一種耐高溫堿性木聚糖酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐高溫堿性木聚糖酶,屬于酶制劑制備【技術(shù)領(lǐng)域】。以產(chǎn)耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌701為出發(fā)菌株經(jīng)液體深層發(fā)酵制備。本發(fā)明的耐高溫堿性木聚糖酶酶比活力為350-420IU/ml;適用溫度范圍為40-75℃,最適反應(yīng)溫度65℃,在75℃酶活完全穩(wěn)定;適用反應(yīng)pH值范圍為5.0-11.0,在pH值為11.0時酶活完全穩(wěn)定,最適反應(yīng)pH值為10.0。比現(xiàn)有的耐高溫堿性木聚糖酶酶活力高,耐溫度高,耐堿性強(qiáng),酶作用最適pH值范圍寬泛,特別適合造紙、食品和飼料等領(lǐng)域的工業(yè)化需求。
【專利說明】一種耐高溫堿性木聚糖酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑制備【技術(shù)領(lǐng)域】,特別是一種耐高溫堿性木聚糖酶。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是植物半纖維素的主要成分,它們共同作用構(gòu)成了植物細(xì)胞壁的支撐骨架,在三者之中半纖維素占據(jù)了植物干重的35%以上,半纖維素也是多種復(fù)合聚糖的總稱,其主要成分為木聚糖,它是一種復(fù)雜的多聚五碳糖。木聚糖的主鏈?zhǔn)峭ㄟ^β -1-4糖苷鍵把多個吡喃木糖基連接起來,側(cè)鏈上連接著不同的取代基,這樣有乙酰基、葡萄糖醛?;?、L-阿拉伯糖基等(Collins et al.,2005)。所以木聚糖的完全降解就需要多種酶的共同參與。一般將木聚糖分為硬木木聚糖和軟木木聚糖。硬木木聚糖主要是由
O-乙酰-4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖聚合而成,以β -1-4糖苷鍵相連。軟木聚糖由阿拉伯
4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖殘基聚合而成(Beg et al,2001)。有的分類方法也把木聚糖分為可溶性木聚糖和不可溶性木聚糖。
[0003]木聚糖酶(1,4-β _D_xylanase:EC3.2.1.8)是一種重要的工業(yè)用酶,在分解木聚糖時起生物催化作用,可以將木聚糖分解成多糖或單糖的蛋白質(zhì)或RNA。木聚糖酶廣泛存在于自然界的生物體中。細(xì)菌、真菌、動物體內(nèi)等都能產(chǎn)生木聚糖酶。
[0004]由于木聚糖酶在工業(yè)上潛在的應(yīng)用價值,在近十年內(nèi)引起了人們的更多注意,其中堿性木聚糖酶主要應(yīng)用于紙漿和造紙企業(yè)。堿性木聚糖酶在造紙行業(yè)中的應(yīng)用主要包括制漿、協(xié)助漂白、改纖維性質(zhì)、廢紙脫墨等方面。
[0005]在工業(yè)生產(chǎn)中,制漿·過程是在堿性的條件下,用高溫蒸煮的方法除去木質(zhì)素,為使溶解制漿纖維素純度達(dá)到98%,這就需要大量的氫氧化鈉處理紙漿,造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染,為此許多學(xué)者轉(zhuǎn)而嘗試生物處理制漿,而用于制漿漂白的木聚糖酶應(yīng)是耐熱和耐堿的。馮建良等(Kimura et al.2000)用木聚糖酶預(yù)處理麥草與常規(guī)化學(xué)法制漿進(jìn)行了比較試驗,木聚糖酶預(yù)處理提高了原料的脫木素程度,還可以降低制漿的卡伯值。木聚糖酶在輔助漂白方面有較廣泛而深入的研究,且取得了很大成果。研究發(fā)現(xiàn),無論是針葉木漿、闊葉木漿或是竹漿、草漿,木聚糖酶均可以降解紙漿中殘余的木質(zhì)素,提高了白度(AL BALAA etal, 2006 ;Meek and Lipman, 1922)。用于紙衆(zhòng)漂白的木聚糖酶必須具有耐高溫特點,Khasin等得到了一個來源于堿性菌株Bacillus sterarothermophiIus T26木聚糖酶,該木聚糖酶在pH9.0及65°C時對紙漿有最好的漂白效果(Khasin et al,1993),很多木聚糖酶不具備這樣的特點,限制了商業(yè)化應(yīng)用。全世界每年產(chǎn)生的廢紙數(shù)量是驚人的,廢紙回收后再利用工作就變得尤為重要了,可以使在資源重復(fù)利用的同時也保護(hù)了環(huán)境。1991年,由韓國學(xué)者首次報道了應(yīng)用木聚糖酶能將油墨從新聞廢紙漿中脫除。此后,人們開始研究利用木聚糖酶進(jìn)行廢紙脫墨,以減輕或消除化學(xué)脫墨帶來的環(huán)境污染(曹軍衛(wèi)等,2004)。
[0006]目前,以無元素氯和全無氯漂白工藝為代表的紙漿綠色清潔漂白已經(jīng)成為世界各國造紙業(yè)紙漿漂白發(fā)展的必然趨勢,木聚糖酶酶法助漂新工藝已在歐洲和北美洲的30余家大型紙廠得到應(yīng)用,成為生物技術(shù)在造紙工業(yè)應(yīng)用最成功的一例。其中加拿大有約10%的硫酸鹽法紙漿廠采用了該項新工藝。丹麥諾維信公司和美國山道斯化學(xué)公司等多家酶制劑廠商,紛紛推出了專門用于制漿處理的木聚糖酶和纖維素酶新產(chǎn)品,但到目前為止,工業(yè)上應(yīng)用于紙漿漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的,最適反應(yīng)溫度大多在50°C左右,眾所周知,紙漿蒸煮和漂白基本都是在高溫和強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行的,使得現(xiàn)有的低溫酸性木聚糖酶產(chǎn)品在此領(lǐng)域的應(yīng)用受到極大的限制,另外,在飼料和食品領(lǐng)域,木聚糖酶應(yīng)用在飼料的造粒和食品的焙烤工序中,仍然要求所用的木聚糖酶在高溫條件下能夠保持較高的酶活,因此,研究開發(fā)耐高溫的木聚糖酶產(chǎn)品將會帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
[0007]從天然微生物中篩選性質(zhì)更為優(yōu)良的木聚糖酶產(chǎn)酶菌,是一個有效獲得高產(chǎn)木聚糖酶菌株的一個最有效的手段。自從木聚糖酶具有生物漂白功能以來,人們把更多的目光投向了堿性木聚糖酶,篩選了很多具有應(yīng)用前景的堿性木聚糖酶的生產(chǎn)菌株,分離了很多堿性木聚糖酶。1973年,Horikoshi等首次發(fā)現(xiàn)了來自堿性細(xì)菌中的木聚糖酶(Horikoshiand Atsukawa, 1973),從堿性細(xì)菌Bacillus sp.N0.C25922中純化得到木聚糖酶,它的最適PH為6-8。之后,發(fā)現(xiàn)了來自堿性細(xì)菌Bacillus N0.C2125的2個木聚糖酶:木聚糖酶A及木聚糖酶N,其中木聚糖酶A在pH12時也有一定的酶活(Honda et al,1985)。Dey等(Deyet al,1992)分離的嗜堿嗜熱菌Bacillus sp.(NCM59),能產(chǎn)生2個沒有纖維素酶活性的木聚糖酶,它們具有很好的耐堿性,最適pH為10.0。Nakamura等報道了來源于堿性菌株Bacillus sp.41M21的胞外木聚糖酶J它的最適pH為9.0 (Nakamura et al,1993)。大多數(shù)真菌產(chǎn)生的木聚糖酶一般為酸性木聚糖酶,但也有例外,Taneja等篩選到一株嗜堿真菌AspergillusnidulansKK299,它產(chǎn)的木聚糖酶的最適 pH 為 8(Taneja et al, 2002),并且該酶對硬木木聚糖比軟木木聚糖有更高的親和性。
[0008]中國專利CN101701205A公開了一種耐堿性木聚糖酶XynE2及其基因和應(yīng)用,所產(chǎn)耐堿性木聚糖酶最適PH值7.8,最適溫度65°C ;中國專利CN102586134B公開了一株生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌菌株及其應(yīng)用,所產(chǎn)木聚糖酶最適pH值6.0,最適溫度70°C ;中國專利CN102321558A公開了一種耐高溫木聚糖酶的高產(chǎn)菌種及利用該菌發(fā)酵產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的方法及得到的 酶,所產(chǎn)耐高溫木聚糖酶最適PH值7.0,最適溫度60。。。
[0009]由此看來,國際及國內(nèi)諸多專家、學(xué)者及科研工作人員不惜資金、人力和時間,加大了對耐高溫、耐堿性木聚糖酶的研發(fā)力度,旨在將生物技術(shù)在造紙、食品、飼料等領(lǐng)域的應(yīng)用推向一個更高、更新、更強(qiáng)的新時代,無論是新菌種的獲得,還是采用基因重組技術(shù),雖然耗費(fèi)了如此之大的財力及精力,但結(jié)果不盡人意,很難達(dá)到耐高溫、耐堿性木聚糖酶的研發(fā)目標(biāo)及要求,要么耐溫不耐堿;要么耐堿不耐溫;要么耐堿耐高溫范圍不寬泛;要么木聚糖酶不純并有纖維素酶活性;要么作用底物不適等等,制備一種耐堿性更強(qiáng)、耐溫度更高、耐堿耐高溫范圍寬泛、不具有纖維素酶活性且適合造紙、食品和飼料等領(lǐng)域的耐高溫堿性木聚糖酶仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員不懈的追求和研發(fā)方向。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有耐高溫堿性木聚糖酶的產(chǎn)品缺陷,以產(chǎn)耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌(Bacillus thermophilus)701為出發(fā)菌株,并通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝制備出一種耐高溫、耐堿性強(qiáng)、作用條件寬泛、不具有纖維素酶活性的適合造紙、食品和飼料等領(lǐng)域的耐高溫堿性木聚糖酶。
[0011]為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0012]所述耐高溫堿性木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0013](I)溫度:該酶溫度適應(yīng)范圍較寬,適用溫度范圍為40-75°C,最適反應(yīng)溫度65°C,在75 °C酶活完全穩(wěn)定;
[0014](2)pH:該酶適用反應(yīng)pH值范圍為5.0-11.0,在pH值為11.0時酶活完全穩(wěn)定,最適反應(yīng)pH值為10.0 ;
[0015](3)酶活性:發(fā)酵液堿性木聚糖酶酶比活力較高,為350_420IU/ml ;
[0016](4)熱穩(wěn)定性:該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活,75°C條件下保存Ih后保持70%以上酶活;
[0017](5)存儲穩(wěn)定性:該酶在室溫下保存12個月后酶活損失小于3.0%。
[0018]所述耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法如下:
[0019]將保存完好的嗜熱芽孢桿菌701的斜面菌種經(jīng)活化和逐級擴(kuò)大培養(yǎng)(包括一、
二、三級種子培養(yǎng)以及一級種子罐培養(yǎng))得到種子液,以6%接種量接入發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度37-45 °C,攪拌速度 200-70 0rpm,通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時間 10_15h ;然后以 1-2 °C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C,此時,將一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐,恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以
1-20C/h升溫速率緩慢升溫至10_15°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至37-45°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶,所述調(diào)配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥劑粉。
[0020]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3-10g,氯化鈉5_12g,蛋白胨10_20g,葡萄糖
2-5g,瓊脂15-20g,中草藥劑粉 5-10g,蒸餾水 1000mL, pH 值 5-11,121°C滅菌 20min ;
[0021]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0022]以重量份數(shù)計,稱取黃芪20-30份,黨參10-18份,柴胡10-15份,黃芩10-15份;分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下,然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水,控制溫度70°C~90°C保持2~4h,然后降溫至45-60°C,加入混合酶制劑進(jìn)行酶解,用乳酸調(diào)節(jié)PH值為5.5-6.8,酶解2-4h,最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物,控制溫度至60°C~78°C保持3~4h,過濾;濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0023]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5_10%。
[0024]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份,外β -葡聚糖酶10-20份,β -葡萄糖苷酶10-15份,木聚糖酶15-20份,戊聚糖酶15-20份,普魯蘭酶20-30份,β -淀粉酶10-15份,中性蛋白酶10-15份,酸性蛋白酶10-15份,超氧化物歧化酶5_10份,葡萄糖氧化酶5-10份,酸性磷酸酶5-10份。
[0025]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5。
[0026]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0027]酵母粉0.3-0.5%,葡萄糖1-1.5%,蛋白胨0.3-0.5%,牛肉膏0.5-0.8%,磷酸氫二鉀0.8-1.5%,中草藥劑粉1.5-2%,海藻糖1-3%,硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值5-11,121-123°c滅菌30_40min。
[0028]所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:[0029]麥芽糊精5-15%,酵母粉0.4-0.8%,中草藥劑粉1.5-2%,海藻糖1_3%,蛋白胨
0.1-0.5%,玉米漿 0.1-0.5%,磷酸氫二鉀 0.8-1.5%,硫酸鎂 0.05-0.1%,檸檬酸鈉 0.1-0.5%,樺木木聚糖0.1-0.8%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值5-11,121-123°c滅菌30_40min。
[0030]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml ;
[0031]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g,玉米粉50_60g,豆餅粉15_25g,中草藥劑粉30-50g,海藻糖30-40g,樺木木聚糖5-15g,酵母粉4_8g,玉米漿l_5g,硫酸銨l_3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀l_2g,檸檬酸鈉l_5g,消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL,pH值
5-11,121°C滅菌 20min ; [0032]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為:
[0033]按比例準(zhǔn)確稱取原料,將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中,調(diào)節(jié)pH值5-11,加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉),同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min,然后緩慢升溫至90°C保溫15_30min進(jìn)行液化,最后加入其它原料,攪拌均勻,調(diào)初始pH5-ll,121-123°C滅菌30_40min備用。
[0034]發(fā)酵液堿性木聚糖酶比活力為350_420IU/ml,對酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析,將粗酶液分別置于40°C、45°C、50 V、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下,每隔10分鐘取樣測定酶活。40°C、45°C、50°C、55°C下,60分鐘酶活沒有下降。60°C與65°C下,30分鐘降到原有酶活^ 95%, 60分鐘降到85% 0 70。。下,30分鐘降到原有酶活^ 85%, 60分鐘降到80 75 °C下,30分鐘降到原有酶活的80%,60分鐘降到70%。
[0035]本發(fā)明耐高溫堿性木聚糖酶可在造紙漂白中應(yīng)用。
[0036]本發(fā)明提供的產(chǎn)耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌701是從湖南省雪麗造紙廠采集土樣分離出一株嗜熱芽孢桿菌HYX0021,經(jīng)反復(fù)的紫外誘變及亞硝基胍誘變篩選獲得,特性是耐高溫、耐堿性強(qiáng)。
[0037]本發(fā)明提供的產(chǎn)耐高溫堿性木聚糖酶的菌株具體為嗜熱芽孢桿菌701。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC,地址為:中國.武漢.武漢大學(xué),郵編:430072),保藏號為CCTCC NO:M2013537,分類命名為嗜熱芽孢桿菌701(Baci Ilusthermophilus701)。
[0038]本發(fā)明提供的嗜熱芽孢桿菌701是革蘭氏陽性,桿菌,好氧,產(chǎn)芽孢,在LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h,菌落呈圓形,菌落直徑約為1.0-2.0 mm,乳白色,表面光滑,不透明,邊緣不規(guī)則擴(kuò)展。周生鞭毛,能運(yùn)動,無莢膜,有芽孢,菌體大小為(0.7~0.9) μ mX (3~
3.5) μ m,芽孢(0.6~0.9) μ mX (1.0~1.5) μ m,橢圓狀,位于菌體中央或稍偏,芽孢形成后菌體不膨大。液體培養(yǎng)基中生長時,形成皺醭。酪蛋白水解實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗均為陽性;菌體能夠利用葡萄糖、果糖、蔗糖,不能利用乳糖以及甘露醇;H2S、接觸酶實驗、吲哚試驗實驗均為陰性。
[0039]有益效果:
[0040]1.本發(fā)明的耐高溫堿性木聚糖酶酶比活力為350_420IU/ml ;適用溫度范圍為40-750C,最適反應(yīng)溫度65°C,在75°C酶活完全穩(wěn)定;適用反應(yīng)pH值范圍為5.0-11.0,在pH值為11.0時酶活完全穩(wěn)定,最適反應(yīng)pH值為10.0。比現(xiàn)有的耐高溫堿性木聚糖酶酶活力高,耐溫度高,耐堿性強(qiáng),酶作用最適PH值范圍寬泛,特別適合造紙、食品和飼料等領(lǐng)域的工業(yè)化需求。[0041]2.本發(fā)明耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法采用梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝顯著提高了嗜熱芽孢桿菌701的抗應(yīng)激能力,致使菌株產(chǎn)酶能力最大限度地顯現(xiàn)。并且本發(fā)明對嗜熱芽孢桿菌701培養(yǎng)基組成實施全程優(yōu)化,添加了具有抗熱應(yīng)激原作用的黃芩、柴胡,添加了具有調(diào)整和修復(fù)機(jī)體功能、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、具有微生態(tài)調(diào)節(jié)功能的黃芪、黨參等,進(jìn)一步增強(qiáng)了微生物在同一發(fā)酵環(huán)境下的機(jī)體功能性、傳代適應(yīng)性和共同協(xié)作性,進(jìn)而增強(qiáng)嗜熱芽孢桿菌701的代謝功能,使得本發(fā)明所產(chǎn)耐高溫堿性木聚糖酶酶活力高、作用條件寬泛、穩(wěn)定性強(qiáng)、適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0042]3.本發(fā)明耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法中培養(yǎng)基的重要組成部分中草藥粉劑采用酶解工藝和水提醇沉工藝相結(jié)合,不僅顯著提高了各種中草藥的有效成分,增強(qiáng)了中草藥的作用效力,而且還為微生物發(fā)酵提供了難得的營養(yǎng)物質(zhì)(如中藥多糖等)。
【具體實施方式】
[0043]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明,本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外,實施方案應(yīng)理解為說明性的,而非限制本發(fā)明的范圍,本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下,對這些實施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0044]實施例1
[0045]耐高溫堿性木聚糖酶酶活力的測定(3,5—二硝基水楊酸比色法,簡稱DNS法)
[0046]1.試劑和溶液
[0047]1.1所用水除特別要求外,均為符合GB/6682—1992規(guī)定的三級水,化學(xué)藥品除特別要求外,均為分析純。
[0048]1.2DNS 試劑
[0049]稱取3,5—二硝基水楊酸IOg加入500ml水中,分多次加入氫氧化鈉16g,攪拌溶解(溫度< 45 °C ),再分多次加入酒石酸鉀鈉300g,攪拌至全溶,冷卻后用水定容至1000ml。室溫下棕色瓶儲存暗處放置,一周后使用(如有沉淀過濾后使用)。
[0050]1.30.lmol/L, pH5.0醋酸一醋酸鈉緩沖液
[0051]吸取冰醋酸1.8ml,加適量水,加醋酸鈉5.78g,溶解,定容至1000ml,調(diào)節(jié)PH至
5.00 ±0.01后使用。室溫下存放2個月有效。
[0052]1.40.1%即lmg/ml木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[0053]無水木糖于80°C烘至恒重,稱取0.1OOOg于燒杯中,加適量水溶解,轉(zhuǎn)入容量瓶中并定容至100ml。
[0054]1.51.0%木聚糖溶液
[0055]稱取木聚糖1.0Og于燒杯中,用2ml0.5mol/L氫氧化鈉潤濕成糊狀,加40ml緩沖液,于60~70°C水浴中加熱溶解,冷涼后用0.5mol/L醋酸(約2ml)調(diào)pH5.0,轉(zhuǎn)入容量瓶中,加緩沖液(4.3)定容至100ml。如果冰箱中放置時間長了出現(xiàn)沉淀,使用前應(yīng)在熱水浴中熱溶。
[0056]1.6木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0057]吸取lmg/ml木糖溶液0,0.2, 0.4,0.6,0.8,1.0ml于試管中,補(bǔ)水至2ml,加DNS試劑3ml,混合后于沸水中煮lOmin,冷卻后定容至15ml,于分光光度計540nm波長下測吸光度(A)。以吸光度為縱坐標(biāo),木糖量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,三次重復(fù)試驗的均值用最小二乘法擬合一元線性方程y = ax + b,求出吸光度與木糖量的關(guān)系。
[0058]2.待測酶樣品的處理
[0059]直接吸取酶液做適當(dāng)稀釋,使測定光吸收值在0.25—0.4范圍內(nèi)。
[0060]3.酶活力測定
[0061]取15ml具塞刻度試管按下面的反應(yīng)順序進(jìn)行操作,在反應(yīng)過程中,從加入底物(吸取前搖勻)(1.5)開始,向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致,50°C水解1Omin.[0062]反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見下表:
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種耐高溫堿性木聚糖酶,其特征在于,所述木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)如下: (1)溫度:適用溫度范圍為40-75°C,最適反應(yīng)溫度65°C,在75°C酶活完全穩(wěn)定; (2)pH:該酶適用反應(yīng)pH值范圍為5.0-11.0,在pH值為11.0時酶活完全穩(wěn)定,最適反應(yīng)pH值為10.0 ; (3)酶活性:發(fā)酵液堿性木聚糖酶酶比活力為350-420IU/ml; (4)熱穩(wěn)定性:該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活,75°C條件下保存Ih后保持70%以上酶活; (5)存儲穩(wěn)定性:該酶在室溫下保存12個月后酶活損失小于3.0%。
2.如權(quán)利要求1所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶,其特征在于,所述木聚糖酶由嗜熱芽孢桿菌CCTCC M2013537經(jīng)液體深層發(fā)酵制備。
3.如權(quán)利要求2所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶,其特征在于,所述耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法如下:將保存完好的嗜熱芽孢桿菌CCTCC M2013537的斜面菌種經(jīng)活化和一、二、三級種子培養(yǎng)以及一級種子罐培養(yǎng)逐級擴(kuò)大培養(yǎng)得到種子液,以6%接種量接入發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度37-45°C,攪拌速度200-700rpm,通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C,此時,將一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐,恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1-2 °C /h升溫速率緩慢升溫至10-15 °C,恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至37-45°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶,所述調(diào)配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥劑粉。
4.如權(quán)利要求3所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶,其特征在于,所述種子培養(yǎng)基重量組成為:酵 母粉0.3-0.5%,葡萄糖1-1.5%,蛋白胨0.3-0.5%,牛肉膏0.5-0.8%,磷酸氫二鉀0.8-1.5%,中草藥劑粉1.5-2%,海藻糖1-3%,硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值5-11,121-123°c滅菌30_40min。
5.如權(quán)利要求3所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶,其特征在于,所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精5-15%,酵母粉0.4-0.8%,中草藥劑粉1.5-2%,海藻糖1_3%,蛋白胨0.1-0.5%,玉米漿 0.1-0.5%,磷酸氫二鉀 0.8-1.5%,硫酸鎂 0.05-0.1%,檸檬酸鈉 0.1-0.5%,樺木木聚糖0.1-0.8%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值5-11,121-123°c滅菌30_40min。
6.如權(quán)利要求3所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶,其特征在于,所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為 7.0x108-8.0xlO8 個 /ml ο
7.如權(quán)利要求3所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶,其特征在于,所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50-150g,玉米粉50-60g,豆餅粉15-25g,中草藥劑粉30_50g,海藻糖30_40g,樺木木聚糖5-15g,酵母粉4-8g,玉米漿l_5g,硫酸銨l_3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀l_2g,檸檬酸鈉 l_5g,消泡劑 0.Ι-lg,純凈水 1000mL, pH 值 5-11,121°C滅菌 20min。
8.如權(quán)利要求3-7任一所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶,其特征在于,所述中草藥粉劑的制備方法如下:稱取黃芪20-30份;黨參10-18份;柴胡10-15份;黃芩10-15份;分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下,然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水,控制溫度W V~90°C保持2~4h,然后降溫至45-60°C,加入混合物料總重量5-10%的混合酶制劑進(jìn)行酶解,用乳酸調(diào)節(jié)PH值為5.5-6.8,酶解2-4h,最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物,所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5,控制溫度至60°C~78°C保持3~4h,過濾;濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
9.如權(quán)利要求8所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶,其特征在于,所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份,外β -葡聚糖酶10-20份,β -葡萄糖苷酶10-15份,木聚糖酶15-20份,戊聚糖酶15-20份,普魯蘭酶20-30份,β -淀粉酶10-15份,中性蛋白酶10-15份,酸性蛋白酶10-15份,超氧化物歧化酶5-10份,葡萄糖氧化酶5_10份,酸性磷酸酶5-10份。
10.如權(quán)利要求1或2所述的一種`耐高溫堿性木聚糖酶在造紙漂白中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/42GK103865903SQ201310685095
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】李洪兵, 朱永明, 孫明芳, 劉波, 易繼云, 周俊 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司