本發(fā)明屬于天然高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙網(wǎng)絡(luò)高強度天然生物大分子水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

隨著組織工程領(lǐng)域的發(fā)展，對于性能優(yōu)異且適合于生物友好環(huán)境中使用的生物醫(yī)用材料及其制備技術(shù)的需求日益高漲。水凝膠是富含大量水分子的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，有較強的通透性，且與細胞外基質(zhì)在結(jié)構(gòu)和功能上相似，因此水凝膠既是一類重要的可用于重建組織工程細胞支架的材料，又是一類極具前景的藥物緩釋類載體材料。

蠶絲蛋白作為一種天然高分子材料，其來源豐富，同時具備優(yōu)良的力學(xué)性能、可控的降解性能及良好的生物相容性，因而在生物醫(yī)用領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。但與此同時，對于利用再生絲蛋白溶液制備的水凝膠材料，通常由于其力學(xué)性能較差而限制了其在某些組織工程領(lǐng)域中實際應(yīng)用，例如需承重較大壓力的軟骨或韌帶等修復(fù)材料。為了解決這個問題，有研究報道用辣根過氧化物酶化學(xué)交聯(lián)得到絲蛋白水凝膠，但其儲能模量通常只有0.1-10 KPa (CN 104017374 A)， 而且該水凝膠結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在37^oC條件下長時間放置會出現(xiàn)凝膠至溶液的轉(zhuǎn)變。在制備高強度絲蛋白水凝膠的研究中，有研究報道利用表面活性劑的特性制備高強度的絲蛋白水凝膠(絲蛋白/水: 15/85 (w/w))，其壓縮模量和拉伸模量達到3.0 MPa，但是絲蛋白在低濃度時所制備的水凝膠不具備良好的力學(xué)性能，而且表面活性劑會有一定細胞毒性；也有研究報道利用絲蛋白與纖維素衍生物制備高強度復(fù)合水凝膠 (CN 104845382 A)，其同樣對絲蛋白的濃度有一定限制。

本發(fā)明通過辣根過氧化物酶化學(xué)交聯(lián)絲蛋白得到化學(xué)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，然后將其置于可誘導(dǎo)絲蛋白發(fā)生β 折疊轉(zhuǎn)變的溶液中形成物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，得到一類模量高、韌性強且具有很好的生物相容性的雙網(wǎng)絡(luò)高強度絲蛋白水凝膠，此類水凝膠凝膠的固含量可在2-20 wt%之間調(diào)整來控制其相應(yīng)力學(xué)性能。除此之外，其制備方法簡單，重復(fù)性好，并且細胞可在其表面鋪展生長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有可調(diào)良好力學(xué)性能以及良好穩(wěn)定性的雙網(wǎng)絡(luò)高強度絲蛋白水凝膠及其制備方法。

本發(fā)明提供的雙網(wǎng)絡(luò)高強度絲蛋白水凝膠，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2-20 wt%的絲蛋白水溶液經(jīng)辣根過氧化物酶化學(xué)交聯(lián)形成絲蛋白水凝膠，然后將其浸泡于能誘導(dǎo)絲蛋白β 折疊轉(zhuǎn)變的溶液中形成物理交聯(lián)，即得雙網(wǎng)絡(luò)高強度絲蛋白水凝膠。所述能誘導(dǎo)β 折疊的水溶液為含有機溶劑類、表面活性劑類、或酸性溶液的任何一種。

本發(fā)明提供的雙網(wǎng)絡(luò)高強度絲蛋白水凝膠的制備方法，具體步驟為：

（1）制備絲蛋白水溶液，使其最終濃度為2-20 wt%；

（2）在步驟（1）所得絲蛋白溶液中加入辣根過氧化物酶（0.01-1 mg/mL）和過氧化氫（0.01-1% v/v）溶液，溶劑為水，25-50℃下進行化學(xué)交聯(lián)，得到絲蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)；

（3）將步驟（2）所得絲蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)浸泡于能誘導(dǎo)絲蛋白β 折疊轉(zhuǎn)變的溶液中，浸泡時間為6-48 h，即得雙網(wǎng)絡(luò)高強度絲蛋白水凝膠。

本發(fā)明中，所述的絲蛋白為桑蠶或柞蠶絲蛋白的一種或兩者混合。

本發(fā)明中，所述的辣根過氧化物酶與過氧化氫的質(zhì)量比范圍宜為10:1-1:1。

本發(fā)明中，所述的能誘導(dǎo)β 折疊的溶液為含有機溶劑類、表面活性劑類、或酸性溶液中的任何一種，或其中幾種的混合。

本發(fā)明中，所述的有機溶劑類為(但不僅限于)甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、吡啶、丙酮、氯仿中的任何一種，或其中幾種的混合, 濃度為50-95% v/v。

本發(fā)明中，所述表面活性劑類為(但不僅限于)十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉或聚乙二醇辛基苯基醚中的任何一種，濃度為5-40 mM。

本發(fā)明中，所述酸性溶液為能將溶液pH降低至2-5的任何一種，濃度為0.05-5% w/w。

本發(fā)明中，步驟（1）中所述絲蛋白水溶液可為純絲蛋白溶液，也可為還含其他成分的混合溶液/懸濁液，其他成分包括水溶性高分子、功能性無機材料或藥物分子等。

本發(fā)明方法也可用于制備高強度絲蛋白膜及絲蛋白支架材料。

本發(fā)明制備的雙網(wǎng)絡(luò)高強度絲蛋白水凝膠，可用于生物醫(yī)學(xué)工程及納米功能材料領(lǐng)域。

采用本發(fā)明方法制備雙網(wǎng)絡(luò)高強度絲蛋白水凝膠，具有以下優(yōu)點：

（1）本發(fā)明所述的水凝膠原料為成本低廉且經(jīng)過美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的絲蛋白，以此所得水凝膠具有良好的生物相容性和生物降解性；

（2）本發(fā)明采用的辣根過氧化物酶主要提取于山葵植物根部，已實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)；過氧化物為外科手術(shù)中常用的低濃度的過氧化氫，且有實驗證明采用辣根過氧化物酶交聯(lián)的絲蛋白水凝膠無細胞毒性；

（3）本發(fā)明采用的能誘導(dǎo)絲蛋白β 折疊轉(zhuǎn)變的溶液，及酶催化反應(yīng)的殘留都可通過與去離子水置換除去；

（4）本發(fā)明制備的雙網(wǎng)絡(luò)高強度水凝膠由化學(xué)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)與物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)共同組成，性能優(yōu)于由單獨由辣根過氧化物酶化學(xué)交聯(lián)的絲蛋白水凝膠，且該水凝膠在模擬體內(nèi)環(huán)境條件下性能穩(wěn)定；

（5）本發(fā)明對于低濃度的絲蛋白（如2-5 wt%）仍可以制備力學(xué)良好性能的水凝膠，區(qū)別于已報道的高強度絲蛋白水凝膠制備方法對絲蛋白濃度的限制；

（6）本發(fā)明所述的絲蛋白溶液，可為水溶性高分子，功能性無機納米粒子，藥物分子等的混合溶液，可制備具有多功能性的高強度水凝膠；

（7）此外，本發(fā)明制備條件簡單高效，綠色環(huán)保，重復(fù)性好，具有推廣應(yīng)用的價值。

附圖說明

圖1為雙網(wǎng)絡(luò)高強度絲蛋白水凝膠(4 wt%)的彎曲形變示意圖。

圖2為NaHCO₃脫膠的絲蛋白(10 wt%)水凝膠的拉伸與壓縮的力學(xué)性能曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，以進一步闡述本發(fā)明。有必要在此指出的是，實施例只用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。

實施例 1

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 wt%的桑蠶絲蛋白溶液2 mL，加入40 μL，0.5mg/mL的辣根過氧化物酶，均勻混合后加入40 μL，0.05%過氧化氫水溶液，37 ℃形成凝膠網(wǎng)絡(luò)；然后將其置于75%乙醇溶液中浸泡24 h，得到高強度的絲蛋白水凝膠，壓縮模量達到1.37 MPa，拉伸模量3.35 MPa。測試表明，在模擬體內(nèi)環(huán)境條件下性能穩(wěn)定，細胞相容性好。

實施例 2

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 wt%的柞蠶絲蛋白溶液4 mL，加入80 μL，1 mg/mL的辣根過氧化物酶，均勻混合后加入80 μL，0.2%過氧化氫水溶液，40 ℃形成凝膠網(wǎng)絡(luò)；然后將其置于70%異丙醇溶液中浸泡12 h，得到高強度的絲蛋白水凝膠，壓縮模量達到0.28 MPa，拉伸模量0.2 MPa。測試表明，在模擬體內(nèi)環(huán)境條件下性能穩(wěn)定，細胞相容性好。

實施例 3

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 wt%的柞蠶絲蛋白溶液2 mL，加入40 μL，0.1 mg/mL的辣根過氧化物酶，均勻混合后加入40 μL，0.01%過氧化氫水溶液，25 ℃形成凝膠網(wǎng)絡(luò)；然后將其置于0.5M十二烷基硫酸鈉溶液中浸泡48 h，得到良好力學(xué)性能的絲蛋白水凝膠，壓縮模量達到3.2 MPa，拉伸模量3.5 MPa。測試表明，在模擬體內(nèi)環(huán)境條件下性能穩(wěn)定，細胞相容性好。

實施例 4

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 wt%的桑蠶絲蛋白溶液2 mL，加入40 μL，0.8 mg/mL的辣根過氧化物酶，均勻混合后加入40 μL，0.2%過氧化氫水溶液，37 ℃形成凝膠網(wǎng)絡(luò)；然后將其置于pH為2.5的醋酸水溶液中浸泡24 h，得到高強度的絲蛋白水凝膠，壓縮模量達到1.0 MPa，拉伸模量2.1 MPa。測試表明，在模擬體內(nèi)環(huán)境條件下性能穩(wěn)定，細胞相容性好。

實施例 5

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 wt%的柞蠶絲蛋白與8 wt%明膠的混合溶液5 mL，加入100 μL，0.5 mg/mL的辣根過氧化物酶，均勻混合后加入100 μL，1 %過氧化氫水溶液，25 ℃形成凝膠網(wǎng)絡(luò)；然后將其置于0.1M十二烷基磺酸鈉溶液中浸泡10 h，得到高強度的絲蛋白水凝膠，壓縮模量達到1.25 MPa，拉伸模量2.0 MPa。測試表明，在模擬體內(nèi)環(huán)境條件下性能穩(wěn)定，細胞相容性好。

實施例 6

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12 wt%的桑蠶絲蛋白與2 wt%氧化石墨烯的混合溶液2 mL，加入40 μL，0.2 mg/mL的辣根過氧化物酶，均勻混合后加入40 μL，0.05%過氧化氫水溶液，37 ℃形成凝膠網(wǎng)絡(luò)；然后將其置于75%正丁醇溶液中浸泡24 h，得到高強度的功能化絲蛋白水凝膠，壓縮模量達到2.52 MPa，拉伸模量2.35 MPa。測試表明，在模擬體內(nèi)環(huán)境條件下性能穩(wěn)定，細胞相容性好。

實施例 7

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 wt%的桑蠶絲蛋白溶液5 mL，加入50 μL，1 mg/mL的辣根過氧化物酶，均勻混合后加入50 μL，0.3%過氧化氫水溶液，將混合溶液倒入10cm*10cm模具中，成膜室經(jīng)過24小時成膜；然后將其置于75%乙醇溶液中浸泡24 h，得到高強度的絲蛋白膜，濕態(tài)下拉伸模量103Mpa，拉伸應(yīng)變300%。測試表明，在模擬體內(nèi)環(huán)境條件下性能穩(wěn)定，細胞相容性好。