技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種提高黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn)定性和嗜鹽度的方法。

背景技術(shù)：

在自然界，植物組織富含大量的纖維素和半纖維素，纖維素和半纖維素是綠色可再生的資源，這些資源的利用對(duì)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

黑曲霉纖維素酶是一種廣泛使用的纖維素酶。在纖維素酶的作用下，纖維素被降解成可以利用的糖類。自然界里面有大量的纖維素在高鹽環(huán)境之下，例如海藻、海洋垃圾中的纖維素資源，鹽堿地等都含有大量的纖維素。這些纖維素都處于高鹽環(huán)境之中，高鹽環(huán)境下纖維素的降解需要能夠耐受高鹽度的纖維素酶，因?yàn)楦啕}度會(huì)降低普通纖維素酶的熱穩(wěn)定性，耐鹽的纖維素酶在高鹽度下要具有更高的熱穩(wěn)定性。

黑曲霉纖維素酶是一種具有較好熱穩(wěn)定性的纖維素酶，然而其在高鹽度下的熱穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高，提高其在高鹽度下的熱穩(wěn)定性有利于降低纖維素的降解成本，從而提升纖維素利用的價(jià)值。同時(shí)，催化活性的提升，對(duì)降低纖維素酶工業(yè)化應(yīng)用的成本具有重要的意義。

提升纖維素酶的熱穩(wěn)定性或者提升纖維素酶高鹽度下熱穩(wěn)定性的方法較多：化學(xué)修飾，物理固定，基因工程技術(shù)改造纖維素酶的一級(jí)序列等?；蚬こ碳夹g(shù)改造纖維素酶的一級(jí)序列，是一種較為可行的方案，因?yàn)橐患?jí)序列改造后耐鹽性能更好的酶具有更便利的利用方式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種提高黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn)定性和嗜鹽度的方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種提高黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn)定性和嗜鹽度的方法，為將黑曲霉纖維素外切酶的氨基酸序列定向改造成如SEQ ID NO.3所示的序列。改造前，黑曲霉纖維素外切酶的氨基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、2所示。改造后的黑曲霉纖維素外切酶其在高鹽溶液中的熱穩(wěn)定性得到了提高，對(duì)鹽度的適應(yīng)性也增強(qiáng)了。改造后的黑曲霉纖維素外切酶編碼基因的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID NO.4所示。

一種生產(chǎn)黑曲霉纖維素外切酶的酵母菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將SEQ ID NO.4所示的黑曲霉纖維素外切酶編碼基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體上，再用所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母。所述的表達(dá)載體優(yōu)選為pPIC9K。

本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，改變纖維素酶的氨基酸序列，提高了纖維素外切酶在高鹽溶液中的熱穩(wěn)定性及嗜鹽度。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例中所用到的部分實(shí)驗(yàn)材料如下：限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒（Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）、T4 DNA Ligase購自Takara；質(zhì)粒pPIC9K、SMD1168酵母、大腸桿菌DH5α均為商業(yè)化產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒提取試劑盒（B518188）購自上海生工。SEQ ID NO.5所示的合成序列1、SEQ ID NO.6所示合成序列2為全合成序列，實(shí)驗(yàn)室保藏；合成序列1包含了酶切位點(diǎn)和改造前黑曲霉纖維素酶的編碼基因（SEQ ID NO.2）序列，合成序列2包含了酶切位點(diǎn)和改造后黑曲霉纖維素酶的編碼基因（SEQ ID NO.4）序列。

實(shí)施例1

1、質(zhì)粒pPIC9K的提取

含有質(zhì)粒pPIC9K的大腸桿菌DH5α在含有氨芐青霉素50μg/mL的LB培養(yǎng)基中（50mL培養(yǎng)基裝入150三角瓶中）37℃培養(yǎng)12h。用質(zhì)粒提取試劑盒（B518188）提取質(zhì)粒。提取步驟如下：

（1）取0.5mL菌液，10000rpm離心3min收集菌體，倒盡或吸干培養(yǎng)基。

（2）在菌體沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振蕩至徹底懸浮菌體，室溫放置3min。

（3）將裂解液全部小心移入吸附柱，室溫放置1min，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。

（4）向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。

（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。

（6）重復(fù)向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm 離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。

（7）將吸附柱和收集管放入離心機(jī)，8000rpm離心2min。

（8）將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室溫靜置2min，8000 rpm離心2min。將所得到的質(zhì)粒DNA溶液置于-20℃保存。

2、質(zhì)粒pPIC9K及SEQ ID NO.5所示合成序列1的酶切

質(zhì)粒pPIC9K用EcoRI和NotI酶切，酶切為加入質(zhì)粒25μL，加入兩種限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI內(nèi)切酶各0.2μL，加入酶切緩沖液及ddH₂O 24.6μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到質(zhì)粒pPIC9K酶切液。

合成序列1 25μL，加入酶切緩沖液及ddH₂O 24.6μL，加入兩種限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI內(nèi)切酶各0.2μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到序列1酶切液。

質(zhì)粒pPIC9K和合成序列1分別酶切后，各自取酶切液進(jìn)行電泳。

3、酶切液電泳

（1）電泳試劑配制

1）5×TBE（tris-硼酸及EDTA）緩沖液的配制（1000mL）：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L

EDTA 20mL，將pH調(diào)到8.0，定容至1000mL。4℃冰箱保存，用時(shí)稀釋5倍。

2）加樣緩沖液的配制：0.25%溴酚藍(lán)，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。

3）溴化乙錠的配制：稱取0.1g溴化乙錠，溶于10mL水，配成終濃度為10mg/mL的母液，4℃冰箱保存。染色時(shí)，吸取12.5μL的母液，加入250mL的水中，使其終濃度為0.5μg/mL，混合均勻。

4）100×TE緩沖液的配制：1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA。稱取Tris 121.1g，EDTA-Na 237.23g，先用800mL雙蒸水，加熱攪拌溶解后，再用鹽酸調(diào)pH至8.0（大約加入鹽酸20mL），然后定容至1000mL。

5）100×電泳緩沖液的配制：4mol/L Tris-HCl（pH8.0），2mol/L醋酸鈉，200mmol/L EDTA。稱取Tris 242.2g，無水乙酸鈉82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL雙蒸水加熱攪拌溶解后，再用冰乙酸調(diào)pH至8.0（大約加入冰乙酸50mL），然后定容至500mL。用時(shí)稀釋100倍。

（2）電泳方法

1）安裝電泳槽：將有機(jī)玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開口封好，放在水平的工作臺(tái)上，插上樣品梳。

2）1%瓊脂糖凝膠的制備：稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，置微波爐或沸水浴中加熱至完全溶化，取出搖勻。

3）灌膠：將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。

4）待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。

5）加樣：將DNA樣品與加樣緩沖液按體積比4:1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加20μL，記錄樣品的點(diǎn)樣次序和加樣量。

6）電泳：安裝好電極導(dǎo)線，點(diǎn)樣孔一端接負(fù)極，另一端接正極，打開電源，調(diào)電壓至3-5V/cm，電泳1-3hr，當(dāng)溴酚藍(lán)移到距凝膠前沿1-2cm時(shí)，停止電泳。

7）染色和觀察：取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶。

4、酶切片段的回收和純化

使用Takara的膠回收試劑盒回收純化酶切的DNA片段。在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。

稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。向膠塊中加入膠塊溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量3凝膠體積。均勻混合后室溫25℃溶解膠塊10min。當(dāng)凝膠完全溶解后，加入3M醋酸鈉溶液（pH5.2）10μL，均勻混合至溶液恢復(fù)黃色。將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。0.2mL膠溶解液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。將700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12000rpm離心30秒鐘，棄濾液。再次將700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12000rpm離心30秒鐘，棄濾液。將Spin Column安置于Collection Tube上，室溫12000rpm離心1min。將Spin Column安置于新的1.5mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入30μL滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。室溫12000rpm離心1min洗脫DNA。

5、連接與轉(zhuǎn)化

連接體系為：酶切回收的合成序列1 7μL，酶切回收的pPIC9K質(zhì)粒1μL，T4 DNA ligase 1μL，Buffer 1μL。4℃連接24小時(shí)。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測序鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-1。

6、酵母菌感受態(tài)制備

（1）從平板上或保種管中，挑少許SMD1168酵母，在YPDA平板（YPDA培養(yǎng)基：胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，瓊脂20g/L（固體），腺嘌呤15mL/L 0.2%腺嘌呤，調(diào)節(jié)pH=7.5，121℃滅菌15min）上劃單克隆，30℃培養(yǎng)3天左右。

（2）從平板上分別挑取單克?。ㄖ睆?-3mm）到含有3mL YPDA的玻璃試管中（平行做3管）。

（3）30℃、50rpm培養(yǎng)8-12h。取200μL菌液，測OD₆₀₀。選取OD₆₀₀值最大的一個(gè)試管（即活力最高的一個(gè)），吸取5μL轉(zhuǎn)移至50mL新鮮的YPDA培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基裝在250mL三角瓶中）。

（4）30℃、230rpm培養(yǎng)16-20h，直至OD₆₀₀=0.15-0.3。

（5）將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)入2個(gè)50mL離心管，室溫3000g離心3min，棄上清，用100mL新鮮的YPDA懸起管底的菌體，并倒入干凈的三角瓶中。30℃、230rpm培養(yǎng)直到OD₆₀₀=0.4-0.5（3-5小時(shí)）。

（6）將菌液倒入2個(gè)50mL離心管，室溫3000g離心3min，棄上清，每個(gè)離心管用30mL milipore水重懸。

（7）再次3000g離心3min，棄上清，每管用1.4mL 1.1×TE/LiAc重懸。

（8）將重懸的菌液轉(zhuǎn)移到2個(gè)EP管中，12000rpm離心15s。

（9）棄上清，每管用600μL 1.1×TE/LiAc重懸，將兩管重懸菌液并入一管，得到酵母感受態(tài)細(xì)胞。

7、質(zhì)粒pPIC9K-1轉(zhuǎn)化酵母菌

質(zhì)粒pPIC9K-1用SacI線性化，往25μL pPIC9K-1中加入限制性內(nèi)切酶SacI酶0.2μL、酶切緩沖液及ddH₂O 24.8μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到pPIC9K-1酶切液。pPIC9k-1酶切液通過電泳回收純化得到線性化的pPIC9K-1質(zhì)粒。

往離心管中加入線性化的pPIC9K-1質(zhì)粒10μL，鮭魚精DNA（變性的，10mg/mL）5μL，加入酵母感受態(tài)細(xì)胞50μL，輕彈混勻；加入500μL PEG/LiAc輕彈混勻。30℃水浴30min，每10-15min輕彈混勻；加入20μL DMSO，輕彈混勻；42℃水浴15min，每5-10min輕彈混勻；12000rpm離心0.5min，棄上清；用1mL液體PDA培養(yǎng)基重懸；30℃、200rpm培養(yǎng)90min；12000r/m離心0.5min，棄上清；加入液體PDA培養(yǎng)基（含有0.9% NaCl）重懸，涂布含氨芐青霉素50μg/mL的PDA平板。

8、篩選

在含氨芐青霉素50μg/mL的PDA平板上篩選轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子，接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基（產(chǎn)酶培養(yǎng)基為含葡萄糖8g/L、甲醇3g/L的YPDA培養(yǎng)基）。

250mL三角瓶中裝入產(chǎn)酶培養(yǎng)基50mL，30℃、50rpm培養(yǎng)12h得到發(fā)酵醪液，測定發(fā)酵醪液中纖維素外切酶的酶活，酶活0.0052U/mL

纖維素外切酶酶活測定方法為：取2g微晶纖維素粉末，溶于20mL 0.2M醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.8）中，加入發(fā)酵醪液0.5mL，50℃水浴30min，DNS法[見文獻(xiàn)，甄靜, 王繼雯, 謝寶恩, 等. 一株纖維素降解真菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2011, 38(5): 709?714.]測定生成還原糖的量。酶活定義：每分鐘水解微晶纖維素生成1μM還原糖所需酶的量為1U。

9、纖維素外切酶在高鹽溶液中的熱穩(wěn)定性及嗜鹽度

取2g微晶纖維素粉末，溶于20mL 0.2M醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.8）中，加入NaCl，NaCl最終濃度為8%（w/w），加入上述步驟8中的發(fā)酵醪液0.5mL，測定酶活，酶活記為A，A=0.0052U/mL；或加入上述步驟8中的發(fā)酵醪液0.5mL，先52℃水浴45min后再測定酶活，酶活記為A₁，A₁=0.0044 U/mL。

熱穩(wěn)定性用A₁/A表示，值越大，說明該酶在高鹽度下的熱穩(wěn)定性越好，測定A₁/A =84.61%。

取2g微晶纖維素粉末，溶于20mL 0.2M醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.8）中，加入NaCl，NaCl終濃度為12%（w/w），加入上述步驟8中的發(fā)酵醪液0.5mL，測定酶活，酶活記為C，C=0.0050U/mL。

嗜鹽度用C/A表示，值越大，說明該酶對(duì)高鹽度適應(yīng)性好，測定C/A=96.15%。

實(shí)施例2

具體操作同實(shí)施例1，區(qū)別是將SEQ ID NO.5所示合成序列1換成SEQ ID NO.6所示合成序列2。最后篩選到的轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子在產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的發(fā)酵醪液的酶活為0.0053 U/mL，其在高鹽溶液中的酶活A(yù)為0.0058U/mL，A₁為0.0053 U/mL，酶活C為0.0066U/mL，熱穩(wěn)定性A₁/A =91.37%，嗜鹽度C/A= 113.79%。說明定向改造后的SEQ ID NO.4所示序列表達(dá)的纖維素外切酶在高鹽溶液中的熱穩(wěn)定性得到提高；對(duì)鹽度的適應(yīng)性增強(qiáng)，在12%的鹽度中有更高的酶活性。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。