本發(fā)明涉及丹參酮ⅡA的新型衍生物及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

化療是惡性腫瘤綜合治療策略中的關(guān)鍵一環(huán)，其藥物治療反應(yīng)性明確影響患者預(yù)后。研發(fā)新型抗腫瘤藥物，就成為腫瘤治療研究的重要方向。高遷移率族蛋白-1(HMGB1)在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個核心環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要作用。多種惡性腫瘤存在HMGB1基因過表達，且與惡性腫瘤的預(yù)后相關(guān)。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)HMGB1是膿毒癥中重要的炎癥因子。HMGB1作為一種重要的炎癥介質(zhì)和致炎細胞因子，是啟動和維持炎癥瀑布式反應(yīng)的中心分子，與多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病機制關(guān)系密切。因此，研發(fā)新型HMGB1作用抑制劑，不僅對于炎癥相關(guān)治療具有重要作用，尤其是作為抗腫瘤藥物，將為提高惡性腫瘤藥物化療以及綜合治療效果提供新的選擇。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供丹參酮ⅡA的新型衍生物及其制備方法和應(yīng)用，其中，該新型衍生物不僅能夠有效抑制腫瘤細胞增殖，而且對多種腫瘤細胞均有抑制作用，并且對正常細胞沒有明顯影響作用，制備該新型衍生物的方法簡便、快捷，所得到的化合物純度高、不含其它雜質(zhì)，且經(jīng)過反復(fù)驗證，可得到高純度、性質(zhì)穩(wěn)定的化合物。

為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

丹參酮ⅡA的新型衍生物，其特征在于，分子式：C₁₈H₂₀O₄，Mass：300.14，結(jié)構(gòu)式：

制備前述的丹參酮ⅡA的新型衍生物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、合成

(1)將前體Angene 024-021-75與BBr₃在CH₂Cl₂中反應(yīng)4h，反應(yīng)溫度為-78℃至常溫，生成產(chǎn)物TSA518，其中，

前體Angene 024-021-75的分子式：C₁₃H₁₈O，Mass：190.14，結(jié)構(gòu)式：

產(chǎn)物TSA518的分子式：C₁₂H₁₆O，Mass：176.12，結(jié)構(gòu)式：

(2)在丙二酸和85％P₂O₅存在的情況下，將產(chǎn)物TSA518與多聚磷酸混合，在75℃條件下反應(yīng)3h，生成產(chǎn)物TSA519，其中，

產(chǎn)物TSA519的分子式：C₁₅H₁₆O₃，Mass：244.11，結(jié)構(gòu)式：

(3)在甲苯/乙醇存在的情況下，將產(chǎn)物TSA519與氯丙酮、乙酸/醋酸銨混合，回流24h，通過串聯(lián)烷基化/分子內(nèi)醛醇縮合反應(yīng)，生成產(chǎn)物TSA520，其中，

產(chǎn)物TSA520的分子式：C₁₈H₁₈O₃，Mass：282.13，結(jié)構(gòu)式：

(4)向產(chǎn)物TSA520中加入含有5％KOH的乙醇溶液，回流3h，產(chǎn)物TSA520被KOH水解，生成開放環(huán)的復(fù)合物TSA521，其中，

產(chǎn)物TSA521的分子式：C₁₈H₂₀O₄，Mass：300.14，結(jié)構(gòu)式：

步驟二、純化

采用反相-HPLC法，將生成的產(chǎn)物過C18柱，過柱純化，以含有0.05％三氟乙酸的水為流動相，通過含有0.05％三氟乙酸的水：含有0.05％三氟乙酸的甲醇，配比從70：30至30：70線性洗脫至少30min，，流速1.0mL/min，洗脫至28min左右即可分離得到產(chǎn)物TSA521。

本發(fā)明的有益之處在于：

(一)新型衍生物

高遷移率族蛋白-1(HMGB1)在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個核心環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要作用。多種惡性腫瘤存在HMGB1基因過表達，且與惡性腫瘤的預(yù)后相關(guān)，本發(fā)明制備得到的新型衍生物能夠直接靶向HMGB1，有效抑制多種腫瘤細胞增殖，而且對于正常細胞沒有明顯影響，這對于研發(fā)新型抗腫瘤藥物，為提高惡性腫瘤藥物化療以及綜合治療效果提供了新的選擇。

(二)制備方法

通過化學(xué)合成、反相-HPLC純化制備該新型衍生物，方法穩(wěn)定、簡捷、易行。

經(jīng)過反復(fù)驗證，使用該方法所得到的化合物性質(zhì)穩(wěn)定，純度高，能夠有效抑制HMGB1活性，并具備進行產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的潛力。

附圖說明

圖1是制備丹參酮ⅡA的新型衍生物的流程圖；

圖2是TSA521與HMGB1親和力分析圖；

圖3(a)是TSA521在100μM劑量下，MCF-7細胞的增殖情況；

圖3(b)是對照組MCF-7細胞的增殖情況；

圖4(a)是TSA521在50μM劑量下，Hela細胞的增殖情況；

圖4(b)是對照組Hela細胞的增殖情況；

圖5(a)是TSA521在100μM劑量下，HepG2細胞的增殖情況；

圖5(b)是對照組HepG2細胞的增殖情況；

圖6(a)是TSA521在100μM劑量下，正常的人HuPBMCs的增殖情況；

圖6(b)是對照組正常的人HuPBMCs的增殖情況。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作具體的介紹。

一、丹參酮ⅡA的新型衍生物的結(jié)構(gòu)

本發(fā)明提出的丹參酮ⅡA的新型衍生物，記為TSA521，其分子式：C₁₈H₂₀O₄，Mass：300.14，結(jié)構(gòu)式：

二、制備方法

步驟一、合成

(1)將前體Angene 024-021-75與BBr₃在CH₂Cl₂中反應(yīng)4h，反應(yīng)溫度為-78℃至常溫，生成產(chǎn)物TSA518。其中，

前體Angene 024-021-75的分子式：C₁₃H₁₈O，Mass：190.14，結(jié)構(gòu)式：

產(chǎn)物TSA518的分子式：C₁₂H₁₆O，Mass：176.12，結(jié)構(gòu)式：

經(jīng)計算，產(chǎn)物TSA518的得率為85％。

(2)在丙二酸和85％P₂O₅存在的情況下，將產(chǎn)物TSA518與多聚磷酸(PPA)混合，在75℃條件下反應(yīng)3h，生成產(chǎn)物TSA519。其中，

產(chǎn)物TSA519的分子式：C₁₅H₁₆O₃，Mass：244.11，結(jié)構(gòu)式：

經(jīng)計算，產(chǎn)物TSA519的得率為30％。

(3)在甲苯(或乙醇)存在的情況下，將產(chǎn)物TSA519與氯丙酮、乙酸(或醋酸銨)混合，回流24h，通過串聯(lián)烷基化反應(yīng)(或者分子內(nèi)醛醇縮合反應(yīng))，生成產(chǎn)物TSA520。其中，

產(chǎn)物TSA520的分子式：C₁₈H₁₈O₃，Mass：282.13，結(jié)構(gòu)式：

經(jīng)計算，產(chǎn)物TSA520的得率為80％。

(4)向產(chǎn)物TSA520中加入含有5％KOH的乙醇溶液，回流3h，產(chǎn)物TSA520被KOH水解，生成開放環(huán)的復(fù)合物TSA521。其中，

產(chǎn)物TSA521的分子式：C₁₈H₂₀O₄，Mass：300.14，結(jié)構(gòu)式：

經(jīng)計算，產(chǎn)物TSA521的得率為55％。

2、純化

采用反相-HPLC法，將生成的產(chǎn)物過C18柱(phenomene×primesphers 5 C18 MC.11DA.250×45mm)，過柱純化，以含有0.05％三氟乙酸的水為流動相，通過水(含有0.05％三氟乙酸)：甲醇(含有0.05％三氟乙酸)，配比從70：30至30：70線性洗脫至少30min，流速1.0mL/min，洗脫至28min左右即可分離得到產(chǎn)物TSA521。

經(jīng)鑒定，產(chǎn)物TSA521的m/z＝300.14，在283.8nm處有最大光吸收值，對應(yīng)的化學(xué)分子式為C₁₈H₂₀O₄，結(jié)構(gòu)式為：

三、功能分析

1、TSA521HMGB1親和力分析：

我們利用表面等離子體共振分析技術(shù)對TSA521與HMGB1的親和能力進行了研究。

圖2是TSA521與HMGB1親和力分析圖。

由圖2可知：表面TSA521與HMGB1具有良好的親和力。

2、抑瘤效應(yīng)：

利用多種腫瘤細胞，我們對TSA521的腫瘤生物學(xué)效應(yīng)進行了研究。

圖3(a)是TSA521在100μM劑量下，MCF-7細胞的增殖情況。

圖4(a)是TSA521在50μM劑量下，Hela細胞的增殖情況。

圖5(a)是TSA521在100μM劑量下，HepG2細胞的增殖情況。

圖6(a)是TSA521在100μM劑量下，正常的人HuPBMCs的增殖情況。

圖3(b)、圖4(b)、圖5(b)和圖6(b)是對照組的增殖情況。

由上述8幅圖可知：在給予TSA521(劑量分別為50μM、100μM)的情況下，多種腫瘤細胞，包括MCF-7、Hela、HepG2等，其增殖受到明顯的抑制；但對于正常的人外周血單個核細胞(HuPBMCs)，應(yīng)用同等劑量的TSA521，細胞增殖并未受到明顯影響。

初步的研究證實，TSA521對多種腫瘤細胞具有明確的抑制作用，但對正常細胞沒有明顯的影響。

結(jié)論：本發(fā)明的丹參酮ⅡA的新型衍生物(TSA521)可以應(yīng)用在制備抑制胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等腫瘤的藥物中。

需要說明的是，上述實施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。