一種木聚糖酶及生產(chǎn)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種不產(chǎn)纖維素酶，可應(yīng)用于造紙工藝的木聚糖酶生產(chǎn)方法，其特征是它包括菌種培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、酶液制備步驟，所述菌種即沙福芽孢桿菌（Bacillussafensis），實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為KERR89，保藏號(hào)：CGMCCNO：5466，所述木聚糖酶為內(nèi)切型酶，不產(chǎn)纖維素酶，對(duì)結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素均沒(méi)有活性；酶活力在濃度5mMol/L以下，不受Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+金屬離子抑制；其酶作用pH范圍為pH4.5～10.5，溫度范圍為40℃～75℃；本發(fā)明的酶活力高，發(fā)酵木聚糖酶液≥30000u/ml，單位生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期短，工業(yè)化程度高，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單易控；產(chǎn)品對(duì)結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素均沒(méi)有活性，適合在造紙行業(yè)應(yīng)用，可降低造紙生產(chǎn)成本和環(huán)境污染，同時(shí)有助提高紙的產(chǎn)品品質(zhì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種木聚糖酶及生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)，具體地說(shuō)是一種木聚糖酶及生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]木聚糖酶包括內(nèi)切1.3~P~木聚糖酶(EC3.2.1.32)，內(nèi)切1.4~P~木聚糖酶(EC3.2.1.8)，木聚糖1.3~P~木糖苷酶(EC3.2.1.72)，木聚糖1.4~P~木糖苷酶 (EC3.2.1.37)和乙酰木聚糖酯酶(EC3.1.1.6)五種。內(nèi)切型木聚糖酶水解木聚糖生成木寡糖和木糖，外切型木聚糖酶水解木寡糖，由非還原末端切除木糖殘基。
[0003]木聚糖酶可用于造紙工業(yè)中的制漿和紙漿漂白等工序，它是基于酶作用植物細(xì)胞與細(xì)胞之間相粘連的中膠層中的木聚糖，木聚糖一經(jīng)分解，細(xì)胞與細(xì)胞便疏離或分開(kāi)，從而使堿等化學(xué)品易于起作用，因此降低了所用化學(xué)品的用量，使造紙廢水中的化學(xué)品污染物大大降低。但是，許多微生物在產(chǎn)木聚糖酶的同時(shí)，還產(chǎn)纖維素酶。這樣，在應(yīng)用中木聚糖酶不僅作用木聚糖，同時(shí)纖維素酶還作用纖維素，對(duì)纖維素有降解作用和對(duì)紙漿有毀壞作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種不產(chǎn)纖維素酶，可應(yīng)用于造紙工藝的木聚糖酶及生產(chǎn)方法。
[0005]本發(fā)明酶活力測(cè)定方法為，用pH值為9.0,0.lmol/L的甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液為溶劑配制2 %木聚糖(sigma來(lái)自于樺木產(chǎn)品)溶液。吸取0.9ml底物于15ml刻度試管中，在要求溫度水浴平衡3min,加入0.1ml適當(dāng)稀釋酶溶液,反應(yīng)10min,加入3ml 3, 5~ 二硝基水楊酸試劑，沸水浴中顯色15min,冷涼后用蒸懼水定容至15ml,分光光度計(jì)550nm 波長(zhǎng)測(cè)光吸收值。酶活力定義為，在測(cè)定條件下每小時(shí)水解底物產(chǎn)生Img還原糖(以木糖計(jì)，)所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位U)。
·[0006]本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)其發(fā)明目的的，一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，它包括菌種培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、酶液制備步驟，所述菌種即沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為KERR89，保藏號(hào)=CGMCC NO:5466，其生物學(xué)特性為:革蘭氏染色陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽孢，菌體呈短桿狀，單細(xì)胞直徑小于lum，以二分裂方式增殖；在本發(fā)明所述培養(yǎng)基上菌落呈圓形，白色、表面光滑，均一，邊緣整齊，略有光澤，黏稠。
[0007]本發(fā)明的菌種是在中國(guó)寧夏采集，在菌種選育篩選過(guò)程中，采用了試管液體培養(yǎng)基反應(yīng)DNS顯色初步定性篩選和搖瓶產(chǎn)酶定量篩選的方法,篩選出一株實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為 KERR89的高產(chǎn)菌株，根據(jù)主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合分析鑒定為沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis),該菌種已于2011年11月17日提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3 號(hào))，保藏號(hào):CGMCC NO:5466,并于同日提交了保藏存活證明。
[0008]本發(fā)明所述的菌種培養(yǎng)為CGMCC NO:5466菌種在如下配制的斜面上生長(zhǎng)良好，以重量計(jì)，斜面培養(yǎng)基配方為:蛋白胨0.5 %~I %、牛肉膏0.3 %~0.5 %、酵母膏0.3 %~ 0.5 %、葡萄糖0.3 %~0.5 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、瓊脂1.8 %~2.2 %、水94.8 %~ 96.5 %，其中所述各組分之和為100 %，調(diào)pH值6.9~7.1,0.1MPa滅菌20分鐘~30分鐘， 制成試管斜面，接種該菌種，32°C~35°C，培養(yǎng)24小時(shí)~26小時(shí)后，放入5°C冰箱中備用， 或向菌斜面上注入已滅菌液體石蠟后保藏或以脫脂牛奶為載體冷凍干燥真空封口保藏。
[0009]本發(fā)明所述的搖瓶發(fā)酵為CGMCC NO:5466菌種在規(guī)定的培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生高活性木聚糖酶，這種培養(yǎng)條件是:以重量計(jì)，培養(yǎng)基配方為麥麩5 %~8 %、纖維質(zhì)粉1.5 %~ 2 %、葡萄糖0.3 %~0.5 %、硫酸銨0.3 %~0.5 %、玉米漿I %~2 %、磷酸氫二鉀0.1 %~0.2 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、水86.3 %~91.5 %，其中所述各組分之和為100 %， 滅菌前，調(diào)pH值為8.0~8.5，0.1MPa滅菌20分鐘~35分鐘，培養(yǎng)條件:33°C~35°C，搖床轉(zhuǎn)速260 r/min~280r/min，培養(yǎng)48小時(shí)~52小時(shí)。
[0010]本發(fā)明所述的酶液制備為由茄瓶斜面到種子罐到發(fā)酵罐，二級(jí)發(fā)酵，制備標(biāo)準(zhǔn)化酶液。
[0011]本發(fā)明所述種子培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì)，麥麩5 %~8 %、玉米粉1.5 %~2 %、 硫酸銨0.3 %~0.5 %、玉米漿I %~2 %、磷酸氫二鉀0.1 %~0.2 %、氯化鈉0.3 %~ 0.5 %、水86.8 %~91.8 %，其中所述各組分之和為100 %，滅菌前，調(diào)pH值為6.5~7.0，
0.1MPa滅菌30分鐘~35分鐘，種子罐裝料總體積不超過(guò)70% ;培養(yǎng)條件:溫度33°C~ 38°C，攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min~220 r/min，通氣量以v/v計(jì):0小時(shí)~5小時(shí)，1:0.40~0.46， 5小時(shí)以后，1:0.50~0.56，罐壓0.06 MPa~0.07MPa,培養(yǎng)周期為7小時(shí)~9小時(shí)。
[0012]本發(fā)明所述產(chǎn)酶發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì),麥麩5 %~8 %、纖維質(zhì)粉
1.5 %~2 %、葡萄糖0.3~0.5 %、硫酸銨0.3 %~0.5 %、玉米漿I %~2 %、磷酸氫二鉀0.1 %~0.2 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、水86.3 %~91.5 %，其中所述各組分之和為 100 %，滅菌前，調(diào)pH值為8.0~8.5,0.1MPa滅菌30分鐘~35分鐘，裝料總體積不超過(guò)70 % ;培養(yǎng)條件:溫度33°C~38°C，攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min~220 r/min，通氣量以v/v計(jì):0小時(shí)~2小時(shí)，1:0.40~0.42，2小時(shí)~4小時(shí)，1:0.50~0.52，4小時(shí)~6小時(shí)，1:0.55~ 0.68，6小時(shí)以后1:0.60~0.62，罐壓0.06 MPa~0.07MPa，發(fā)酵周期為48小時(shí)~52小時(shí)。
[0013]本發(fā)明為促進(jìn)產(chǎn)酶，提高木聚糖酶`的活力，在產(chǎn)酶發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方中加入0.3 %~0.4 %的二水合氯化鈣，相應(yīng)減少水的用量，其中所述各組分之和為100 %，可顯著提高木聚糖酶活力，木聚糖酶活力由對(duì)照的34000u/ml增加到38000u/ml，提高11.76 %。
[0014]本發(fā)明在制備標(biāo)準(zhǔn)化酶液中，將產(chǎn)酶發(fā)酵罐的發(fā)酵醪液經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾、硅藻土除菌，經(jīng)防腐處理得到在15°C密封存放三個(gè)月條件下，酶活力保持率為95 %以上的標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶液。
[0015]本發(fā)明為去雜除菌，提高產(chǎn)品質(zhì)量，發(fā)酵醪液經(jīng)板框過(guò)濾后，在發(fā)酵濾液中加入十二水合磷酸氫二鈉和二水合氯化鈣取雜除菌，其用量分別為發(fā)酵濾液質(zhì)量的2.8 %~
3.5 %和 1.0 % ~1.3 %。
[0016]一種如上述方法生產(chǎn)的木聚糖酶，所述木聚糖酶為內(nèi)切型酶，不產(chǎn)纖維素酶，對(duì)結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素均沒(méi)有活性；酶活力在濃度5mMol/L以下，不受Fe2+、Fe3+、Zn2+、 Cu2+金屬離子抑制；其酶作用pH范圍為pH4.5~10.5，溫度范圍為40°C~75°C ;適宜pH范圍為pH7.0~9.0，適宜溫度范圍為45°C~65°C;最適pH范圍為pH8.5~9.0，最適溫度 50°C~55°C。
[0017]由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明較好的實(shí)現(xiàn)了發(fā)明目的，其酶活力高，發(fā)酵木聚糖酶液>30000 u/ml，單位生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期短，工業(yè)化程度高，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單易控；產(chǎn)品對(duì)結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素均沒(méi)有活性，適合在造紙行業(yè)應(yīng)用，可降低造紙生產(chǎn)成本和環(huán)境污染，同時(shí)有助提聞紙的廣品品質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0019]一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，它包括菌種培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、酶液制備步驟，所述菌種即沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為KERR89，保藏號(hào):CGMCC N0:5466，其生物學(xué)特性為:革蘭氏染色陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽孢，菌體呈短桿狀，單細(xì)胞直徑小于lum，以二分裂方式增殖；；在本發(fā)明所述培養(yǎng)基上菌落呈圓形，白色、表面光滑，均一，邊緣整齊，略有光澤，黏稠。
[0020]本發(fā)明的菌種是在中國(guó)寧夏采集，在菌種選育篩選過(guò)程中，采用了試管液體培養(yǎng)基反應(yīng)DNS顯色初步定性篩選和搖瓶產(chǎn)酶定量篩選的方法,篩選出一株實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為 KERR89的高產(chǎn)菌株，根據(jù)主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合分析鑒定為沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis),該菌種已于2011年11月17日提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3 號(hào))，保藏號(hào):CGMCC NO:5466,并于同日提交了保藏存活證明。
[0021]本發(fā)明所述的菌種培養(yǎng)為CGMCC NO:5466菌種在如下配制的斜面上生長(zhǎng)良好，以重量計(jì)，斜面培養(yǎng)基配方為:蛋白胨0.5 %~I %、牛肉膏0.3 %~0.5 %、酵母膏0.3 %~
0.5 %、葡萄糖0.3 %~0.5 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、瓊脂1.8 %~2.2 %、水94.8 %~ 96.5 %，其中所述各組分之和為100 %，調(diào)pH值6.9~7.1，0.1MPa滅菌20分鐘~30分鐘， 制成試管斜面，接種該菌種，32°C~35°C，培養(yǎng)24小時(shí)~26小時(shí)后，放入5°C冰箱中備用， 或向菌斜面上注入已滅菌液體石蠟后保藏或以脫脂牛奶為載體冷凍干燥真空封口保藏。
[0022]本實(shí)施例斜面培養(yǎng)基配方為:蛋白胨0.8 %、牛肉膏0.4 %、酵母膏0.4 %、葡萄糖
0.4 %、氯化鈉0.4 %、瓊脂2.0 %、水96 %，其中所述各組分之和為100 % ;用氫氧化鈉調(diào) pH值7.0，0.1MPa滅菌30分鐘，制成試管斜面，接種該菌種，34°C，培養(yǎng)24小時(shí)后，放入5°C 冰箱中冷臧備用。
[0023]該斜面菌種通過(guò)搖瓶發(fā)酵檢驗(yàn)菌種產(chǎn)酶能力合格后，可以作為種子擴(kuò)培使用或發(fā)酵產(chǎn)酶使用。
[0024]本發(fā)明所述的搖瓶發(fā)酵為CGMCC NO:5466菌種在規(guī)定的培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生高活性木聚糖酶，這種培養(yǎng)條件是:以重量計(jì)，培養(yǎng)基配方為麥麩5 %~8 %、纖維質(zhì)粉1.5 %~ 2 %、葡萄糖0.3 %~0.5 %、硫酸銨0.3 %~0.5 %、玉米漿I %~2 %、磷酸氫二鉀0.1 %~0.2 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、水86.3 %~91.5 %，其中所述各組分之和為100 %， 滅菌前，調(diào)PH值為8.0~8.5，0.1MPa滅菌20分鐘~35分鐘，培養(yǎng)條件:33°C~35°C，搖床轉(zhuǎn)速260 r/min~280r/min，培養(yǎng)48小時(shí)~52小時(shí)。
[0025]本實(shí)施例培養(yǎng)基配方為麥麩6 %、纖維質(zhì)粉1.5 %、葡萄糖0.4 %、硫酸銨0.4 %、玉米漿1.5 %、磷酸氫二鉀0.1 %、氯化鈉0.4 %、水89.7 %，其中所述各組分之和為100 %，滅菌前，用I %碳酸鈉溶液調(diào)PH值為8.0，0.1MPa滅菌25分鐘，培養(yǎng)條件:33°C，搖床轉(zhuǎn)速280 r/min,培養(yǎng)48小時(shí)。
[0026]本發(fā)明所述的酶液制備為由茄瓶斜面到種子罐到發(fā)酵罐，二級(jí)發(fā)酵，制備標(biāo)準(zhǔn)化酶液。
[0027]本發(fā)明所述種子培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì)，麥麩5 %~8 %、玉米粉1.5 %~2 %、 硫酸銨0.3 %~0.5 %、玉米漿1 %~2 %、磷酸氫二鉀0.1 %~0.2 %、氯化鈉0.3 %~
0.5 %、水86.8 %~91.8 %，其中所述各組分之和為100 %，滅菌前，調(diào)pH值為6.5~7.0，
0.1MPa滅菌30分鐘~35分鐘，種子罐裝料總體積不超過(guò)70% ;培養(yǎng)條件:溫度33°C~ 38°C，攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min~220 r/min，通氣量以v/v計(jì):0小時(shí)~5小時(shí)，1:0.40~0.46， 5小時(shí)以后，1:0.50~0.56，罐壓0.06 MPa~0.07MPa,培養(yǎng)周期為7小時(shí)~9小時(shí)。
[0028]本實(shí)施例種子培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì)，麥麩6 %、玉米粉2 %、硫酸銨0.4 %、玉米漿I %、磷酸氫二鉀0.2 %、氯化鈉0.4 %、水90.0 %，其中所述各組分之和為100 %，滅菌前，調(diào)PH值為7.0,0.1MPa滅菌30分鐘，種子罐裝料總體積不超過(guò)70%;培養(yǎng)條件:溫度 36°C，攪拌轉(zhuǎn)速220 r/min，通氣量以v/v計(jì):0小時(shí)~5小時(shí)，1:0.40，5小時(shí)以后，1:0.50， 罐壓0.06 MPa~0.07MPa，培養(yǎng)周期為8小時(shí)。在培養(yǎng)4h后取樣鏡檢，觀察菌生長(zhǎng)發(fā)育，繁殖情況。當(dāng)培養(yǎng)到菌體細(xì)胞鏈70 %斷裂為單個(gè)細(xì)胞，酶活力600u/ml左右，表明種子已接近成熟，做好轉(zhuǎn)罐接種的各項(xiàng)準(zhǔn)備工作。
[0029]本發(fā)明所述產(chǎn)酶發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì),麥麩5 %~8 %、纖維質(zhì)粉
1.5 %~2 %、葡萄糖0.3~0.5 %、硫酸銨0.3 %~0.5 %、玉米漿I %~2 %、磷酸氫二鉀0.1 %~0.2 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、水86.3 %~91.5 %，其中所述各組分之和為 100 %，滅菌前，調(diào)pH值為8.0~8.5，0.1MPa滅菌30分鐘~35分鐘，裝料總體積不超過(guò)70 % ;培養(yǎng)條件:溫度33°C~38°C，攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min~220 r/min，通氣量以v/v計(jì):0小時(shí)~2小時(shí)，1:0.40~0.42，2小時(shí)~4小時(shí)，1:0.50~0.52，4小時(shí)~6小時(shí)，1:0.55~
0.68，6小時(shí)以后1:0.60~0.62，罐壓0.06 MPa~0.07MPa,發(fā)酵周期為48小時(shí)~52小時(shí)。
[0030]本實(shí)施例產(chǎn)酶發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì),麥麩6 %、纖維質(zhì)粉1.5 %、葡萄糖0.4 %、硫酸銨0.4 %、玉米漿I %、磷酸氫二鉀0.2 %、氯化鈉0.4 %、水90.1 %，其中所述各組分之和為100 %，滅菌前，調(diào)pH值為8.0，0.1MPa滅菌30分鐘，裝料總體積不超過(guò)70 % ;培養(yǎng)條件:溫度35°C，攪拌轉(zhuǎn)速220 r/min，通氣量以v/v計(jì):0小時(shí)~2小時(shí)，1:0.40， 2小時(shí)~4小時(shí)，1:0.50，4小時(shí)~6小時(shí)，1:0.55，6小時(shí)以后1:0.60，罐壓0.06 MPa,發(fā)酵周期為48小時(shí)。前16h每隔4h取一次樣，16h后每隔2h取一次樣。鏡檢觀察菌生長(zhǎng)狀態(tài)， 測(cè)定pH、還原糖和酶活力。其木聚糖酶活力最高可達(dá)到36000u/ml，平均水平可達(dá)31000u/ ml以上。
[0031]放罐條件:罐溫不再上升，酶活力不再增加；pH8.5左右；細(xì)胞95%以上出現(xiàn)芽孢， 并有部分自溶。將發(fā)酵醪液PH調(diào)至7.0左右。濾液酶活力32000u/ml。
[0032]本發(fā)明為促進(jìn)產(chǎn)酶，提高木聚糖酶的活力，在產(chǎn)酶發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方中加入0.3 %~0.4 %的二水合氯化鈣(本實(shí)施例為0.3 % )，相應(yīng)減少水的用量，其中所述各組分之和為100 %，可顯著提高木聚糖酶活力，木聚糖酶活力由對(duì)照的34000u/ml增加到38000u/ml，提聞 11.76 9?。
[0033]本發(fā)明在制備標(biāo)準(zhǔn)化酶液中，將產(chǎn)酶發(fā)酵罐的發(fā)酵醪液經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾、硅藻土除菌，經(jīng)防腐處理得到在15°C密封存放三個(gè)月條件下，酶活力保持率為95 %以上的標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶液。
[0034]本發(fā)明為去雜除菌，提高產(chǎn)品質(zhì)量，發(fā)酵醪液經(jīng)板框過(guò)濾后，在發(fā)酵濾液中加入十二水合磷酸氫二鈉和二水合氯化鈣取雜除菌，其用量分別為發(fā)酵濾液質(zhì)量的2.8 %~
3.5 % (本實(shí)施例為3.2 % )和1.0 %~1.3 % (本實(shí)施例為1.2%)。
[0035]本發(fā)明也可使用其它無(wú)機(jī)鹽組合替代，例如硫酸鈉與二水合氯化鈣組合。
[0036]本發(fā)明所述的CGMCC NO:5466菌種可利用多種碳、氮源產(chǎn)酶。所述的碳源如麥麩、 玉米軸粉、玉米秸桿粉、稻草粉、玉米油渣、纖維質(zhì)粉、花生外殼粉等，可單獨(dú)或混合用。所述的氮源如無(wú)機(jī)氮中的硫酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨等生理酸性鹽，硝酸鈉生理堿性鹽，硝酸銨生理中性鹽；尿素、玉米漿、玉米漿粉、玉米蛋白粉、大豆蛋白粉、大豆蛋白胨、魚(yú)蛋白胨、 酵母膏、酵母粉、牛肉膏等有機(jī)氮，可單獨(dú)或混合用。
[0037]—種如上述方法生產(chǎn)的木聚糖酶，所述木聚糖酶為內(nèi)切型酶，不產(chǎn)纖維素酶，對(duì)結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素均沒(méi)有活性；酶活力在濃度5mMol/L以下，不受Fe2+、Fe3+、Zn2+、 Cu2+金屬離子抑制；其酶作用pH范圍為pH4.5~10.5，溫度范圍為40°C~75°C ;適宜pH 范圍為pH7.0~9.0，適宜溫度范圍為45°C~65°C;最適pH范圍為pH8.5~9.0，最適溫度 50°C~55°C。
[0038]現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，銅對(duì)酶活性的抑制是強(qiáng)烈的。而本發(fā)明木聚糖酶的酶活性不受濃度高達(dá)5mmol/L的CU2+所抑制。
[0039]同時(shí)，本發(fā)明木聚糖酶不含纖維素酶活性，酶活力高，產(chǎn)酶時(shí)還可產(chǎn)生少量過(guò)氧化氫酶，其作用溫度和PH適合在造紙行業(yè)應(yīng)用，可降低造紙生產(chǎn)成本和環(huán)境污染，有助提高紙的廣品品質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征是它包括菌種培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、酶液制備步驟，所述菌種即沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為KERR89，保藏號(hào):CGMCC NO: 5466，其生物學(xué)特性為:革蘭氏染色陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽孢，菌體呈短桿狀，單細(xì)胞直徑小于lum， 以二分裂方式增殖；在本發(fā)明所述培養(yǎng)基上菌落呈圓形，白色、表面光滑，均一，邊緣整齊， 略有光澤，黏稠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征是所述的菌種培養(yǎng)為 CGMCC NO:5466菌種在如下配制的斜面上生長(zhǎng)良好，以重量計(jì)，斜面培養(yǎng)基配方為:蛋白胨 0.5 %~I %、牛肉膏0.3 %~0.5 %、酵母膏0.3 %~0.5 %、葡萄糖0.3 %~0.5 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、瓊脂1.8 %~2.2 %、水94.8 %~96.5 %，其中所述各組分之和為 100 %，調(diào)pH值6.9~7.1,0.1MPa滅菌20分鐘~30分鐘，制成試管斜面，接種該菌種， 32°C~35°C，培養(yǎng)24小時(shí)~26小時(shí)后，放入5°C冰箱中備用，或向菌斜面上注入已滅菌液體石蠟后保藏或以脫脂牛奶為載體冷凍干燥真空封口保藏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征是所述的搖瓶發(fā)酵為 CGMCC NO:5466菌種在規(guī)定的培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生高活性木聚糖酶，這種培養(yǎng)條件是:以重量計(jì)，培養(yǎng)基配方為麥麩5 %~8 %、纖維質(zhì)粉1.5 %~2 %、葡萄糖0.3 %~0.5 %、硫酸銨0.3 %~0.5 %、玉米漿I %~2 %、磷酸氫二鉀0.1 %~0.2 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、水86.3 %~91.5 %，其中所述各組分之和為100 %，滅菌前，調(diào)pH值為8.0~8.5， 0.1MPa滅菌20分鐘~35分鐘，培養(yǎng)條件:33°C~35°C，搖床轉(zhuǎn)速260 r/min~280r/min， 培養(yǎng)48小時(shí)~52小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征是所述的酶液制備為由茄瓶斜面到種子罐到發(fā)酵罐，二級(jí)發(fā)酵，制備標(biāo)準(zhǔn)化酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征是種子培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì)，麥麩5 %~8 %、玉米粉1.5 %~2 %、硫酸銨0.3 %~0.5 %、玉米漿I %~2 %、磷酸氫二鉀0.1 %~0.2 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、水86.8 %~91.8 % ,其中所述各組分之和為100 %，滅菌前，調(diào)pH值為6.5~7.0，0.1MPa滅菌30分鐘~35分鐘，種子罐裝料總體積不超過(guò)70% ;培養(yǎng)條件:溫度33°C~38°C，攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min~220 r/min, 通氣量以v/v計(jì):0小時(shí)~5小時(shí)，1:0.40~0.46，5小時(shí)以后，1:0.50~0.56，罐壓0.06 MPa~0.07MPa，培養(yǎng)周期為7小時(shí)~9小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述·的一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征是產(chǎn)酶發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì)，麥麩5 %~8 %、纖維質(zhì)粉1.5 %~2 %、葡萄糖0.3~0.5 %、硫酸銨 0.3 %~0.5 %、玉米漿I %~2 %、磷酸氫二鉀0.1 %~0.2 %、氯化鈉0.3 %~0.5 %、 水86.3 %~91.5 %，其中所述各組分之和為100 %，滅菌前，調(diào)pH值為8.0~8.5，0.1MPa 滅菌30分鐘~35分鐘，裝料總體積不超過(guò)70 % ;培養(yǎng)條件:溫度33°C~38°C，攪拌轉(zhuǎn)速 180 r/min~220 r/min，通氣量以v/v計(jì):0小時(shí)~2小時(shí)，1:0.40~0.42，2小時(shí)~4小時(shí)，1:0.50~0.52，4小時(shí)~6小時(shí)，1:0.55~0.68，6小時(shí)以后1:0.60~0.62，罐壓0.06 MPa~0.07MPa，發(fā)酵周期為48小時(shí)~52小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征是在產(chǎn)酶發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方中加入0.3 %~0.4 %的二水合氯化鈣，相應(yīng)減少水的用量，其中所述各組分之和為 100 %。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征是在制備標(biāo)準(zhǔn)化酶液中， 將產(chǎn)酶發(fā)酵罐的發(fā)酵醪液經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾、硅藻土除菌，經(jīng)防腐處理得到在15°C密封存放三個(gè)月條件下，酶活力保持率為95 %以上的標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種木聚糖酶的生產(chǎn)方法，其特征是發(fā)酵醪液經(jīng)板框過(guò)濾后，在發(fā)酵濾液中加入十二水合磷酸氫二鈉和二水合氯化鈣取雜除菌，其用量分別為發(fā)酵濾液質(zhì)量的2.8 %~3.5 %和1.0 %~1.3 %。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述方法生產(chǎn)的木聚糖酶，其特征是所述木聚糖酶為內(nèi)切型酶，不產(chǎn)纖維素酶，對(duì)結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素均沒(méi)有活性；酶活力在濃度5mMol/L以下， 不受Fe2+ 'Fe3+、Zn2+、Cu2+金屬離子抑制；其酶作用pH范圍為pH4.5~10.5，溫度范圍為 40°C~75°C ;適宜pH范圍為pH7.0~9.0，適宜溫度范圍為45°C~65°C ;最適pH范圍為 pH8.5~9.0，最適溫度50°C~55°C。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK103571811SQ201310490355
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月19日
【發(fā)明者】李忠興, 楊忠義 申請(qǐng)人:沅江浣溪沙酶技術(shù)有限公司