīng)蛋白間的信號(hào)傳遞中起著重要的中介作用。GNB3的第825位C — T突變(C825T)會(huì)導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)截短型的但是具有功能活性的剪接變異體GNB3s。在高加索人群中攜帶有825Τ等位基因的人患高血壓的危險(xiǎn)性顯著增加。在漢族人群的單基因分析中尚未發(fā)現(xiàn)GNB3基因C825T基因多態(tài)性與高血壓的直接相關(guān)性，但是在GNB3基因235Τ等位基因攜帶者中卻發(fā)現(xiàn)GNB3基因825Τ等位基因會(huì)顯著增加高血壓的發(fā)病危險(xiǎn)。因此GNB3基因825Τ等位基因被認(rèn)為是高血壓發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。`
[0004]MTHFR是同型半胱氨酸(Hcy)代謝途徑中的關(guān)鍵酶。MTHFR基因的第677位C — T突變(C677T)會(huì)使其編碼的氨基酸從丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，從而影響酶的活性及熱穩(wěn)定性并使血漿中Hcy濃度升高，而Hcy水平的升高與高血壓的發(fā)病密切相關(guān)。研究顯示原發(fā)性高血壓患者中MTHFR基因C677T位點(diǎn)的TT基因型頻率和T等位基因頻率均高于正常人群且677ΤΤ基因型對(duì)Hcy型高血壓的發(fā)病危險(xiǎn)有顯著貢獻(xiàn)。因此MTHFR是高血壓發(fā)病的一個(gè)易感基因。
[0005]TGF^ I是具有多種生物活性的細(xì)胞因子，可調(diào)控內(nèi)皮素生成并影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)使血壓升高，在介導(dǎo)心血管疾病的發(fā)生中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)TGFii I第869位T — C突變(T869C)可使TGF0 I的血清水平上升并且在高血壓患者中C等位基因頻率有顯著增高。因此認(rèn)為T(mén)GF β I基因的869C等位基因是通過(guò)上調(diào)了 TGF β I的表達(dá)水平而增加了高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，是高血壓發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。
[0006]綜上所述，鑒于GNB3基因、MTHFR基因和TGF^ I基因在高血壓疾病中體現(xiàn)出來(lái)的疾病相關(guān)性，可以通過(guò)檢測(cè)這些高血壓發(fā)生相關(guān)基因單核苷酸位點(diǎn)基因型及時(shí)篩查出易患高血壓的高危人群，從而有針對(duì)性地預(yù)防和治療，這對(duì)于降低高血壓的發(fā)病率有非常重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于GNB3 基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF-B I 基因上T869C (rsl982073)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可用來(lái)評(píng)估高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)級(jí)另O，本發(fā)明提供一種高血壓基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。
[0008]該試劑盒包括:
檢測(cè) GNB3 基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF-B I 基因上T869C (rsl982073)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物；PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)。
[0009]PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)。
[0010]DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。
[0011]本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應(yīng)體系:10 XPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(duì)(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0012]PCR 產(chǎn)物純化體 系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
.3.875ul。
[0013]測(cè)序反應(yīng)體系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 測(cè)序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0014]本試劑盒供一人份檢測(cè)使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0016]除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0017]實(shí)施例1.檢測(cè)試劑盒的使用。
[0018]1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0019]2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
使用檢測(cè)試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(duì):
(1)GNB3 (C825T )正向引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’
GNB3 (C825T)反向引物:5’AAATGCCAGGAACCCAGAA3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3 ) TGF- B I (T869C)正向引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’
TGF- B I (T869C)反向引物:5’ GCTTCCGCTTCACCAGCT3’。[0020]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:10 X PCR反應(yīng)緩沖液2.5ul ；25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq酶0.125ul、DNA模板lul (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ul、ddH20 19.175ul。
[0021]反應(yīng)條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長(zhǎng)，循環(huán)28次，最后72°C延長(zhǎng)5分鐘以上。
[0022]3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化
使用檢測(cè)試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul。
[0023]在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0024]4、DNA測(cè)序反應(yīng)
使用檢測(cè)試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測(cè)序引物:
(1)GNB3 (C825T)測(cè)序引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’
(2)MTHFR (C677T)測(cè)序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(3)TGF-B I (T869C)測(cè)序引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’
反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測(cè)序引物lul，去離子水2ul。
[0025]在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0026]反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測(cè)
序儀中。
[0027]5、基因型分析
熟悉DNA測(cè)序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)DNA測(cè)序圖譜確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。
[0028]實(shí)施例2.為人群進(jìn)行預(yù)防高血壓基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)的服務(wù)。
[0029]1.采樣及抽提DNA
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。
[0030]2.基因型檢測(cè)
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)受檢者基因組DNA的GNB3基因上C825T (rs5443) ,MTHFR基因上C677T(rsl801133)、TGF-B I基因上T869C (rsl982073)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測(cè)序，確定這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。
[0031]3.高血壓高危人群風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析
通過(guò)對(duì)受檢者SNPs基因型的分析，出具高血壓風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說(shuō)明7受檢者 GNB3 基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF- B I 基因上T869C (rsl982073)的3個(gè)SNP位點(diǎn)基因檢測(cè)信息以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說(shuō)明和解讀高血壓基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)報(bào)告單。
【權(quán)利要求】
1.一種篩查高血壓高危人群的基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，其特征在于:檢測(cè)GNB3基因上C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF-B I 基因上 T869C (rsl982073)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測(cè)序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)GNB3基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF- B I 基因上 T869C(rsl982073)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測(cè)序引物是針對(duì)GNB3基因上C825T (rs5443)、MTHFR基因上C677T (rsl801133)、TGF_B I 基因上T869C (rsl982073)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出上述3個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測(cè)序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對(duì)特異性引物序列如下:
(I) GNB3 (C825T )正向引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’ GNB3 (C825T)反向引物:5’AAATGCCAGGAACCCAGAA3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3)TGF- B I (T869C)正向引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’ TGF- B I (T869C)反向引物:5’ GCTTCCGCTTCACCAGCT3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測(cè)序引物序列如下: (1)GNB3 (C825T)測(cè)序引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’ (2)MTHFR (C677T)測(cè)序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ (3)TGF-B I (T869C)測(cè)序引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應(yīng)體系:10父？0?反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對(duì)，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產(chǎn)物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測(cè)序反應(yīng)體系:25%BigDye mixlul, 3.2uM DNA測(cè)序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_(kāi)20°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103710425SQ201210373802
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2012年10月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月2日
【發(fā)明者】石慧林 申請(qǐng)人:解碼（上海）生物醫(yī)藥科技有限公司