本發(fā)明涉及基因工程學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種重組鴿圓環(huán)病毒Cap蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)及該蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鴿圓環(huán)病毒(Pigeoncircovrius，PiCV)感染是一種接觸性傳染病和免疫抑制病，主要侵害幼鴿。鴿圓環(huán)病毒感染于1993年首次報(bào)道于美國(guó)，此后，加拿大、澳大利亞、英國(guó)、德國(guó)、比利時(shí)、意大利以及法國(guó)均有報(bào)道。鴿子感染后可以使鴿子出現(xiàn)昏睡、嗜眠、厭食、體重減輕、呼吸窘迫等癥狀，該病毒作為20世紀(jì)90年代新發(fā)現(xiàn)的一種病毒，其所導(dǎo)致的疾病已經(jīng)給養(yǎng)鴿業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，鴿圓環(huán)病毒的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，而且國(guó)內(nèi)外關(guān)于此病的研究相對(duì)較少，PiCV在中國(guó)鴿群的檢出引起了獸醫(yī)工作者的廣泛關(guān)注，加強(qiáng)有關(guān)研究及檢測(cè)、防疫工作顯得非常有必要。PiCV的Cap蛋白是其PiCV病毒的核衣殼蛋白具有抗原性，是病毒抗原的主要成分。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)PiCV的Cap蛋白研究較少，主要只是對(duì)不同株的PiCV的Cap蛋白序列進(jìn)行差異分析。而Cap蛋白表達(dá)方面目前主要基于大腸桿菌系統(tǒng)原核表達(dá)。由于原核表達(dá)的蛋白多為包涵體，且后續(xù)不能對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行相關(guān)修飾，如糖基化，甲基化等。因原核表達(dá)的Cap蛋白與天然病毒的Cap蛋白相差甚大，不利于對(duì)Cap蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中Cap蛋白原核表達(dá)的蛋白活性遠(yuǎn)低于天然蛋白活性，不利于對(duì)Cap蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性研究，制備的疫苗免疫原性差等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種重組鴿圓環(huán)病毒Cap蛋白及其表達(dá)方法。需要說(shuō)明的是：本發(fā)明中所述的桿粒，即桿狀病毒質(zhì)粒，英文全稱為 Baculovirusplasmid，其英文縮寫為Bacmid，是指帶有桿狀病毒基因組的質(zhì)粒，可在細(xì)菌和昆蟲細(xì)胞之間進(jìn)行穿梭。重組桿粒是指采用基因工程技術(shù)手段將外源基因構(gòu)建入桿粒而形成的重組桿粒。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種鴿圓環(huán)病毒Cap基因，所述Cap基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明在另一方面提供一種重組Cap蛋白，所述Cap蛋白是由如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的Cap基因在昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)得到的。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明再一方面提供一種鴿圓環(huán)病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因重組質(zhì)粒pET-30C-Picv-Cap，所述重組質(zhì)粒的保藏號(hào)為CGMCCNO.11184；保藏時(shí)間：2015年9月7日；保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明再一方面提供一種表達(dá)重組鴿圓環(huán)病毒Cap蛋白的方法，包括：對(duì)包含鴿圓環(huán)病毒PiCV-zj1的全基因組核苷酸序列設(shè)計(jì)引物及鴿圓環(huán)病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因重組質(zhì)粒為模板的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)處理，得到含有鴿圓環(huán)病毒Cap基因的PCR產(chǎn)物；將所述含有鴿圓環(huán)病毒Cap基因的PCR產(chǎn)物克隆到昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)中，得到用于表達(dá)重組鴿圓環(huán)病毒Cap蛋白的重組桿狀病毒。特別是，所述的鴿圓環(huán)病毒PiCV-zj1毒株的NCBI登錄號(hào)：DQ090945。尤其是，所述的將所述含有鴿圓環(huán)病毒Cap基因的PCR產(chǎn)物克隆到昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)中，得到用于表達(dá)重組鴿圓環(huán)病毒Cap蛋白的重組桿狀病毒的步驟包括：利用所述含有鴿圓環(huán)病毒Cap基因的PCR產(chǎn)物構(gòu)建得到含有Cap基因片段重組質(zhì)粒pF-CP中，將含有Cap基因片段的重組質(zhì)粒pF-CP轉(zhuǎn)化到DH10Bac中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到具有卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素抗性的重組桿粒rBacmid-CP；將具有Cap基因片段的重組桿粒轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)進(jìn)行重組 病毒滴度測(cè)定試驗(yàn)和用IFA與westernblot實(shí)驗(yàn)鑒定所述表達(dá)得到的產(chǎn)物后，得到能夠正常表達(dá)重組鴿圓環(huán)病毒Cap蛋白的重組桿狀病毒。尤其是，其中所述引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，具體為：Cap-F：5’-TAAGAATTCCGCTTTATTCACTTTCC-3’；Cap-R：5’-ATACTCGAGCGTCGCAAGGACAAG-3’。特別是，所述昆蟲細(xì)胞選自sf9、sf21中的一種。特別是，該正常表達(dá)重組Cap蛋白的重組桿狀病毒的滴度測(cè)定結(jié)果能達(dá)到1×105。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明再一方面還提供一種重組鴿圓環(huán)病毒Cap蛋白用于制備鴿圓環(huán)病毒亞單位疫苗的用途，包括：將鴿圓環(huán)病毒Cap蛋白進(jìn)行純化并進(jìn)一步用來(lái)制備鴿圓環(huán)病毒亞單位疫苗。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明再一方面還提供一種重組鴿圓環(huán)病毒Cap蛋白用于制備檢測(cè)鴿圓環(huán)病毒的Elisa試劑盒的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：1、桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組Cap蛋白相比現(xiàn)有技術(shù)表達(dá)的原核蛋白更接近天然蛋白，有更好的生物活性。桿狀病毒擁有眾多優(yōu)點(diǎn)，桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后，昆蟲細(xì)胞對(duì)外源蛋白進(jìn)行相應(yīng)的加工修飾，對(duì)這些加工包括?；?、糖基化、磷酸化以及蛋白的折疊作用，表達(dá)的產(chǎn)物具有良好的生物學(xué)活性。2、由于桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組Cap蛋白具有空間構(gòu)型，更接近天然的PiCV的Cap蛋白構(gòu)象，可用來(lái)研究PiCV的Cap蛋白結(jié)構(gòu)解析。此外，Cap蛋白在致病性和誘導(dǎo)機(jī)體保護(hù)性免疫應(yīng)答起重要作用?？衫脳U狀病毒表達(dá)的Cap蛋白開發(fā)為鴿圓環(huán)病毒亞單位疫苗或者用于檢測(cè)試劑盒的研制。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例中Cap基因的擴(kuò)增結(jié)果圖。其中，第一泳道PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，第二泳道為DL2000DNAMarker；圖2是本發(fā)明實(shí)施例中重組質(zhì)粒pF-CP酶切鑒定。其中，第一泳道為DL5000DNAMarker，第二泳道為重組質(zhì)粒pF-CP雙酶切產(chǎn)物pF-CP/EcoRI+XhoI；圖3是本發(fā)明實(shí)施例中rBacmid-CP的PCR鑒定結(jié)果圖。其中，第一泳道 rBacmid-CP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，第二泳道為未插入外源基因的Bacmid的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，第三泳道DL2000DNAMarker；圖4是本發(fā)明實(shí)施例中重組桿狀病毒感染的細(xì)胞病變(×100)。其中，圖片1重組桿狀病毒感染的sf9細(xì)胞，圖片2為正常sf9細(xì)胞；圖5是本發(fā)明實(shí)施例中Westernblot表達(dá)產(chǎn)物的分析。其中，第一泳道為M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，第二泳道為正常的sf9細(xì)胞上清，第三泳道為Bacmid轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞上清，第4-5泳道為rbacmind-CP轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞上清；圖6是本發(fā)明實(shí)施例中IFA檢測(cè)結(jié)果(×100)。其中，圖片1為rbacmid-CP轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，圖片2為Bacimd轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，圖片3為正常的sf9細(xì)胞。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料：鴿圓環(huán)病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因重組質(zhì)粒pET-30C-Picv-Cap(內(nèi)蒙古金凱默生物科技公司)，所述重組質(zhì)粒的保藏號(hào)為CGMCCNO.11184；保藏時(shí)間：2015年9月7日；保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；BL21感受態(tài)細(xì)胞和DH5α感受態(tài)細(xì)胞(內(nèi)蒙古金凱默生物科技有限公司)；感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH10Bac菌株(Invitrogen公司)；草地貪夜蛾細(xì)胞(Spodopterafrugiperda9，Sf9)(Invitrogen公司)；昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMHTB(Invitrogen公司)。試劑：氯仿、無(wú)水乙醇(均北京化工廠)；Tris-飽和酚、SDS十二烷基硫酸鈉(均北京索萊寶科技有限公司)；胃蛋白酶K(sigma公司)；ExTaqDNA聚合酶(5U/μL)、dNTP、MgCl2、10×Buffer、各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒、氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、IPTG、X-gal(均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)；DNAMarkerDL2000、DNAMarkerDL5000、蛋白質(zhì)Marker(均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)；限制性內(nèi)切酶ECORI、XholI(購(gòu)自NEB)；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(購(gòu)自天根科技有限公司)；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；抗His單抗(Anti-HisTagMonoclonalAntibody，購(gòu)自北京澤溪源生物科技有限公司)；轉(zhuǎn)染試劑CellfectinReagentII(貨號(hào)：10362-010)、Sf9/sf21昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(無(wú)血清培養(yǎng)基Sf-900IISFM)(均購(gòu)自Invitrogen公司)。1、引物的設(shè)計(jì)與合成1.1鴿圓環(huán)病毒引物的設(shè)計(jì)根據(jù)鴿圓環(huán)病毒PiCV-zj1(NCBI登錄號(hào)：DQ090945)全基因組核苷酸序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對(duì)1：Cap-F：5’-TAAGAATTCCGCTTTATTCACTTTCC-3’；Cap-R：5’-ATACTCGAGCGTCGCAAGGACAAG-3’；該引物用于擴(kuò)增PicvCap基因完整的ORF，分別含EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)。1.2通用引物的設(shè)計(jì)通用引物M13序列參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使用手冊(cè)設(shè)計(jì)，得到通用引物對(duì)2：F-5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；R-5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’；上述所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。2、Cap基因的擴(kuò)增以鴿圓環(huán)病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因重組質(zhì)粒pET-30C-Picv-Cap為模板，以擴(kuò)增引物對(duì)1為反應(yīng)的引物，按50μL常規(guī)反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，所述重組質(zhì)粒pET-30C-Picv-Cap的保藏號(hào)為CGMCCNO.11184；保藏時(shí)間：2015年9月7日；保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。Cap基因的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：將上述體系混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)的擴(kuò)增條件為：95℃5min；95℃1min，50℃50s，72℃1min，共32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。全部反應(yīng)結(jié)束后，取5uLPCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，鴿圓環(huán)病毒Cap基因大小為860bp，與預(yù)期結(jié)果一致。3、重組質(zhì)粒pF-CP的構(gòu)建3.1目的基因片段的酶切反應(yīng)將步驟2得到的PCR產(chǎn)物和載體pFastBacTMHTB分別用EcoRI和XhoI酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，其中酶切體系如下：對(duì)PCR產(chǎn)物的酶切體系：對(duì)載體pFastBacTMHTB的酶切體系：將上述酶切反應(yīng)體系加入到PCR反應(yīng)管中，瞬時(shí)離心混勻后，37℃酶切4h，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離，在紫外燈的照射下快速切下包含有目的基因片段的膠塊，采用Takara膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，操作方法按照其操作說(shuō)明書進(jìn)行，得到Cap基因酶切片段和載體酶切片段。3.2目的基因酶切片段的連接反應(yīng)與重組質(zhì)粒pF-CP菌液的獲得將得到Cap基因片段與載體pFastBacTMHTB進(jìn)行連接反應(yīng)，其中，連接反應(yīng)體系是：將連接反應(yīng)體系加入到PCR反應(yīng)管，于16℃連接過(guò)夜，得到連接產(chǎn)物。隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，再將含有連接產(chǎn)物的DH5α感受態(tài)細(xì)胞涂于含Amp(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，挑取陽(yáng)性菌落接種LB培養(yǎng)液，37℃搖蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到含有重組質(zhì)粒pF-CP的菌液。3.3重組質(zhì)粒pF-CP的鑒定3.3.1重組質(zhì)粒pF-CP的酶切鑒定將步驟3.2得到的重組質(zhì)粒pF-CP的菌液進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，得到重組質(zhì)粒pF-CP，抽提操作步驟按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》上的堿裂解法提取，提取的重組質(zhì)粒pF-CP用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系如下：反應(yīng)條件：反應(yīng)的擴(kuò)增條件為：95℃5min；95℃1min，50℃50s，72℃1min，共32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。全部反應(yīng)結(jié)束后，取5uLPCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，未插入外源基因的空BacmidDNA擴(kuò)增出目的基因分子量大小為300bp；而重組桿粒rBacmid-CP擴(kuò)增出目的條帶的分子量大小約為3290bp，表明成功構(gòu)建重組桿狀病毒rBacmid-CP。5、重組桿狀病毒的獲得與Cap蛋白的表達(dá)根據(jù)Invitrogen公司的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)說(shuō)明書提供的方法將步驟4.1所提取的重組桿粒rBacmid-CP轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9昆蟲細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立野生型桿狀病毒(AcMNPV)感染的Sf9細(xì)胞和正常的sf9細(xì)胞作為對(duì)照。72h后收集上述細(xì)胞上清為P1代病毒液，對(duì)P1代病毒液進(jìn)行2次傳代擴(kuò)增后，P3代重組桿狀病毒的細(xì)胞病變觀察見(jiàn)圖4，可見(jiàn)病變細(xì)胞明顯膨大和單層細(xì)胞的脫落。對(duì)做擴(kuò)增的重組昆蟲桿狀病毒進(jìn)行TCID50檢測(cè)，步驟如下：將Sf9細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，生長(zhǎng)至密度為70％時(shí)，對(duì)sf9細(xì)胞進(jìn)行接毒后多次傳代培養(yǎng)：取P1、P2、P3、P4、P5代病毒液，按照以下比例進(jìn)行梯度稀釋：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10；向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入100μL病毒稀釋液，每個(gè)梯度重復(fù)8次；每天定時(shí)觀察細(xì)胞病變情況。感染72小時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞孔病變數(shù)量計(jì)算病毒滴度，TCID50測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表：表1：對(duì)P1、P2、P3、P4、P5代病毒液的TCID50檢測(cè)結(jié)果病毒代次P1P2P3P4P5病毒滴度(TCID50)102103104105105在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)sf9昆蟲細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(6×105mL-1)，將第5代重組桿狀病毒按1：10的體積比感染sf9細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立野生型桿狀病毒(AcMNPV)感染的Sf9細(xì)胞和正常sf9細(xì)胞的對(duì)照，27℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，在72h后分別收集上述細(xì)胞及其上清。用超聲波裂解儀破碎收獲的sf9細(xì)胞，3000r/min離心10min，收集細(xì)胞裂解上清，并向其中加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸裂解5min，分別得到重組桿狀病毒細(xì)胞裂解上清、野生型桿狀病毒細(xì)胞裂解液上清和正常的sf9細(xì)胞上清，并于-20℃保存，用于進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白Cap的表達(dá)。6、重組Cap蛋白表達(dá)的鑒定6.1Western-blotting檢測(cè)將步驟5得到的處理樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，其中分離膠濃度為12％，然后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用5％的脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，然后用TBST洗滌NC膜3次，加入以體積比1：3000稀釋的一抗(抗His標(biāo)簽)，37℃孵育1h，用TBST洗去未結(jié)合的抗體；加入二抗，37℃孵育1h(山羊抗小鼠IgG-HRP作為二抗)；洗滌后經(jīng)HRP-DAB顯色試劑盒顯色，觀察特異性條帶如圖5，結(jié)果顯示處理的細(xì)胞樣品能夠與抗鼠多抗發(fā)生特異性的反應(yīng)，而野生型對(duì)照與陰性對(duì)照樣品則沒(méi)有任何特異性的蛋白條帶，表明該重組桿狀病毒在sf9細(xì)胞中成功表達(dá)Cap蛋白。6.2間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)將步驟5收集的重組桿狀病毒接種到24孔板培養(yǎng)的單層sf9細(xì)胞，同時(shí)設(shè)野生型桿狀病毒感染和正常sf9細(xì)胞對(duì)照，待解毒細(xì)胞病變明顯時(shí)用PBS洗滌3遍，用預(yù)冷的丙酮和乙醇混合液[V(丙酮):V(乙醇)＝3:2]固定10min，PBS洗滌3遍，加入以體積比1：2000稀釋的一抗(抗His標(biāo)簽)，37℃孵育45min，PBS洗滌3次，加入二抗(FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG)，37℃孵育45min，PBS洗3次后覆蓋少許體積分?jǐn)?shù)為50％甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示重組桿狀病毒感染后的sf9細(xì)胞可以檢測(cè)到明顯的特異性熒光反應(yīng)，而野生型對(duì)照 與陰性對(duì)照組都無(wú)特異性熒光反應(yīng)，表明該重組桿狀病毒在sf9細(xì)胞中成功表達(dá)Cap蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖6。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3