本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種比酶活提高的木聚糖酶突變體及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：木聚糖酶可以廣泛應(yīng)用在釀造、飼料、造紙紙漿、食品、紡織、能源等工業(yè)中。木聚糖酶(xylanase)是指可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括外切β-1,4-木聚糖酶、內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。木聚糖酶可以將飼料的非淀粉多糖(NSPS)分解成較小聚合度的低聚木糖，從而改善飼料性能，消除或降低非淀粉多糖在動(dòng)物腸胃中因粘度較大而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用。同時(shí)它可以破壞植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，提高內(nèi)源性消化酶的活性，提高飼料養(yǎng)分的利用。在造紙工業(yè)中，用木聚糖酶預(yù)處理原料可大幅度降低原料中的半纖維素木聚糖的含量，可有效溶解部分酶解產(chǎn)物和少量木質(zhì)素組分，由于結(jié)構(gòu)更加疏松各種漂白試劑也可更好地滲入紙漿纖維內(nèi)，從而大幅度降低漂白試劑的用量，具有較大的環(huán)境效益和社會(huì)效益。在食品烘焙行業(yè)，木聚糖酶能夠降解面粉中的半纖維素，烘焙時(shí)，添加木聚糖酶能夠加強(qiáng)面粉彈性使面團(tuán)松軟的同時(shí)更易揉捏，改善體積和口感，此外，適當(dāng)?shù)哪揪厶敲高€能對(duì)面筋網(wǎng)格結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，從而延緩小麥?zhǔn)称返睦匣瘡亩娱L貨架期。但是，目前使用的木聚糖酶存在比酶活低、不穩(wěn)定、成本高，不能滿足生產(chǎn)需要等問題，因此需要通過分子改造進(jìn)行性質(zhì)優(yōu)化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明提供一種比酶活提高的木聚糖酶突變體及其編碼基因與應(yīng)用，本發(fā)明提供的木聚糖酶突變體具有比酶活高、作用溫度和pH范圍廣、具有良好的耐酸耐堿性以及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種比酶活提高的木聚糖酶突變體，包括(a)、(b)或(c)所示的蛋白質(zhì)；(a)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將SEQIDNO.1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加且具有木聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；(c)編碼(a)的核苷酸序列和編碼(b)的核苷酸序列經(jīng)分子雜交后編碼出的并且具有木聚糖酶活性氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。上述分子雜交的條件可以為：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。在具體的使用過程中為了方便蛋白質(zhì)的純化，可以在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上標(biāo)簽序列、標(biāo)記序列或者其他對(duì)木聚糖酶活性無影響或影響不大的序列。上述的蛋白可以人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。本發(fā)明的有益效果是：發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，具有上述序列的蛋白質(zhì)，具有比酶活高、作用溫度和pH范圍廣、具有良好的耐酸耐堿性以及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。進(jìn)一步，所述比酶活提高的木聚糖酶突變體的氨基酸序列是以xynHBN3基因編碼的氨基酸序列為出發(fā)序列的突變序列，將xynHBN3基因編碼的氨基酸序列的第42位天冬酰胺N突變?yōu)樘於彼酓，第149位蘇氨酸T突變?yōu)榻z氨酸S,具體為SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在具體制備時(shí)，可以采用定點(diǎn)突變、隨機(jī)突變或者人工合成等方法制備突變體。本發(fā)明還提供一種編碼上述的木聚糖酶突變體的編碼基因。由于基因的多態(tài)性，編碼同一蛋白質(zhì)的核苷酸序列可能有多條，任意一條能夠編碼上述木聚糖酶的核苷酸序列均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。進(jìn)一步，包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述編碼基因?yàn)镾EQIDNO.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種包括上述的比酶活提高的木聚糖酶突變體的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。重組載體既可以是表達(dá)載體也可以是克隆載體。在構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可以用現(xiàn)有的表達(dá)載體或者將現(xiàn)有的表達(dá)載體改造后用于構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的所述的木聚糖酶突變體的編碼基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。進(jìn)一步，將編碼上述的木聚糖酶突變體的編碼基因插入到出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)處獲得的重組載體。本發(fā)明還提供一種木聚糖酶突變體的生產(chǎn)方法,操作為：培養(yǎng)包括上述的木聚糖酶突變體的重組菌。后續(xù)的過程可以根據(jù)使用的要求進(jìn)行設(shè)置，例如，如果純度要求較高，可以進(jìn)行木聚糖酶突變體的純化等操作。本發(fā)明還提供一種上述的木聚糖酶突變體在降解木聚糖中的應(yīng)用。可以廣泛應(yīng)用于釀造、飼料、造紙紙漿、食品、紡織、能源等工業(yè)中。本發(fā)明還提供一種利用上述的木聚糖酶突變體降解木聚糖的方法，包括以下步驟：收集含有上述的木聚糖酶突變體的溶液作用于含有木聚糖的溶液，進(jìn)行降解，降解的條件為：溫度為30℃-60℃，pH為5.5-9.0。優(yōu)選地，降解的條件為：溫度為45-55℃，pH為7.5。采用上述方案的有益效果為：本發(fā)明所述的木聚糖酶突變體在30-60℃之間時(shí)，相對(duì)酶活均在60％以上，尤其是45-55℃相對(duì)酶活高于90％。本發(fā)明所述的木聚糖酶從pH5.5到pH9.0都維持50％左右及以上活性，最適反應(yīng)pH為7.5，具有良好的耐酸耐堿性條件能力。附圖說明圖1為大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩菌株破菌上清的結(jié)果；標(biāo)記1為XynHBN3大腸桿菌破菌上清；標(biāo)記2為XynHBN3217大腸桿菌破菌上清；標(biāo)記3為XynHBN3大腸桿菌HIS純化條帶；標(biāo)記4為XynHBN3217大腸桿菌HIS純化條帶。圖2為木聚糖酶xynHBN3217的DNA測序結(jié)果與xynHBN3的DNA序列比較的結(jié)果，其中Query為xynHBN3217基因序列，Sbjct為xynHBN3基因序列。圖3為木聚糖酶XynHBN3217最適反應(yīng)溫度的檢測結(jié)果。圖4為木聚糖酶XynHBN3最適反應(yīng)溫度的檢測結(jié)果。圖5為木聚糖酶XynHBN3217為60℃條件下熱穩(wěn)定性的檢測結(jié)果。圖6為木聚糖酶XynHBN3217最適pH值的檢測結(jié)果。圖7為木聚糖酶XynHBN3最適pH值的檢測結(jié)果。圖8為木聚糖酶XynHBN3217的pH穩(wěn)定性的檢測結(jié)果。圖9為木聚糖酶XynHBN3的pH穩(wěn)定性的檢測結(jié)果。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所述的材料和試劑等若無特別說明均可以通過市購或常規(guī)方法制備。本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法若如無特殊說明，均為常規(guī)方法。發(fā)明人從前期工作獲得的突變體XynHBN3編碼基因出發(fā)，通過隨機(jī)突變，獲得一個(gè)木聚糖酶比酶活提高2.8倍的突變體，最適反應(yīng)溫度由50℃提升為55℃，其他性質(zhì)變化不大。前期工作獲得的突變體XynHBN3已申請了發(fā)明專利并獲得了授權(quán)，專利授權(quán)號(hào)為ZL200610020049.9,公開號(hào)為CN1924002A，
專利名稱：為一種耐熱耐堿木聚糖酶酵母工程菌及其耐熱木聚糖酶的生產(chǎn)方法，申請人為湖北大學(xué)，發(fā)明人為張桂敏，馬立新。在本發(fā)明中，發(fā)明人采用易錯(cuò)PCR的定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)xynHBN3基因進(jìn)行隨機(jī)突變(xynHBN3基因的信息可以參照公開號(hào)為CN1924002A的專利文獻(xiàn))，利用突變的PCR產(chǎn)物與載體pET28a(購于美國Novagen公司)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建突變文庫。采用木聚糖酶活性篩選平板觀察水解圈的方法過對(duì)近2萬個(gè)重組子的篩選，幾輪粗篩后篩選出10個(gè)菌株，后進(jìn)行第二輪搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，菌體經(jīng)過破菌HIS純化后得到純化的重組蛋白測定比酶活，得到一株比酶活提高了2.8倍的木聚糖酶突變體XynHBN3217。測序分析表明木聚糖酶突變體基因xynHBN3217的核苷酸序列突變了4個(gè)位點(diǎn)，分別為：第105位A突變?yōu)镚，第124位A突變?yōu)镚，第153位A突變?yōu)镚，第445位A突變?yōu)門。造成兩個(gè)氨基酸突變，分別為：第42位天冬酰胺N突變?yōu)樘於彼酓，第149位蘇氨酸T突變?yōu)榻z氨酸S。下面通過實(shí)施例來具體介紹。實(shí)施例1易錯(cuò)PCR擴(kuò)增基因xynHBN3xynHBN3的信息可以參照專利公開號(hào)為CN1924002A的專利文獻(xiàn)；以質(zhì)粒pHBM130為模板(工業(yè)生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，可以為公眾所獲得,該質(zhì)粒上有木聚糖酶基因，具體信息詳見張桂敏博士論文《木聚糖酶基因的克隆、表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)研究》)，用引物18N3F(序列為：5’CGCGGATCCGCGGAAACG3’)和18N3R(序列為：5’ACGCGTCGACCTTTTATC3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物在基因的上游添加BamHI酶切位點(diǎn)，下游添加SalI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增條件為94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。1％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物后，BamHⅠ、SalⅠ雙酶切。同時(shí)將pET28a質(zhì)粒載體也采用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后，采用T4DNA連接酶將載體與片段連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-xynHBN3作為本發(fā)明的對(duì)照。以重組質(zhì)粒pET28a-xynHBN3為模板，用引物18N3F和18N3R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增過程中通過改變dNTP濃度、添加Mn2+、Mg2+等條件引入隨機(jī)誘變，擴(kuò)增反應(yīng)體系如下表：PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；91℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸45s，循環(huán)25次，72℃延伸10min。0.7％的瓊脂糖電泳跑膠檢測PCR產(chǎn)物，溶液回收試劑盒分別回收方案一和方案二的目的條帶，得到易錯(cuò)PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系采用下面的幾種方案：方案一：模板xynHBN3質(zhì)粒(50ng/μL)2.00μL引物18N3F(20μM)2.50μL引物18N3R(20μM)2.50μLdATP(10mM)2.00μLdCTP(10mM)2.00μLdGTP(10mM)1.80μLdTTP(100mM)1.26μLMgCl2(50mM)4.08μLBSA(0.1μg/μL)5.00μLNiTaqDNAPolymerase1.00μLMnCl2(5mM)10.00μL10×PCRBuffer(無Mg2+)10.00μLddH2O55.86μL方案二：本發(fā)明中，引物由南京金斯瑞公司合成；溶液回收試劑盒PlusDNAClean/ExtractionKit型號(hào)DP034P購于GeneMark公司；dATP(貨號(hào)4026)、dTTP(貨號(hào)4029)、dCTP(貨號(hào)4028)、dGTP(貨號(hào)4027)、BSA、MnCl2、MgCl2購自Takara公司；NiTaqDNAPolymerase、10×PCRBuffer(無Mg2+)(貨號(hào)301101)購自沙船生物科技發(fā)展有限公司(天津)。實(shí)施例2突變木聚糖酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、雙酶切質(zhì)粒載體與基因片段取5μg的pET28a載體與5μg易錯(cuò)PCR產(chǎn)物分別用SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，分5管酶切，每管體系如下：SalⅠ3μLBamHⅠ3μL10×digestionbuffer10μL易錯(cuò)PCR產(chǎn)物或pET28a載體1μgddH2OUpto100μL反應(yīng)體系置于1.5mL離心管管中，37℃水浴3h，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后，將載體與易錯(cuò)PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物要求A260/A230＞2.0，A260/A280≈1.8。2、重組質(zhì)粒連接將雙酶切回收后的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增的目的片段(簡寫為ep-PCRproduct)、雙酶切回收后的pET28a載體(雙酶切回收后的pET28a載體片段為5.3kb)，加入10×buffer和T4DNA連接酶，混勻，16℃過夜連接后溶液回收，用超純水洗脫，得到酶連接產(chǎn)物，將酶連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)Rosetta(DE3)。大腸桿菌Rosetta(DE3)源自Novagen公司。連接反應(yīng)體系如下：雙酶切回收后的ep-PCRproduct30μL雙酶切回收后的pET28a載體10μLT4DNALigase5μL10XT4DNALigasebuffer5μL大腸桿菌電轉(zhuǎn)化方法包括以下步驟：吸取1-2μL酶連接產(chǎn)物與制備好的大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)Rosetta(DE3)均勻混合，冰上靜止2min，再轉(zhuǎn)入提前冰預(yù)冷的1mm電轉(zhuǎn)杯中，選擇Bio-Rad電穿孔儀上的大腸桿菌電擊參數(shù)進(jìn)行電擊。電擊完畢后，立即加入200μL冰預(yù)冷的NZY培養(yǎng)基將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中，37℃溫育1h后將菌體懸液涂布于LK平板，將平板置于37℃培養(yǎng)。重復(fù)操作，獲得突變體文庫。本發(fā)明中，pET28a質(zhì)粒購自Novagen公司；SalⅠ、BamHⅠ、10×digestionbuffer、T4DNALigase、10XTDNALigasebuffer購自NEB公司。NZY培養(yǎng)基：1％NZamine(caseinhydrolysate)，0.5％酵母粉，0.5％氯化鈉，10mM氯化鎂，20mM葡萄糖。LK：1％蛋白胨，1％氯化鈉，0.5％酵母粉，固體平板加1.5％瓊脂，卡那霉素(Kan)為50μg/mL。實(shí)施例3木聚糖酶突變體庫的篩選實(shí)施例2中的重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化后共獲得了約20000株轉(zhuǎn)化子。將全部轉(zhuǎn)化子點(diǎn)至含有50μg/mL卡那青霉素抗性并涂布了20μL濃度為0.5mg/mL的IPTG的木聚糖酶活性篩選平板(0.5％交聯(lián)木聚糖，1％蛋白胨，1％氯化鈉，0.5％酵母粉，1.5％瓊脂)后，培養(yǎng)溫度為37℃，從中選取透明圈比原始菌株透明圈明顯較大的46株突變體。通過水解圈法初篩，再經(jīng)過大腸桿菌搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行復(fù)篩如圖1，最終篩選得到一株酶活最高的將其基因命名為xynHBN3217。交聯(lián)木聚糖制法可參考文獻(xiàn)：木聚糖酶XYNZG在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)及在面包烘焙中的應(yīng)用研究，戰(zhàn)飛祥，湖北大學(xué)，2014年。實(shí)施例4木聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將大腸桿菌突變體及原始菌株挑單菌落至5mLLB(含50μg/mLKan)中，37℃、220r/min恒溫過夜培養(yǎng)。按1％接種量轉(zhuǎn)接于100mLLB(含50μg/mLKan)中，37℃、220r/min培養(yǎng)至OD600＝0.6-0.8左右，加入終濃度為0.01mmol/L的IPTG，18℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，12h后離心取菌體，用PBS緩沖液重懸，超聲破碎后，離心，上清液即為胞內(nèi)酶液。蛋白純化按照Novagen公司的Ni-NTAHisBindResins的操作說明書進(jìn)行。實(shí)施例5木聚糖酶酶活測定步驟用重組大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)純化的酶液，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，取1.0mL經(jīng)50℃或55℃預(yù)熱平衡，加入到試管中，再加入50℃或55℃預(yù)熱的1.0mL1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))木聚糖底物，振蕩混勻，50℃或55℃反應(yīng)10min后，沸水浴5min終止酶解反應(yīng)，迅速冷卻至室溫后加入2.5mLDNS試劑，振蕩5s混勻后沸水浴加熱5min，迅速冷卻到室溫，最后加水定容至12.5mL。酶活力的計(jì)算參照下面的公式：XD=A×K+COM×t×1000×Df]]>上式中，各符號(hào)代表的含義如下：XD代表試樣木聚糖酶活力，U/mL；A代表測量的酶反應(yīng)液的吸光度OD540；K代表標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；CO代表標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；M代表木糖的摩爾質(zhì)量(150.2)；t代表酶解反應(yīng)時(shí)間，min；Df代表酶反應(yīng)液的總稀釋倍數(shù)；1000為轉(zhuǎn)化因子，1mmol＝1000μmol。1、最適反應(yīng)溫度的測定方法將酶液用50mMpH7.5的Tris-Hcl緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，按照木聚糖酶酶活測定步驟，在20-70℃之間，以5℃為梯度設(shè)置實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行酶促反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel分析。2、最適pH值的測定將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％木聚糖底物分別用不同pH的Buffer配制，并將酶液也稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，在最適溫度下按照木聚糖酶酶活測定步驟進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)采用了4種不同的緩沖液，它們分別是50mMHAc-NaAc緩沖液(pH5.0,pH5.4,pH5.8,pH6.2)、50mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8,pH6.2,pH6.6,pH7.0,pH7.5,pH8.0)、50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5,pH8.0,pH8.6,pH9.0)和50mMGly-NaOH緩沖液(pH8.6,pH9.0,pH9.4，pH9.8)，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel分析。3、pH穩(wěn)定性的測定方法將酶液分別用不同pH的緩沖液按適當(dāng)?shù)谋稊?shù)稀釋，放4℃靜置12h后，在最適溫度和最適pH的條件下測量殘余的酶活。4種不同的緩沖液，他們分別是50mMHAc-NaAc緩沖液(pH5.0,pH5.4,pH5.8,pH6.2)、50mM磷酸鈉緩沖液(pH5.8,pH6.2,pH6.6,pH7.0,pH7.5,pH8.0)、50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5,pH8.0,pH8.6,pH9.0)和50mMGly-NaOH緩沖液(pH8.6,pH9.0,pH9.4，pH9.8)，以初始酶活力為100％，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel分析。4、熱穩(wěn)定性的測定方法將酶液用最適pH的緩沖液(50mMTris-HCl緩沖液,pH7.5)適當(dāng)稀釋后，取樣，測定初始酶活力。其余酶液分別在60℃處理30min，每隔5min取樣。以初始酶活力為100％。每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel分析。實(shí)施例5xynHBN3217基因的序列分析將突變木聚糖酶基因片段xynHBN3217測序結(jié)果與出發(fā)菌株xynHBN3基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖2，由圖2可以看出木聚糖酶基因xynHBN3217序列有4個(gè)堿基發(fā)生突變，第105位堿基A突變?yōu)镚，第124位堿基A突變?yōu)镚，第153位堿基A突變?yōu)镚，第445位堿基A突變?yōu)門，導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸發(fā)生突變，第42位氨基酸N突變?yōu)镈，第149位氨基酸T突變?yōu)镾。實(shí)施例6木聚糖酶XynHBN3217的酶學(xué)性質(zhì)采用實(shí)施例3中的方法檢測木聚糖酶XynHBN3217的酶學(xué)性質(zhì)。1、木聚糖酶XynHBN3217的比酶活測定分別將XynHBN3217和XynHBN3純化的酶稀釋液于55℃和50℃分別預(yù)熱10min；按木聚糖酶酶活測定步驟測量木聚糖酶XynHBN3217和XynHBN3的酶活性,根據(jù)實(shí)施例3中木聚糖酶酶活力的計(jì)算公式，算出XynHBN3217和XynHBN3的純化酶液的酶活，最后根據(jù)測量的XynHBN3217和XynHBN3蛋白濃度，得到XynHBN3217和XynHBN3純化酶液的比酶活。如表1所示，可知經(jīng)His純化后，XynHBN3217的比酶活比XynHBN3的比酶活提高了2.8倍。結(jié)果表明，木聚糖酶XynHBN3217的第42位天冬酰胺N突變?yōu)樘於彼酓，第149位蘇氨酸T突變?yōu)榻z氨酸S，有助于該木聚糖酶比酶活的提高，詳細(xì)的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。同時(shí)這種木聚糖酶突變體在工業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用，會(huì)帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，如在紙漿漂白、紡織、面包烘焙中。表1突變體XynHBN3217和蛋白XynHBN3的比酶活(U/mg)2、木聚糖酶XynHBN3217最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性參照實(shí)施例3中的方法檢測木聚糖酶XynHBN3217最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性。在不同溫度下測定酶活，結(jié)果見圖3和圖4，由圖可知XynHBN3217的最適反應(yīng)溫度為55℃，與XynHBN3相比最適反應(yīng)溫度增加了5℃，在30-60℃之間時(shí)，相對(duì)酶活均在60％以上，尤其在45-55℃時(shí)，XynHBN3217的相對(duì)酶活高于90％，當(dāng)溫度高于55℃時(shí)，則酶活迅速下降。將酶在60℃下孵育30min，且每隔5min取一個(gè)樣，分別測量殘余酶活，結(jié)果如圖5顯示XynHBN3217在60℃以下較為穩(wěn)定，60℃下20min殘余酶活仍有50％，與測量的XynHBN3的熱穩(wěn)定性比較知，XynHBN3217熱穩(wěn)定性和XynHBN3相比，變化不大。3、木聚糖酶XynHBN3217最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性檢測采用實(shí)施例3中的方法檢測木聚糖酶XynHBN3217最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性。酶的反應(yīng)pH用不同的緩沖液體系調(diào)到5.0-9.8，在最適溫度55℃條件下測定木聚糖酶XynHBN3217的酶活力，結(jié)果如圖6所示，從圖6中可以看出，XynHBN3217的最適反應(yīng)pH為7.5，從pH5.5到pH9.0都維持50％左右及以上活性，與XynHBN3相比最適反應(yīng)pH(圖7)變化不大，但是在8.5的相對(duì)酶活XynHBN3217明顯高于XynHBN3。當(dāng)木聚糖酶XynHBN3217被同一濃度不同pH(5.0-9.8)的緩沖液稀釋后4℃放置12h檢測其剩余活性。如圖8所示，結(jié)果表明,12h后木聚糖酶XynHBN3217從pH5.0到pH9.0都維持50％以上的活性，與圖9測量的XynHBN3具有的pH穩(wěn)定性進(jìn)行比對(duì)，也可以看出XynHBN3217的pH穩(wěn)定性同樣高于XynHBN3。具有良好的耐酸耐堿性條件能力。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3