發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及特異性地結(jié)合至腎相關(guān)抗原1(KAAG1)上的特異性抗體或抗原結(jié)合片段以及它們用于癌癥的治療、檢測(cè)和診斷的用途。特別考慮了將治療劑與這些抗體或抗原結(jié)合片段一起遞送至細(xì)胞。

發(fā)明背景

在美國(guó)，在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌占據(jù)女性中的最高腫瘤相關(guān)死亡率(杰瑪(Jemal)等人，2005)。在美國(guó)，它是女性中癌相關(guān)死亡的第四大原因(梅農(nóng)(Menon)等人，2005)。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)在2005年總計(jì)22,220個(gè)新病例并且將16,210例死亡歸因于該疾病(博納姆(Bonome)等人，2005)。對(duì)于過(guò)去30年，統(tǒng)計(jì)數(shù)字大體上保持相同-產(chǎn)生卵巢癌的大多數(shù)女性將死于這種疾病(錢伯斯(Chambers)和范德爾海登(Vanderhyden)，2006)。該疾病帶來(lái)1:70的壽命風(fēng)險(xiǎn)以及>60％的死亡率(錢伯斯(Chambers)和范德爾海登(Vanderhyden)，2006)。高死亡率是由于當(dāng)惡性腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散在卵巢以外時(shí)卵巢癌的早期檢測(cè)的困難。實(shí)際上，>80％的患者被診斷為患有晚期疾病(III期或IV期)(博納姆(Bonome)等人，2005)。這些患者有不良的預(yù)后，這反映為<45％的5年存活率，雖然80％至90％將最初對(duì)化療有反應(yīng)(貝雷克(Berek)等人，2000)。與較早時(shí)20％的5年存活率相比，這個(gè)增加的成就至少部分地是由于當(dāng)腫瘤組織局限于卵巢時(shí)最佳地減小腫瘤組織的體積的能力，這是針對(duì)卵巢癌的重要的預(yù)后因素(布里斯托(Bristow R.E.)，2000；布朗(Brown)等人，2004)。在被診斷患有早期疾病(I期)的患者中，5年存活率范圍為>90(錢伯斯(Chambers)和范德爾海登(Vanderhyden)，2006)。

卵巢癌包括從卵巢的表面上皮或從表面包涵體(surface inclusion)衍生的腫瘤的多相群。它們分為漿液性、粘液性、子宮內(nèi)膜樣性、透明細(xì)胞、以及布倫納(過(guò)渡)類型，對(duì)應(yīng)于女性生殖道器官中的不同類型的上皮(史(Shih)和庫(kù)爾曼(Kurman)，2005)。在這些類型中，漿液性腫瘤占診斷的卵巢癌病例的大約60％。每個(gè)組織學(xué)亞類進(jìn)一步分為三組：良性的、中間的(交界性腫瘤或低惡性傾向(LMP))、和惡性的，反映它們的臨床行為((塞德曼)Seidman等人，2002)。LMP表示10％至15％的被診斷為漿液性的腫瘤，并且是一個(gè)難題，因?yàn)樗鼈冋宫F(xiàn)非典型的核結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)移行為，然而它們與高級(jí)別(high-grade)漿液性腫瘤相比具有相當(dāng)?shù)偷那忠u性。在相同的時(shí)期內(nèi)，與晚期高級(jí)別疾病<45％的存活率不同，對(duì)于患有LMP腫瘤的患者的5年存活率是95％(貝雷克(Berek)等人，2000)。

目前，卵巢癌的診斷是部分地通過(guò)患者病史的常規(guī)分析、以及通過(guò)進(jìn)行體格檢查、超聲檢查和X射線檢查、以及血液學(xué)篩查而完成的。已經(jīng)報(bào)道用于血清生物標(biāo)記的早期血液學(xué)檢測(cè)的兩種替代策略。一種方法是通過(guò)質(zhì)譜法分析血清樣品以便發(fā)現(xiàn)未知身份的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，從而檢測(cè)癌癥的存在或不存在(莫爾(Mor)等人，2005；科扎克(Kozak)等人，2003)。然而，這個(gè)策略是昂貴的并且不是廣泛可用的?？商娲兀鞘褂每贵w微陣列、ELISA、或其他相似的方法檢測(cè)在血清中的已知蛋白質(zhì)/肽的存在或不存在。對(duì)于稱為CA-125(癌抗原-125)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記的血清檢測(cè)長(zhǎng)期以來(lái)已被廣泛地作為針對(duì)卵巢癌的標(biāo)記而執(zhí)行。然而，雖然卵巢癌細(xì)胞可以產(chǎn)生過(guò)量的這些蛋白質(zhì)分子，仍有一些其他癌癥(包括輸卵管癌或子宮內(nèi)膜癌(cancer of the lining of the uterus))、患有胰腺癌的人的60％、以及患有其他惡性腫瘤的人的20％-25％具有升高水平的CA-125。CA-125測(cè)試僅僅獲得對(duì)于大約50％的I期卵巢癌患者的真實(shí)陽(yáng)性結(jié)果，而具有獲得來(lái)自II、III、和IV期卵巢癌患者的真實(shí)陽(yáng)性結(jié)果的80％的可能性。其他20％的卵巢癌患者未顯示CA-125濃度的任何增加。另外，升高的CA-125測(cè)試可以指示與癌癥不相關(guān)的其他良性活動(dòng)，例如月經(jīng)、懷孕、或子宮內(nèi)膜異位。因此，當(dāng)早期疾病仍然是可治療的、展現(xiàn)<10％的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)時(shí)，這種測(cè)試對(duì)于該早期疾病的檢測(cè)具有非常有限的臨床應(yīng)用。甚至在添加針對(duì)CA-125的超聲篩查的情況下，PPV僅僅提高至大約20％(科扎克(Kozak)等人，2003)。因此，這個(gè)測(cè)試不是有效的篩查測(cè)試。

盡管疾病的病因?qū)W知識(shí)、侵襲性細(xì)胞減滅術(shù)、以及現(xiàn)代聯(lián)合化療的改進(jìn)，但在死亡率上僅有很小的變化。不好的結(jié)果已經(jīng)歸因于(1)缺乏適當(dāng)?shù)挠糜谠缙诩膊z測(cè)的與在這個(gè)階段的癥狀的微弱表現(xiàn)相結(jié)合的篩查測(cè)試-診斷經(jīng)常只是在進(jìn)展到后期之后才作出的，在此時(shí)癌癥的腹膜播散限制了有效治療，以及(2)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療策略的抵抗的頻繁產(chǎn)生，限制了患者的5年存活率的改進(jìn)。用于卵巢癌的初始化療方案包括卡鉑(Paraplatin)和紫杉醇(taxol)的結(jié)合。多年的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明這種結(jié)合在有效手術(shù)之后是最有效的-減小了患有新診斷的卵巢癌的大約80％女性中的腫瘤體積，并且40％至50％將具有完全消退-但研究繼續(xù)尋求改進(jìn)患者反應(yīng)的方法。最近的靶向難以到達(dá)的細(xì)胞的化療劑的腹腔輸注與靜脈內(nèi)遞送結(jié)合已經(jīng)增加了有效性。然而，嚴(yán)重的副作用常常導(dǎo)致不完全的療程。一些其他的化療劑包括多柔比星、順鉑、環(huán)磷酰胺、博來(lái)霉素、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、鹽酸拓?fù)涮婵?、異環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶以及美法侖。更為最近地，臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明：與全身靜脈化療相比較，順鉑的腹膜內(nèi)給藥賦予了存活優(yōu)勢(shì)(卡尼斯特拉(Cannistra)和麥圭爾(McGuire)，2007)。對(duì)于患有早期疾病接受化療的女性而言，優(yōu)異的存活率為開發(fā)改進(jìn)卵巢癌檢測(cè)的策略的研究工作提供了強(qiáng)的原理。此外，新的卵巢癌相關(guān)生物標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)將導(dǎo)致用于卵巢癌的未來(lái)治療的、具有最小副作用而更有效的治療策略的開發(fā)。

盡管這些在對(duì)于卵巢癌的理解和治療方面的最近進(jìn)展，化療的使用常常與嚴(yán)重的不良反應(yīng)相關(guān)，這些不良反應(yīng)限制了它們的使用。因此，對(duì)于更具特異性的策略(例如，抗原組織特異性與單克隆抗體的選擇性相結(jié)合)的需要將允許脫靶相關(guān)的副作用的顯著減少。隨著漸增數(shù)目的進(jìn)行的臨床試驗(yàn)，用于卵巢癌治療的單克隆抗體的使用正開始出現(xiàn)(Oei等人，2008；尼哥底母(Nicodemus)和貝雷克(berek)，2005)。這些試驗(yàn)中的大多數(shù)已經(jīng)檢驗(yàn)了與放射性同位素(例如釔-90)結(jié)合的單克隆抗體、或者靶向已經(jīng)在其他癌類型中鑒定的腫瘤抗原的抗體的用途。對(duì)此的一個(gè)實(shí)例是貝伐單抗的使用，它靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(伯格(Burger)，2007)。存在非常少的、當(dāng)前作為用于單克隆抗體的治療靶標(biāo)而被研究的卵巢癌特異性抗原。一些實(shí)例包括稱為B7-H4的蛋白質(zhì)(西蒙(Simon)等人，2006)以及更近地葉酸受體-α(埃貝爾(Ebel)等人，2007)的使用，后者近來(lái)已經(jīng)進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)。

腎相關(guān)抗原1(KAAG1)是最初從衍生自組織相容性白細(xì)胞抗原-B7腎癌細(xì)胞系的cDNA文庫(kù)克隆的，作為呈遞至細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的抗原肽(Van den Eynde等人，1999；Genbank登錄號(hào)Q9UBP8，SEQ ID NO.:28；29)。發(fā)現(xiàn)含有KAAG1的基因座編碼轉(zhuǎn)錄在相對(duì)的DNA鏈上的兩種基因。發(fā)現(xiàn)有義鏈編碼一種轉(zhuǎn)錄物，該轉(zhuǎn)錄物編碼稱為DCDC2的蛋白質(zhì)。由這些作者進(jìn)行的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，KAAG1反義轉(zhuǎn)錄物是腫瘤特異性的并且在正常組織中展現(xiàn)非常少的表達(dá)，而DCDC2有義轉(zhuǎn)錄物被廣泛表達(dá)(Van den Eynde等人，1999)。在公開的專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/CA 2007/001134(其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此)中披露了在癌癥中并且特別是在卵巢癌、腎癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌以及黑色素瘤中的KAAG1轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。Van den Eynde等人還觀察到在腎癌、結(jié)腸直腸癌、黑色素瘤、肉瘤、白血病、腦腫瘤、甲狀腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌、以及頭頸腫瘤中的RNA表達(dá)。近來(lái)，通過(guò)連鎖不平衡研究獲得的強(qiáng)的遺傳證據(jù)發(fā)現(xiàn)VMP/DCDC2/KAAG1基因座與誦讀困難相關(guān)(舒馬赫(Schumacher)等人，2006；科普(Cope)等人，2005)。這些報(bào)道之一指向作為誦讀困難患者中的罪魁禍?zhǔn)?culprit)的DCDC2標(biāo)記，因?yàn)樵谄べ|(zhì)神經(jīng)元遷移中這種蛋白質(zhì)的功能與常常展現(xiàn)異常的神經(jīng)元遷移和成熟的這些患者的癥狀一致(舒馬赫(Schumacher)等人，2006)。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及特異性抗-KAAG1抗體和抗原結(jié)合片段以及它們用于包含表達(dá)KAAG1或KAAG1變體的腫瘤細(xì)胞的癌癥的治療、檢測(cè)和診斷的用途。這樣的癌癥的示例性實(shí)施例包括例如卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及頭頸癌。

抗體或抗原結(jié)合片段在靶向在腫瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)的KAAG1或KAAG1變體方面可以是特別有效的。

事實(shí)上，與例如在PCT/CA 2009/001586(其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此)中披露的3D3和3G10抗體相比較，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段顯現(xiàn)出具有改進(jìn)的與表達(dá)KAAG1的腫瘤細(xì)胞結(jié)合的能力。這些抗體和抗原結(jié)合片段還被內(nèi)化并且可以因此在將治療劑遞送至腫瘤細(xì)胞中是有用的。我們的結(jié)果表明，具有所希望特征(例如，改進(jìn)的結(jié)合和內(nèi)化)的抗體和抗原結(jié)合片段通常結(jié)合至KAAG1上的由氨基酸61至84界定的C端區(qū)域。然而，雖然3A4和3G10抗體兩者都結(jié)合至相同的區(qū)域上，3A4抗體顯現(xiàn)出比3G10抗體更有效地結(jié)合至腫瘤細(xì)胞的表面上。具體而言，在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)(一種測(cè)量抗體與細(xì)胞表面的直接結(jié)合的方法)中，表達(dá)KAAG1抗原的癌細(xì)胞需要比3G10大致少10倍的3A4。另外，在使用表面等離子體共振的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)3A4對(duì)KAAG1的親和常數(shù)(K_D)是在10皮摩爾以下，而抗體3D3和3G10展現(xiàn)出大于200皮摩爾的親和常數(shù)(K_D)(低20倍的親和力)。因此，預(yù)期3A4在結(jié)合能力方面的這些增加轉(zhuǎn)化為改進(jìn)的治療活性。

本發(fā)明在其一方面提供了一種分離的或基本上純化的抗體或抗原結(jié)合片段，該抗體或抗原結(jié)合片段可以能夠特異性地結(jié)合至一個(gè)序列，該序列與位于KAAG1(SEQ ID NO.:29)的氨基酸61至84之間的至少10個(gè)(例如10至20個(gè)或更多個(gè))連續(xù)氨基酸是一致的。

本發(fā)明還提供了能夠與在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)的分離的抗體或抗原結(jié)合片段。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有在此所述的氨基酸序列的特異性抗體或抗原結(jié)合片段。這樣的抗體或抗原結(jié)合片段可以處于單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體(分離的)的形式，連同具有在此所述的特征的抗原結(jié)合片段。與此一道還包括這樣的抗體或抗原結(jié)合片段：這些抗體或抗原結(jié)合片段包括在單克隆、嵌合、人源化或人抗體之間的輕鏈和/或重鏈的排列。

本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可以因此包含人抗體的人恒定區(qū)和/或框架氨基酸。

術(shù)語(yǔ)“抗體”是指完整抗體、單克隆抗體或多克隆抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括多特異性抗體，例如雙特異性抗體。人抗體通常是由各自包含可變區(qū)和恒定區(qū)的兩條輕鏈和兩條重鏈組成。輕鏈可變區(qū)包含3個(gè)CDR，在此鑒定為側(cè)翼是框架區(qū)的CDRL1或L1、CDRL2或L2以及CDRL3或L3。重鏈可變區(qū)包含3個(gè)CDR，在此鑒定為側(cè)翼是框架區(qū)的CDRH1或H1、CDRH2或H2以及CDRH3或H3。已經(jīng)使用卡巴特(Kabat)和肖蒂亞(Chotia)定義鑒定了本發(fā)明的人源化抗體的CDR(例如在SEQ ID NO.:56中列出的CDRH2)。然而，其他人(阿比南旦(Abhinandan)和馬丁(Martin)，2008)已經(jīng)使用了寬松地基于Kabat和Chotia的改良的方法，得到較短的CDR(例如，在SEQ ID NO.:6中列出的CDRH2)的描述。

如在此使用的術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”是指保留與抗原(例如，KAAG1、KAAG1的分泌形式或其變體)結(jié)合的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以由完整抗體的片段執(zhí)行。包含在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合片段”之內(nèi)的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')₂片段，包含在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fd片段，由V_H和C_H1結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，由抗體的單臂的V_L和V_H結(jié)構(gòu)域組成，(v)dAb片段(華德(Ward)等人，(1989)《自然》(Nature)341:544-546)，由V_H結(jié)構(gòu)域組成；以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(例如，V_H CDR3)。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域V_L和V_H由獨(dú)立的基因編碼，可以使用重組方法通過(guò)使它們能夠被制造為單一多肽鏈的合成接頭而將它們結(jié)合，該單一多肽鏈中的V_L和V_H區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv))；參見例如伯德(Bird)等人(1988)《自然》(Science)242:423-426；以及赫斯頓(Huston)等人(1988)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體還旨在被包含在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合片段”之內(nèi)。此外，抗原結(jié)合片段包括結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白，這些結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白包含(i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合域多肽(例如重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、或經(jīng)由接頭肽而與輕鏈可變區(qū)融合的重鏈可變區(qū))，(ii)與鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，以及(iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。鉸鏈區(qū)可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基用絲氨酸殘基替換而被修飾，從而防止二聚化。這樣的結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白進(jìn)一步披露于US 2003/0118592和US2003/0133939中。這些抗體片段是使用對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言已知的常規(guī)技術(shù)而獲得的，并且按照與完整抗體相同的方式對(duì)這些片段的效用進(jìn)行了篩選。

術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”包括全人源化抗體(即，框架是100％人源化的)以及部分人源化抗體(例如，至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域含有來(lái)自人抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，同時(shí)其他氨基酸是非人親本抗體的氨基酸)。典型地，“人源化抗體”含有非人親本抗體(例如，小鼠、大鼠、兔子、非人靈長(zhǎng)類，等等)的CDR、以及與天然人抗體或人抗體共有序列的那些一致的框架。在這種情況下，那些“人源化抗體”表征為全人源化?！叭嗽椿贵w”還可以含有一種或多種氨基酸置換，這些置換不對(duì)應(yīng)于人抗體或人抗體共有序列的那些。這樣的置換包括例如可以保留抗體特征(例如，親和力、特異性，等等)的回復(fù)突變(例如，非人氨基酸的再引入)。這樣的置換通常是在框架區(qū)?！叭嗽椿贵w”任選地還包含：典型地為人抗體的恒定區(qū)(Fc)的至少一部分。典型地，“人源化抗體”的恒定區(qū)與人抗體的恒定區(qū)是一致的。

術(shù)語(yǔ)“天然人抗體”是指由人抗體譜(即，種系序列)編碼的(可編碼的)抗體。

術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指具有非人可變區(qū)和人恒定區(qū)的抗體。

術(shù)語(yǔ)“雜交抗體”是指這樣一種抗體：包含來(lái)自某些類型的抗體(例如，人源化的)的它的重鏈或輕鏈可變區(qū)(它的重鏈或輕鏈)之一，而另一個(gè)重鏈或輕鏈可變區(qū)(重鏈或輕鏈)是來(lái)自另一種類型(例如，鼠，嵌合的)。

在一些實(shí)施例中，人源化抗體的重鏈和/或輕鏈框架區(qū)可以包含來(lái)自非人抗體(旨在被人源化)的從一至三十個(gè)氨基酸以及來(lái)自天然人抗體或人抗體共有序列的剩余部分。在一些情況下，人源化抗體可以包含從1至6個(gè)非人CDR并且六個(gè)CDR常常是非人的。

被選擇用于非人親本抗體的人源化的天然人抗體可以包含一個(gè)可變區(qū)，該可變區(qū)具有與非人親本抗體的(模式化)可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)(可重疊的)相似的三維結(jié)構(gòu)。像這樣，人源化抗體具有更大的具有與非人親本抗體的三維結(jié)構(gòu)相似的三維結(jié)構(gòu)的可能性。

被選擇用于人源化目的的天然人抗體的輕鏈可變區(qū)可以具有例如在整體上(在整個(gè)輕鏈可變區(qū)上)與非人親本抗體的輕鏈可變區(qū)至少70％、75％、80％等的一致性?？商娲兀贿x擇用于人源化目的的天然人抗體的輕鏈框架區(qū)可以具有例如與非人親本抗體的輕鏈框架區(qū)至少70％、75％、80％、85％等的序列一致性。在一些實(shí)施例中，被選擇用于人源化目的的天然人抗體在其輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)中可以具有與非人親本抗體的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)相同或基本上相同數(shù)目的氨基酸。

被選擇用于人源化目的的天然人抗體的重鏈可變區(qū)可以具有例如在整體上(在整個(gè)重鏈可變區(qū)上)與非人親本抗體的重鏈可變區(qū)至少60％、70％、75％、80％等的一致性。同樣，根據(jù)本發(fā)明，人源化抗體重鏈的人框架區(qū)氨基酸殘基可以來(lái)自天然人抗體重鏈框架區(qū)，該天然人抗體重鏈框架區(qū)具有與非人親本抗體的重鏈框架區(qū)至少70％、75％、89％等的一致性。在一些實(shí)施例中，被選擇用于人源化目的的天然人抗體在其重鏈互補(bǔ)決定區(qū)可以具有與非人親本抗體的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)相同或基本上相同數(shù)目的氨基酸。

被選擇用于非人親本抗體的人源化的天然人抗體可以包含一個(gè)可變區(qū)，該可變區(qū)具有與非人親本抗體的(模式化)可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)(可重疊的)相似的三維結(jié)構(gòu)。像這樣，人源化或雜交抗體具有更大的具有與非人親本抗體的三維結(jié)構(gòu)相似的三維結(jié)構(gòu)的可能性。

例如，可以被選擇用于人源化目的的天然人抗體重鏈可變區(qū)可以具有以下特征：a)與非人抗體重鏈的三維結(jié)構(gòu)相似或相同的(可重疊的)三維結(jié)構(gòu)，和/或b)具有與非人抗體的重鏈框架區(qū)至少70％一致的氨基酸序列的框架區(qū)。任選地，在重鏈CDR(例如，所有三個(gè)CDR)中的(許多個(gè))氨基酸殘基與非人重鏈CDR氨基酸殘基相同或基本上相同。

可替代地，可以被選擇用于人源化目的的天然人抗體輕鏈可變區(qū)可以具有以下特征：a)與非人抗體輕鏈的三維結(jié)構(gòu)相似或相同的(可重疊的)三維結(jié)構(gòu)，和/或b)具有與非人抗體的輕鏈框架區(qū)至少70％一致的氨基酸序列的框架區(qū)。任選地，在輕鏈CDR(例如，所有三個(gè)CDR)中的(許多個(gè))氨基酸殘基與非人輕鏈CDR氨基酸殘基相同或基本上相同。

典型的抗原結(jié)合部位包含由輕鏈免疫球蛋白與重鏈免疫球蛋白配對(duì)形成的可變區(qū)?？贵w可變區(qū)的結(jié)構(gòu)是非常一致的并且展現(xiàn)非常相似的結(jié)構(gòu)。這些可變區(qū)典型地包含相對(duì)同源的框架區(qū)(FR)，這些框架區(qū)被三個(gè)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)間隔開?？乖Y(jié)合片段的整體結(jié)合活性常常由CDR的序列決定。FR對(duì)于最優(yōu)的抗原結(jié)合而言常常起著CDR的三維上的正確定位和比對(duì)的作用。

本發(fā)明的抗體和/或抗原結(jié)合片段可以例如源于小鼠、大鼠或任何其他哺乳動(dòng)物或源于其他來(lái)源(例如，通過(guò)重組DNA技術(shù))。

根據(jù)下文所給出的非限制性詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的進(jìn)一步的范圍、適用性和優(yōu)勢(shì)將變得清楚。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，這個(gè)詳細(xì)說(shuō)明在指示本發(fā)明的示例性實(shí)施例時(shí)僅僅是以舉例的方式并參考附圖而給出的。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示了來(lái)自ELISA的結(jié)果，ELISA將當(dāng)與漸增濃度的重組人KAAG1一起孵育時(shí)3A4嵌合抗-KAAG1抗體的結(jié)合與對(duì)照抗體的結(jié)合進(jìn)行了比較。3A4的結(jié)合曲線由較淺顏色的線顯示。

圖2顯示了一個(gè)直方圖，該直方圖描述了來(lái)自ELISA分析的結(jié)果從而映射3A4抗-KAAG1抗體的表位特異性。結(jié)果顯示3A4與包含在氨基酸61-84之間的KAAG1羧基端之內(nèi)的氨基酸序列相互作用。將3A4與3C4、3D3、和3G10抗-KAAG1抗體的結(jié)合進(jìn)行了比較，已知這些抗體分別與KAAG1的區(qū)域1-35、36-60、以及61-84相互作用。

圖3A顯示了用3A4抗-KAAG1抗體(顏色較深的線)與用對(duì)照IgG(顏色較淺的線)對(duì)SKOV-3和TOV-21G卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)的比較結(jié)果。

圖3B顯示了用3A4抗-KAAG1抗體(顏色較深的線)與用對(duì)照IgG(顏色較淺的線)對(duì)293E人腎細(xì)胞進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)的比較結(jié)果。

圖4表示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)用3A4抗-KAAG1抗體對(duì)SKOV-3細(xì)胞表面上的KAAG1抗原的檢測(cè)。當(dāng)細(xì)胞在37C被孵育時(shí)，熒光信號(hào)隨著時(shí)間降低，表明當(dāng)細(xì)胞與3A4一起孵育時(shí)，KAAG1/抗體復(fù)合物在孵育期間被內(nèi)化。

圖5顯示了3A4抗-KAAG1的內(nèi)化和它與LAMP1的共定位，LAMP1是一種與內(nèi)體和溶酶體膜相關(guān)的蛋白質(zhì)。

圖6A和6B是表示暴露至不同的抗-KAAG1抗體的腫瘤細(xì)胞的FAC分析的圖。

圖7是代表在細(xì)胞膜中的KAAG1取向的2種可能的圖示的原理圖。

圖8是鼠3A4可變結(jié)構(gòu)域的分子模型(帶狀圖)。CDR環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。

圖9a是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh1Hh1(即，人源化輕鏈1和人源化重鏈1)的分子模型。CDR環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh1指定變體1的人源化輕鏈，而Hh1指定變體1的重鏈。

圖9b是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh1Hh2(即，人源化輕鏈1和人源化重鏈2)的分子模型。CDR環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記。框架區(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh1指定變體1的人源化輕鏈，而Hh2指定變體2的重鏈。

圖9c是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh1Hh3(即，人源化輕鏈1和人源化重鏈3)的分子模型。CDR環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh1指定變體1的人源化輕鏈，而Hh3指定變體3的重鏈。

圖9d是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh1Hh4(即，人源化輕鏈1和人源化重鏈4)的分子模型。CDR環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh1指定變體1的人源化輕鏈，而Hh4指定變體4的重鏈。

圖9e是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh2Hh1(即，人源化輕鏈2和人源化重鏈1)的分子模型。CDR環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh2指定變體2的人源化輕鏈，而Hh1指定變體1的重鏈。

圖9f是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh2Hh2(即，人源化輕鏈2和人源化重鏈2)的分子模型。CDR環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh2指定變體2的人源化輕鏈，而Hh2指定變體2的重鏈。

圖9g是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh2Hh3(即，人源化輕鏈2和人源化重鏈3)的分子模型。CDR環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh2指定變體2的人源化輕鏈，而Hh3指定變體3的重鏈。

圖9h是3A4可變結(jié)構(gòu)域的人源化抗體Lh2Hh4(即，人源化輕鏈2和人源化重鏈4)的分子模型。CDR環(huán)著黑色，并且在輕鏈中用L1、L2和L3標(biāo)記，而在重鏈中用H1、H2和H3標(biāo)記?？蚣軈^(qū)顯示為灰色。從鼠框架突變?yōu)槿丝蚣艿臍埢膫?cè)鏈描繪為球-和-棍圖示。Lh2指定變體2的人源化輕鏈，而Hh4指定變體4的重鏈。

圖10a是鼠和人源化輕鏈的3A4可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)。輕鏈具有兩種人源化變體(Lh1和Lh2)。CDR顯示為粗體，并且由CDRL1、CDRL2和CDRL3指示。在人源化序列中，是鼠氨基酸的、在人框架區(qū)內(nèi)的回復(fù)突變加有下劃線。

圖10b是鼠和人源化重鏈的3A4可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)。重鏈具有四種人源化變體(Hh1至Hh4)。CDR顯示為粗體，并且由CDRH1、CDRH2和CDRH3指示。在人源化序列中，是鼠氨基酸的、在人框架區(qū)內(nèi)的回復(fù)突變加有下劃線。

圖11A是使用ClustalW2程序(拉金(Larkin M.A.)，等人，(2007)ClustalW和ClustalX版本2.《生物信息學(xué)》(Bioinformatics)2007 23(21):2947-2948)的鼠3A4輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO.:4)與輕鏈可變區(qū)變體(SEQ ID NO.:33)的比對(duì)，其中“*”(星號(hào))指示具有單個(gè)完全保守的殘基的位置，其中“：”(冒號(hào))指示在具有強(qiáng)相似特性的組之間的保守性(強(qiáng)相似特性即在Gonnet PAM 250矩陣中的得分>0.5)，并且其中“?！?句點(diǎn))指示在具有弱相似特性的組之間的保守性(弱相似特性即在Gonnet PAM250矩陣中的得分＝<0.5)。

圖11B是使用ClustalW2程序(拉金(Larkin M.A.)，等人，(2007)ClustalW和ClustalX版本2.《生物信息學(xué)》(Bioinformatics)2007 23(21):2947-2948)的鼠3A4重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO.:2)與輕鏈可變區(qū)變體(SEQ ID NO.:38)的比對(duì)，其中“*”(星號(hào))指示具有單個(gè)完全保守的殘基的位置，其中“：”(冒號(hào))指示在具有強(qiáng)相似特性的組之間的保守性(強(qiáng)相似特性即在Gonnet PAM 250矩陣中的得分>0.5)，并且其中“。”(句點(diǎn))指示在具有弱相似特性的組之間的保守性(弱相似特性即在Gonnet PAM250矩陣中的得分＝<0.5)。

圖12a表示pKCR5-3A4-HC-變體1的質(zhì)粒圖譜。人源化3A4變體的重鏈以相同方式被克隆到pK-CR5的HindIII位點(diǎn)中。因此，所得質(zhì)粒與pKCR5-3A4-HC變體1相同，除了重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的序列之外。

圖12b表示pMPG-CR5-3A4-LC-變體1的質(zhì)粒圖譜。3A4抗體的人源化變體1和2的輕鏈以相同方式被克隆到pMPG-CR5的BamHI位點(diǎn)中。因此，所得質(zhì)粒與pMPG-CR5-3A4-LC-變體1相同，除了輕鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的序列之外。

圖13表示在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞之后抗體產(chǎn)生的分析。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)分析用人源化3A4抗體的輕鏈和重鏈的不同組合轉(zhuǎn)染的CHOcTA細(xì)胞的上清液(轉(zhuǎn)染后13天)。在上清液中產(chǎn)生的抗體的定量是在針對(duì)已知標(biāo)準(zhǔn)品(純化的人類IgG抗體)的稀釋物的蛋白質(zhì)印跡的帶掃描之后確定的。Mr分子量標(biāo)記(kDa)。

圖14是重組KAAG1樣品的Superdex G75凝膠過(guò)濾的曲線圖。將KAAG1注入經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾，并且以0.4ml/min進(jìn)行分離。最大的峰在15-19部分之間。

圖15是列出了鼠3A4抗體和3A4抗體的人源化變體的速率常數(shù)和親和常數(shù)的表格。

圖16A是展示了人源化抗體的締合速率(K_a)的直方圖。

圖16B是展示了人源化抗體的解離速率(K_d)的直方圖。

圖16C是展示了人源化抗體的親和常數(shù)(K_D)的直方圖。

圖17a展示了在ELISA中結(jié)合至KAAG1上的人源化3A4變體。這個(gè)圖顯示了3A4人源化抗體變體和鼠3A4的對(duì)比結(jié)合。與Lh1輕鏈變體組裝的人源化重鏈(Hh1、Hh2、Hh3和Hh4)的濃度依賴性結(jié)合曲線。

圖17b展示了在ELISA中結(jié)合至KAAG1上的人源化3A4變體。這個(gè)圖顯示了3A4人源化抗體變體和鼠3A4的對(duì)比結(jié)合。與Lh2輕鏈變體組裝的人源化重鏈(Hh1、Hh2、Hh3和Hh4)的濃度依賴性結(jié)合曲線。

圖18展示了結(jié)合至癌細(xì)胞表面上的KAAG1的人源化3A4變體。這個(gè)圖解顯示了人源化和鼠3A4抗體在未透性化的SKOV-3卵巢癌細(xì)胞上的對(duì)比結(jié)合活性。

發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明

KAAG1在癌細(xì)胞中的表達(dá)和生物活性

本發(fā)明涉及抗體的用途，這些抗體靶向在不同癌類型(特別是卵巢癌)中發(fā)現(xiàn)的腫瘤。為了將抗體導(dǎo)向腫瘤，在癌細(xì)胞細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤特異性抗原的鑒定是必須進(jìn)行的。有若干可供使用以鑒定腫瘤特異性抗原的技術(shù)，并且用于鑒定在卵巢腫瘤中的KAAG1的方法(即稱為mRNA的基于轉(zhuǎn)錄的消減擴(kuò)增(STAR)的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)平臺(tái))描述于公開的專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/CA2007/001134中，該申請(qǐng)?zhí)栐?007年12月27日在WO/2007/147265號(hào)之下公開。

卵巢癌STAR文庫(kù)的分析產(chǎn)生了許多編碼分泌的和細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)的基因。這些中的之一，稱為AB-0447，含有一個(gè)開放閱讀框，該開放閱讀框編碼一種相應(yīng)于SEQ ID NO.:29的84個(gè)氨基酸的多肽，SEQ ID NO.:29由一種885個(gè)堿基對(duì)的cDNA編碼，該cDNA具有在SEQ ID NO.:28中顯示的核苷酸序列。公開可用的數(shù)據(jù)庫(kù)的研究揭示了AB-0447核苷酸序列與稱為KAAG1的基因的核苷酸序列一致。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了將其功能結(jié)構(gòu)域呈遞至細(xì)胞外室的膜錨定蛋白。KAAG1是最初從腎癌文庫(kù)作為細(xì)胞表面抗原而被克隆的，這是證實(shí)它的膜定位的一個(gè)結(jié)果。另外，我們的研究顯示該蛋白質(zhì)是在其氨基端被加工，這個(gè)結(jié)果與功能性信號(hào)肽在氨基酸30和34上或它們之間的裂解一致。此外，全長(zhǎng)cDNA的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致在培養(yǎng)基中裂解的KAAG1的檢測(cè)。這個(gè)最終發(fā)現(xiàn)指示這種膜錨定蛋白可以在以高水平表達(dá)時(shí)從細(xì)胞脫落。相比之下，KAAG1的氨基截短突變體的表達(dá)導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)保留。當(dāng)前沒(méi)有任何闡明它的功能的公開報(bào)道，并且如由本發(fā)明披露的卵巢癌中KAAG1的過(guò)度表達(dá)在以前從未有文件記錄過(guò)。

因此我們已經(jīng)研究了KAAG1是否可以用于基于抗體的診斷和治療。

已經(jīng)建立了若干基于卵巢癌細(xì)胞的模型，例如TOV-21G、TOV-112D、OV-90以及其他，并且這些模型對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的。這些細(xì)胞是人卵巢癌細(xì)胞系的集合的一部分，這些人卵巢癌細(xì)胞系衍生自具有卵巢腫瘤或腹水液的患者。這些細(xì)胞系已經(jīng)經(jīng)歷深入分析，包括在微陣列上的全基因表達(dá)譜，這些微陣列使這些細(xì)胞系成為優(yōu)異的用于人卵巢癌的基于細(xì)胞的模型。生長(zhǎng)特性、基因表達(dá)譜以及對(duì)化學(xué)治療藥的反應(yīng)指示這些細(xì)胞系對(duì)于卵巢腫瘤體內(nèi)行為是非常具有代表性的(貝諾特等人，2007)。從這些卵巢癌細(xì)胞系分離的總RNA的RT-PCR分析顯示KAAG1轉(zhuǎn)錄物弱表達(dá)于從原發(fā)性腫瘤衍生的細(xì)胞系中。相比之下，源于腹水液的細(xì)胞系包含高水平的KAAG1表達(dá)。在來(lái)自腹水液的細(xì)胞中KAAG1的增加的表達(dá)表明細(xì)胞的環(huán)境影響KAAG1基因的調(diào)節(jié)。腹水細(xì)胞與晚期疾病相關(guān)，并且這種表達(dá)模式意味著增加的KAAG1水平與錨定非依賴性生長(zhǎng)(anchorage-independent growth)相關(guān)。與這個(gè)后者的表明一致，發(fā)現(xiàn)當(dāng)將這些細(xì)胞在3D培養(yǎng)下培養(yǎng)為球狀體細(xì)胞時(shí)，在從原發(fā)性腫瘤衍生的細(xì)胞系中KAAG1表達(dá)顯著增加。這些球狀體細(xì)胞已經(jīng)被廣泛表征，并且發(fā)現(xiàn)其展示出許多與體內(nèi)腫瘤相關(guān)的特性(科迪(Cody)等人，2008)。因此，發(fā)現(xiàn)在模擬腫瘤進(jìn)展(特別是在卵巢癌的演化過(guò)程中)的模型中KAAG1的表達(dá)顯著增加。

隨著在卵巢癌細(xì)胞中KAAG1表達(dá)被調(diào)節(jié)的證明，在基于細(xì)胞的測(cè)定中檢驗(yàn)了這種基因在卵巢癌細(xì)胞行為中的功能。為此目的，使用RNA干擾(RNAi)來(lái)敲低卵巢癌細(xì)胞系中的內(nèi)源性KAAG1基因的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)KAAG1的降低的表達(dá)導(dǎo)致如在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性測(cè)定中所確定的細(xì)胞遷移的顯著減少，如由傷口愈合(或擦傷)分析所舉例說(shuō)明的。這種類型的分析測(cè)量了細(xì)胞填充一個(gè)融合單層中的裸露區(qū)的速度。KAAG1的表達(dá)降低導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞系的存活的降低，如通過(guò)克隆生成測(cè)定(例如集落存活分析)所測(cè)量的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用其他方法來(lái)評(píng)估KAAG1在癌細(xì)胞(特別是卵巢癌細(xì)胞)的行為中的需要。

基于在大比例的卵巢腫瘤中KAAG1的表達(dá)、它在正常組織中的有限表達(dá)、以及在表達(dá)水平和增加的惡性之間的一致性、以及KAAG1在卵巢癌細(xì)胞系的行為中的假定的生物作用，將KAAG1選擇作為治療靶標(biāo)，以用于開發(fā)用于卵巢癌的檢測(cè)、預(yù)防、和治療的抗體。KAAG1在除了卵巢癌之外的癌癥中的表達(dá)還引導(dǎo)申請(qǐng)人對(duì)用于其他癌癥適應(yīng)癥的治療性或診斷性抗體進(jìn)行評(píng)估。

因此本發(fā)明提供了抗-KAAG1抗體和其抗原結(jié)合片段，它們特異性地靶向KAAG1并且可以例如用作抗體-藥物結(jié)合物。

這樣的抗體和抗原結(jié)合片段包括例如單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、抗體片段、單鏈抗體、域抗體、以及具有抗原結(jié)合區(qū)的多肽。

結(jié)合至KAAG1上的抗體和抗原結(jié)合片段

最初將抗體針對(duì)它們對(duì)感興趣抗原的特異性而從Fab文庫(kù)分離。

在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段的可變區(qū)可以與所希望的物種的恒定區(qū)融合，由此允許抗體由所希望的物種的效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別。恒定區(qū)可以例如源于IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亞型?？寺』蚝铣煽騼?nèi)恒定區(qū)與可變區(qū)在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的范圍之內(nèi)，并且可以例如通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)進(jìn)行。因此，包含人抗體恒定區(qū)的抗體以及包含人抗體框架氨基酸的抗體或抗原結(jié)合片段也被本發(fā)明包括。

本發(fā)明因此提供了示例性實(shí)施例，包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)的一種分離的抗體或抗原結(jié)合片段，該輕鏈可變區(qū)具有；

a.一個(gè)CDRL1序列，該CDRL1序列包含SEQ ID NO.:8或如在SEQID NO.:8中所列出的；

b.一個(gè)CDRL2序列，該CDRL2序列包含SEQ ID NO.:9或如在SEQID NO.:9中所列出的，或；

c.一個(gè)CDRL3序列，該CDRL3序列包含SEQ ID NO.:10或如在SEQID NO.:10中所列出的。

分離的抗體或抗原結(jié)合片段還可以包含一個(gè)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)具有；

a.一個(gè)CDRH1序列，該CDRH1序列包含SEQ ID NO.:5或如在SEQID NO.:5中所列出的；

b.一個(gè)CDRH2序列，該CDRH2序列包含SEQ ID NO.:6或如在SEQID NO.:6中所列出的，或；

c.一個(gè)CDRH3序列，該CDRH3序列包含SEQ ID NO.:7或如在SEQID NO.:7中所列出的。

在一個(gè)示例性實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含輕鏈可變區(qū)的任何單獨(dú)的CDR或者CDR1、CDR2和/或CDR3的組合。可以更具體地選擇CDR3。組合可以包括例如CDRL1和CDRL3，CDRL1和CDRL2，CDRL2和CDRL3以及，CDRL1、CDRL2和CDRL3。

在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含重鏈可變區(qū)的任何單獨(dú)的CDR或者CDR1、CDR2和/或CDR3的組合?？梢愿唧w地選擇CDR3。組合可以包括例如CDRH1和CDRH3，CDRH1和CDRH2，CDRH2和CDRH3以及，CDRH1、CDRH2和CDRH3。

根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含CDRL1、CDRL2或CDRL3中的至少兩個(gè)CDR。

同樣，根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含一個(gè)CDRL1、一個(gè)CDRL2和一個(gè)CDRL3。

進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含：

a.CDRL1、CDRL2或CDRL3中的至少兩個(gè)CDR以及；

b.一個(gè)CDRH1、一個(gè)CDRH2或一個(gè)CDRH3中的至少兩個(gè)CDR。

抗體或抗原結(jié)合片段可以更優(yōu)選地包含一個(gè)CDRL1、一個(gè)CDRL2和一個(gè)CDRL3。

抗體或抗原結(jié)合片段也可以更優(yōu)選地包含一個(gè)CDRH1、一個(gè)CDRH2和一個(gè)CDRH3。

根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含一個(gè)CDRH1、一個(gè)CDRH2或一個(gè)CDRH3。

根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結(jié)合片段也可以包含一個(gè)CDRH1、一個(gè)CDRH2和一個(gè)CDRH3。

當(dāng)輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)僅有一者可獲得時(shí)，可以使用在本領(lǐng)域中已知的方法通過(guò)篩選互補(bǔ)可變區(qū)文庫(kù)而重建抗體或抗原結(jié)合片段(波爾托拉諾(Portolano)等人《免疫學(xué)雜志》(The Journal of Immunology)(1993)150:880-887，克拉克森(Clarkson)等人，《自然》(Nature)(1991)352:624-628)。

本發(fā)明還包括含有在此處所述的CDR的至少一者中具有至少一個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。

本發(fā)明還包括含有在至少兩個(gè)CDR中具有至少一個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。

本發(fā)明還包括含有在3個(gè)CDR中具有至少一個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。

本發(fā)明還包括含有在至少一個(gè)CDR中具有至少兩個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。

本發(fā)明還包括含有在至少兩個(gè)CDR中具有至少兩個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。

本發(fā)明還包括含有在3個(gè)CDR中具有至少兩個(gè)保守性氨基酸置換(與原始CDR相比較)的可變鏈的多肽或抗體。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種多肽、抗體或抗原結(jié)合片段，它們包含(在單一多肽鏈上或在多個(gè)分開的多肽鏈上)在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段之一的輕鏈可變區(qū)的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)以及重鏈可變區(qū)的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)。

本發(fā)明在其另一個(gè)方面涉及抗-KAAG1抗體，這些抗-KAAG1抗體可以包含(在單一多肽鏈上或在多個(gè)分開的多肽鏈上)在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段的所有六個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。

變體抗體和抗原結(jié)合片段

本發(fā)明還包括在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段的變體。所包括的變體抗體或抗原結(jié)合片段是具有在氨基酸序列中的變異的那些。例如，所包括的變體抗體或抗原結(jié)合片段是具有至少一個(gè)變體CDR(兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)變體CDR或甚至12個(gè)變體CDR)、一個(gè)變體輕鏈可變區(qū)、一個(gè)變體重鏈可變區(qū)、一個(gè)變體輕鏈和/或一個(gè)變體重鏈的那些。包括在本發(fā)明中的變體抗體或抗原結(jié)合片段是具有例如與原始抗體或抗原結(jié)合片段相比較相似的或改進(jìn)的結(jié)合親和力的那些。

如在此使用的術(shù)語(yǔ)“變體”適用于在此所述的任何序列，并且包括例如變體CDR(CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3)、變體輕鏈可變區(qū)、變體重鏈可變區(qū)、變體輕鏈、變體重鏈、變體抗體、變體抗原片段以及KAAG1變體。

被本發(fā)明包括的變體抗體或抗原結(jié)合片段是可以包含插入、缺失或氨基酸置換(保守性或非保守性)的那些。這些變體在其氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基可以被去除并且在其位置中插入一個(gè)不同的殘基。

本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可以具有如上所述的輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，并且可以進(jìn)一步包含恒定區(qū)的氨基酸，例如人抗體恒定區(qū)的氨基酸。

在一個(gè)示例性實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可以包含例如人IgG1恒定區(qū)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施例，抗原結(jié)合片段可以是例如scFv、Fab、Fab'或(Fab')₂。

用于置換誘變的感興趣位點(diǎn)包括高變區(qū)(CDR)，但是還考慮了在框架區(qū)中或甚至在恒定區(qū)中的修飾?？梢酝ㄟ^(guò)將來(lái)自以下列出的組(1至6組)中之一的(CDR、可變鏈、抗體等的)氨基酸用相同組的另一個(gè)氨基酸交換而產(chǎn)生保守性置換。

保守性置換的其他示例性實(shí)施例示于表格1A中“優(yōu)選的置換”標(biāo)題之下。如果這樣的置換導(dǎo)致所不希望的特性，則可以將在表1A中命名為“示例性置換”的、或如在下文進(jìn)一步參考氨基酸類別所述的更多實(shí)質(zhì)性改變引入，并且篩選產(chǎn)物。

本領(lǐng)域中已知的是變體可以通過(guò)置換誘變而產(chǎn)生，并且保留本發(fā)明的多肽的生物活性。這些變體在其氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基被去除并且在其位置中插入一個(gè)不同的殘基。例如，用于置換誘變的感興趣的一個(gè)位點(diǎn)可以包括這樣一個(gè)位點(diǎn)：在該位點(diǎn)中從不同物種獲得的特定殘基是相同的。被鑒定為“保守性置換”的置換的實(shí)例示于表1A中。如果這樣的置換導(dǎo)致所不希望的改變，則可以將在表1A中命名為“示例性置換”的、或如在下文進(jìn)一步參考氨基酸類別所述的其他類型的置換引入，并且篩選產(chǎn)物。

通過(guò)選擇置換而完成在功能或免疫身份方面的實(shí)質(zhì)性修飾，這些置換在它們對(duì)維持以下項(xiàng)的作用方面顯著不同：(a)在置換區(qū)域中的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如，如片層或螺旋構(gòu)象。(b)分子在靶位點(diǎn)處的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積?；诠餐膫?cè)鏈特性將天然存在的殘基分組：

(1組)疏水性的：正亮氨酸、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)

(2組)中性親水性的：半胱氨酸(Cys)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)

(3組)酸性的：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)

(4組)堿性的：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)

(5組)影響鏈取向的殘基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；以及

(6組)芳香族的：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)

非保守性置換將需要將這些類別之一的一個(gè)成員用另一個(gè)交換。

表1A.氨基酸置換

與原始抗體或抗原結(jié)合片段氨基酸序列相比，變體抗體或抗原結(jié)合片段可以在其氨基酸序列中具有實(shí)質(zhì)上的序列相似性和/或序列一致性。在兩種序列之間的相似性的程度是基于一致性(一致的氨基酸)和保守性置換的百分比。

通常，使用Blast 2序列程序(塔蒂阿娜A.達(dá)圖索瓦(Tatiana A.Tatusova),托馬斯L.馬登(Thomas L.Madden)(1999)，“Blast 2序列–一種新的用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列的工具”("Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences")，F(xiàn)EMS微生物學(xué)快報(bào)(FEMS Microbiol Lett.)174:247-250)在此已經(jīng)確定在可變鏈之間的相似性和一致性的程度，在該程序中使用默認(rèn)設(shè)置(即，blastp程序，BLOSUM62矩陣(開放空位11以及延伸空位罰分1；gapx減少50，期望(expect)10.0，字號(hào)3))以及活化的過(guò)濾器。

因此一致性百分比將指示與原始肽相比較一致的、并且可以占據(jù)相同或相似位置的氨基酸。

相似性百分比將指示與在相同或相似位置處的原始肽相比較一致的氨基酸以及被保守性氨基酸置換替換的那些氨基酸。

因此，本發(fā)明的變體包含可以具有與原始序列或原始序列的一部分至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性的那些變體。

變體的示例性實(shí)施例是具有與在此所述序列的至少81％的序列一致性并且具有與原始序列或原始序列的一部分81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些變體。

變體的其他示例性實(shí)施例是具有與在此所述序列的至少82％的序列一致性并且具有與原始序列或原始序列的一部分82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些變體。

變體的進(jìn)一步的示例性實(shí)施例是具有與在此所述序列的至少85％的序列一致性并且具有與原始序列或原始序列的一部分85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些變體。

變體的其他示例性實(shí)施例是具有與在此所述序列的至少90％的序列一致性并且具有與原始序列或原始序列的一部分90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些變體。

變體的另外的示例性實(shí)施例是具有與在此所述序列的至少95％的序列一致性并且具有與原始序列或原始序列的一部分95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些變體。

變體的又另外的示例性實(shí)施例是具有與在此所述序列的至少97％的序列一致性并且具有與原始序列或原始序列的一部分97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些變體。

出于簡(jiǎn)明的目的，申請(qǐng)人在此提供了表1B，表1B展示了被本發(fā)明包括的并且包含指定的序列一致性％和序列相似性％的單獨(dú)變體的示例性實(shí)施例。每個(gè)“X”應(yīng)理解為定義一種給定的變體。

本發(fā)明包括含有與在此所述的序列至少80％的一致性的CDR、輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈、重鏈、抗體和/或抗原結(jié)合片段。

本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段的示例性實(shí)施例是包含這樣一種輕鏈可變區(qū)的那些：該輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO.:4至少70％、75％、80％一致的序列。

這些輕鏈可變區(qū)可以包含與SEQ ID NO.:8至少80％一致的CDRL1序列、與SEQ ID NO.:9至少80％一致的CDRL2序列以及與SEQ ID NO.:10至少80％一致的CDRL3序列。

在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:8至少90％一致的CDRL1序列。

在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:8 100％一致的CDRL1序列。

在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:9至少90％一致的CDRL2序列。

在本發(fā)明的又另一個(gè)示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:9 100％一致的CDRL2序列。

在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:10至少90％一致的CDRL3序列。

在本發(fā)明的另外的示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:10 100％一致的CDRL3序列。

在一個(gè)示例性實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段可以包含這樣一種重鏈可變區(qū)：該重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO.:2至少70％、75％、80％一致的序列。

這些重鏈可變區(qū)可以包含與SEQ ID NO.:5至少80％一致的CDRH1序列、與SEQ ID NO.:6至少80％一致的CDRH2序列以及與SEQ ID NO.:7至少80％一致的CDRH3序列。

在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:5至少90％一致的CDRH1序列。

在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:5 100％一致的CDRH1序列。

在本發(fā)明的又另一個(gè)示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:6至少90％一致的CDRH2序列。

在本發(fā)明的一個(gè)另外的示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:6 100％一致的CDRH2序列。

在本發(fā)明的又另外的示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:7至少90％一致的CDRH3序列。

在本發(fā)明的另外的示例性實(shí)施例中，在此提供的任何抗體可以包含與SEQ ID NO.:7 100％一致的CDRH3序列。

在一些情況下，變體抗體重鏈可變區(qū)可以包含氨基酸缺失或添加(與或不與氨基酸置換組合)。常常可以容許1、2、3、4或5個(gè)氨基酸缺失或添加。

變體抗體或抗原結(jié)合片段的示例性實(shí)施例包括具有如在SEQ ID NO.：30中所列出的輕鏈可變區(qū)的那些：

SEQ ID NO.：30

DXVMTQTPLSLXVXXGXXASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXLLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXGVYYCFQGSHVPLTFGXGTXLEXK，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：4中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。氨基酸置換可以是例如在天然人抗體或人抗體共有序列的相應(yīng)位置處發(fā)現(xiàn)的氨基酸。氨基酸置換可以是例如保守性的。

變體抗體或抗原結(jié)合片段的另一個(gè)示例性實(shí)施例包括具有如在SEQ ID NO.：31中所列出的輕鏈可變區(qū)的那些：

SEQ ID NO.：31

DX_a1VMTQTPLSLX_a2VX_a3X_a4GX_a5X_a6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPX_a7LLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDX_a8GVYYCFQGSHVPLTFGX_a9GTX_a10LEX_a11K，

其中X_a1可以是疏水性氨基酸；

其中X_a2可以是A或P；

其中X_a3可以是中性親水性氨基酸；

其中X_a4可以是L或P；

其中X_a5可以是酸性氨基酸；

其中X_a6可以是Q或P；

其中X_a7可以是堿性氨基酸；

其中X_a8可以是疏水性氨基酸；

其中X_a9可以是A或Q；

其中X_a10可以是堿性氨基酸；或

其中X_a11可以是疏水性氨基酸，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：4中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。

變體抗體或抗原結(jié)合片段的另外的示例性實(shí)施例包括具有如在SEQ ID NO.：32中所列出的輕鏈可變區(qū)的那些：

SEQ ID NO.：32

DX_A1VMTQTPLSLX_AzVX_A3X_A4GX_A5X_A6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPX_A7LLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDX_A8GVYYCFQGSHVPLTFGX_A9GTX_A10LEX_A11K

其中X_A1可以是V或I

其中X_A2可以是A或P

其中X_A3可以是S或T

其中X_A4可以是L或P

其中X_A5可以是D或E

其中X_A6可以是Q或P

其中X_A7可以是K或Q

其中X_A8可以是L或V

其中X_A9可以是A或Q

其中X_A10可以是R或K或

其中X_A11可以是L或I，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：4中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。

根據(jù)實(shí)施例，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域變體可以具有如在SEQ ID NO.：33或34中所列出的序列：

SEQ ID NO.：33

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK。

SEQ ID NO.：34

DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK。

變體抗體或抗原結(jié)合片段的示例性實(shí)施例包括具有如在SEQ ID NO.：35中所列出的重鏈可變區(qū)的那些。

SEQ ID NO.：35

QXQLVQSGXEXXKPGASVKXSCKASGYTFTDDYMSWVXQXXGXXLEWXGDINPYNGDTNYNQKFKGXXXXTXDXSXSTAYMXLXSLXSEDXAVYYCARDPGAMDYWGQGTXVTVSS，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：2中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。氨基酸置換可以是例如在天然人抗體或人抗體共有序列的相應(yīng)位置處發(fā)現(xiàn)的氨基酸。氨基酸置換可以是例如保守性的。

變體抗體或抗原結(jié)合片段的另一個(gè)示例性實(shí)施例包括具有如在SEQ ID NO.：36中所列出的重鏈可變區(qū)的那些：

SEQ ID NO.：36

QX_b1QLVQSGX_b2EX_b3X_b4KPGASVKX_b5SCKASGYTFTDDYMSWVX_b6QX_b7X_b8GX_b9X_b10LEWX_b11GDINPYNGDTNYNQKFKGX_b12X_b13X_b14X_b15TX_b16DX_b17SX_b18STAYMX_b19LX_b20SLX_b21SEDX_b22AVYYCARDPGAMDYWGQGTX_b23VTVSS，

其中X_b1可以是疏水性氨基酸；

其中X_b2可以是P或A；

其中X_b3可以是疏水性氨基酸；

其中X_b4可以是V或K；

其中X_b5可以是疏水性氨基酸；

其中X_b6可以是堿性氨基酸；

其中X_b7可以是S或A；

其中X_b8可以是H或P；

其中X_b9可以是堿性氨基酸；

其中X_b10可以是S或G；

其中X_b11可以是疏水性氨基酸；

其中X_b12可以是堿性氨基酸；

其中X_b13可以是疏水性氨基酸；

其中X_b14可以是I或T；

其中X_b15可以是疏水性氨基酸；

其中X_b16可以是疏水性氨基酸；

其中X_b17可以是K或T；

其中X_b18可以是中性親水性氨基酸；

其中X_b19可以是Q或E；

其中X_b20可以是N或S；

其中X_b21可以是T或R；

其中X_b22可以是中性親水性氨基酸；或

其中X_b23可以是S或L，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：2中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。

變體抗體或抗原結(jié)合片段的另外的示例性實(shí)施例包括具有如在SEQ ID NO.：37中所列出的重鏈可變區(qū)的那些：

SEQ ID NO.：37

QX_B1QLVQSGX_B2EX_B3X_B4KPGASVKX_B5SCKASGYTFTDDYMSWVX_B6QX_B7X_B8GX_B9X_B10LEWX_B11GDINPYNGDTNYNQKFKGX_B12X_B13X_B14X_B15TX_B16DX_B17SX_B18STAYMX_B19LX_B20SLX_B21SEDX_B22AVYYCARDPGAMDYWGQGTX_B23VTVSS

其中X_B1可以是I或V；

其中X_B2可以是P或A；

其中X_B3可以是M或V；

其中X_B4可以是V或K；

其中X_B5可以是M或V；

其中X_B6可以是K或R；

其中X_B7可以是S或A；

其中X_B8可以是H或P；

其中X_B9可以是K或Q；

其中X_B10可以是S或G；

其中X_B11可以是I或M；

其中X_B12可以是K或R；

其中X_B13可以是A或V；

其中X_B14可以是I或T；

其中X_B15可以是L或I，

其中X_B16可以是V或A；

其中X_B17可以是K或T；

其中X_B18可以是S或T；

其中X_B19可以是Q或E；

其中X_B20可以是N或S；

其中X_B21可以是T或R；

其中X_B22可以是S或T；或

其中X_B23是S或L，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：2中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。

根據(jù)實(shí)施例，重鏈可變結(jié)構(gòu)域變體可以具有如在SEQ ID NO.38至41中任一個(gè)所列出的序列：

SEQ ID NO.：38

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS。

SEQ ID NO.：39

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS。

SEQ ID NO.：40

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS。

SEQ ID NO.：41

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS。

抗體在細(xì)胞中的產(chǎn)生

可以通過(guò)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的多種方法制造在此披露的抗-KAAG1抗體，例如，雜交瘤方法或通過(guò)重組DNA方法。

在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例中，可以通過(guò)常規(guī)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生抗-KAAG1抗體(例如，可以與一并披露的抗體競(jìng)爭(zhēng)的抗體)，其中將小鼠用抗原免疫，將脾細(xì)胞分離，并且將其與缺乏HGPRT表達(dá)的骨髓瘤細(xì)胞融合，并且通過(guò)含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT)的培養(yǎng)基來(lái)選擇雜交細(xì)胞。

在本發(fā)明的另外的示例性實(shí)施例中，可以通過(guò)重組DNA方法產(chǎn)生抗-KAAG1抗體。

為了表達(dá)抗-KAAG1抗體，可以將能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者或任何其他核苷酸序列插入表達(dá)載體(即，含有用于在特定宿主中的插入編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制的元件的載體)中。這些元件可以包含調(diào)節(jié)序列，例如增強(qiáng)子、組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、以及5′和3′非翻譯區(qū)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來(lái)構(gòu)建這樣的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、以及體內(nèi)基因重組。

可以利用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的多種表達(dá)載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)表達(dá)從能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈中的任何一者的核苷酸序列衍生的多肽或RNA。這些包括但不限于微生物，例如用重組噬菌體、質(zhì)粒、或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用桿狀病毒載體感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒或細(xì)菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。為了重組蛋白在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的長(zhǎng)期產(chǎn)生，在細(xì)胞系中穩(wěn)定的表達(dá)可能受到影響。例如，可以使用表達(dá)載體(該表達(dá)載體可以含有病毒復(fù)制起點(diǎn)和/或內(nèi)源性表達(dá)元件、以及在相同或分開的載體上的可選擇或可見的標(biāo)記基因)將能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到細(xì)胞系中。本發(fā)明并不限制于所采用的載體或宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，可以將能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者的核苷酸序列各自連接至分開的表達(dá)載體中，并且將每個(gè)鏈單獨(dú)地表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以將能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者的輕和重鏈兩者連接至單一表達(dá)載體中，并且將它們同時(shí)表達(dá)。

可替代地，可以分別使用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)或偶聯(lián)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)從一種載體表達(dá)RNA和/或多肽，該載體包含能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者的核苷酸序列。

一般而言，可以通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的多種程序來(lái)鑒定包含能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者的核苷酸序列的和/或表達(dá)由能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者的核苷酸序列所編碼的多肽或其一部分的宿主細(xì)胞。這些程序包括但不限于：DNA/DNA或DNA/RNA雜交、PCR擴(kuò)增、和蛋白質(zhì)生物測(cè)定或免疫測(cè)定技術(shù)(包括用于核酸或氨基酸序列的檢測(cè)和/或定量的基于膜、溶液、或芯片的技術(shù))。使用特異性多克隆或多克隆抗體用于行檢測(cè)和測(cè)量多肽的表達(dá)的免疫方法在本領(lǐng)域中是已知的。此類技術(shù)的實(shí)例包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、以及熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地使這些方法適應(yīng)于本發(fā)明。

因此，可以將包含能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者的核苷酸序列的宿主細(xì)胞在用于轉(zhuǎn)錄相應(yīng)RNA(mRNA，等等)和/或從細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。取決于所使用的序列和/或載體，由細(xì)胞產(chǎn)生的多肽可以分泌或可以保留在細(xì)胞內(nèi)。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，可以將包含能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者的核苷酸序列的表達(dá)載體設(shè)計(jì)為包含信號(hào)序列，這些信號(hào)序列指導(dǎo)多肽穿過(guò)原核或真核細(xì)胞膜的分泌。

由于遺傳碼的固有的簡(jiǎn)并性，可以產(chǎn)生并使用編碼相同的、基本上相同的或功能相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄械钠渌鸇NA序列，例如，以便表達(dá)由能夠編碼在此所述的輕和重免疫球蛋白鏈的任何一者的核苷酸序列所編碼的多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中通常已知的方法將本發(fā)明的核苷酸序列工程化，以便出于多種目的而改變核苷酸序列，這些目的包括但不限于基因產(chǎn)物的克隆、加工、和/或表達(dá)的修飾。可以使用通過(guò)隨機(jī)斷裂以及基因片段和合成寡核苷酸的再組裝PCR的DNA改組而將核苷酸序列工程化。例如，寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變可以用于引入創(chuàng)造新的限制酶切位點(diǎn)的突變、改變糖基化模式、改變密碼子偏愛性、產(chǎn)生剪接變體，等等。

另外，可以針對(duì)其調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以所希望的方式加工所表達(dá)的多肽的能力而選擇宿主細(xì)胞株。這樣的多肽修飾包括但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂化、以及酰化。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，包含特定糖基化結(jié)構(gòu)或模式的抗-KAAG1抗體可以是所希望的。切割多肽的“前體原”(“prepro”)形式的翻譯后加工還可以用于指定蛋白質(zhì)靶向、折疊、和/或活性。具有用于翻譯后活性的細(xì)胞機(jī)器和特征性機(jī)理的不同宿主細(xì)胞(例如，CHO、海拉細(xì)胞(Hela)、MDCK、HEK293、和W138)是可商購(gòu)的，并且來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并且可以被選擇為確保所表達(dá)多肽的正確修飾和加工。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將易于理解的是，可以將天然的、修飾的、或重組的核酸序列連接至異源序列，導(dǎo)致含有在以上提及的任何宿主系統(tǒng)中的異源多肽部分的融合多肽的翻譯。這樣的異源多肽部分可以通過(guò)使用可商購(gòu)的親和基質(zhì)而促進(jìn)融合多肽的純化。這樣的部分包括但不限于谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白、硫氧還蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、6-His(His)、FLAG、c-myc、血球凝集素(HA)、以及抗體表位(例如單克隆抗體表位)。

在又另外的方面，本發(fā)明涉及可以包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸。融合蛋白可以包含融合配偶體(例如，HA、Fc，等等)，該融合配偶體與在此所述的多肽(例如，完整輕鏈、完整重鏈、可變區(qū)、CDR，等等)融合。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將容易地認(rèn)識(shí)到，可以使用本領(lǐng)域中熟知的化學(xué)或酶學(xué)方法而全部或部分地合成核酸和多肽序列。例如，可以使用不同的固相技術(shù)進(jìn)行肽合成，并且可以將機(jī)器(例如ABI 431A肽合成儀(PE Biosystems))用于自動(dòng)合成。如果希望的話，可以在合成期間改變氨基酸序列和/或?qū)被嵝蛄信c來(lái)自其他蛋白質(zhì)的序列結(jié)合，從而產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)。

抗體結(jié)合物

本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可以與可檢測(cè)部分(即，用于檢測(cè)或診斷目的)結(jié)合或與治療部分(用于治療目的)結(jié)合。

“可檢測(cè)部分”是通過(guò)光譜的、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、化學(xué)的和/或其他物理學(xué)手段可檢測(cè)的部分?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中熟知的方法，將可檢測(cè)部分直接地和/或間接地(例如經(jīng)由一個(gè)連接，如但不限于DOTA或NHS連接)連接至本發(fā)明的抗體和其抗原結(jié)合片段?？梢允褂枚喾N多樣的可檢測(cè)部分，其中取決于所要求的靈敏度、結(jié)合的容易、穩(wěn)定性要求和可供使用的儀器而選擇。適合的可檢測(cè)部分包括但不限于：熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記(例如而不限于¹²⁵I、In¹¹¹、Tc⁹⁹、I¹³¹，并且包括用于PET掃描儀的正電子發(fā)射同位素等等)、核磁共振活性標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生色團(tuán)標(biāo)記、酶標(biāo)記(例如并且不限于辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酯酶，等等)、量子點(diǎn)和/或納米顆粒?？蓹z測(cè)部分可以引起和/或產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，由此允許來(lái)自可檢測(cè)部分的信號(hào)被檢測(cè)到。

在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段可以與治療部分(例如，藥物、細(xì)胞毒性部分、抗癌劑)連接(修飾)。

在一個(gè)示例性實(shí)施例中，抗-KAAG1抗體和抗原結(jié)合片段可以包含化療劑、細(xì)胞毒性劑或抗癌藥(例如，小分子)。這樣的化療劑或細(xì)胞毒性劑包括但不限于釔-90、鈧-47、錸-186、碘-131、碘-125、以及許多由本領(lǐng)域的技術(shù)人員公認(rèn)的其他藥劑(例如，镥(如Lu¹⁷⁷)、鉍(例如Bi²¹³)、銅(例如Cu⁶⁷))。在其他情況下，除了本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其他之外，化療劑、細(xì)胞毒性劑或抗癌藥還可以包括5-氟尿嘧啶、阿霉素、伊立替康、紫杉烷、假單胞桿菌內(nèi)毒素、蓖麻毒蛋白、奧莉絲汀(auristatin)(例如，單甲基奧莉絲汀E、單甲基奧莉絲汀F)、美登醇(例如，美登素)以及其他毒素。

可替代地，為了進(jìn)行本發(fā)明的方法，并且如在本領(lǐng)域中已知的，可以將本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段與一種第二分子(例如，第二抗體，等等)組合使用，該第二分子能夠特異性地結(jié)合至本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段上并且可以攜帶一個(gè)所希望的可檢測(cè)的、診斷性或治療性的部分。

抗體的藥物組合物和它們的用途

本發(fā)明還包括抗-KAAG1抗體或抗原結(jié)合片段(結(jié)合的或未結(jié)合的)的藥物組合物。該藥物組合物可以包含抗-KAAG1抗體或抗原結(jié)合片段，并且還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明的其他方面涉及一種組合物，該組合物可以包含在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段以及一種載體。

本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，該藥物組合物可以包含在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段以及一種藥學(xué)上可接受的載體。

除了活性成分之外，藥物組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的載體(這些載體包括水、PBS、鹽溶液、明膠、油、醇類、和其他賦形劑)以及促進(jìn)將活性化合物加工為藥學(xué)上可使用的制劑的助劑。在其他情況下，這樣的制劑可以是滅菌的。

如在此使用的“藥物組合物”表示治療有效量的藥劑連同藥學(xué)上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。如在此使用的“治療有效量”是指對(duì)于給定病癥和給藥方案而言提供治療效果的量。這樣的組合物是液體或凍干的或另外地是干燥的制劑，并且包含：具有不同的緩沖內(nèi)容物(例如，Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑，添加劑(例如白蛋白或明膠，以預(yù)防吸附至表面)，洗滌劑(例如，吐溫20、吐溫80、普朗尼克F68、膽汁酸鹽)。增溶劑(例如甘油、聚乙三醇)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸酯)、増量物質(zhì)或張度調(diào)節(jié)劑(例如乳糖、甘露醇)、聚合物(例如聚乙二醇)與蛋白質(zhì)的共價(jià)附接、與金屬離子的絡(luò)合、或材料的結(jié)合(該材料結(jié)合在聚合化合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸、水溶膠等的微粒制劑中或微粒制劑上或結(jié)合在脂質(zhì)體、微乳液、膠束、單層或多層囊泡、紅細(xì)胞血影、或原生質(zhì)球上)。這樣的組合物將影響物理狀態(tài)、溶解度、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率以及體內(nèi)清除速率?？刂漆尫呕虺掷m(xù)釋放組合物包括在親脂性儲(chǔ)庫(kù)(例如，脂肪酸、蠟、油)中的制劑。還被本發(fā)明包括的是用聚合物(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)包衣的微粒組合物。本發(fā)明的組合物的其他實(shí)施例結(jié)合微粒形式保護(hù)性包衣、蛋白酶抑制劑或滲透促進(jìn)劑，以用于不同的給藥途徑，包括經(jīng)腸胃外、肺、鼻、口、陰道、直腸的途徑。在一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物是經(jīng)腸胃外、癌旁、經(jīng)粘膜、透皮、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、和瘤內(nèi)給予的。

另外，如在此使用的“藥學(xué)上可接受的載體”或“藥用載體”在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括但不限于0.01M-0.1M或0.05M磷酸鹽緩沖液或0.8％鹽水。另外，這樣的藥學(xué)上可接受的載體可以是水性的或非水性的溶液、懸浮液、和乳液。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)、以及注射用有機(jī)酯(例如油酸乙酯)。水性載體包括水、醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化林格氏液或固定油。靜脈內(nèi)媒介物包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑，例如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如，如抗微生物劑、抗氧化劑、整理劑(collating agent)、惰性氣體，等等。

對(duì)于任何化合物，可以初步在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定或動(dòng)物模型(例如小鼠、大鼠、兔、狗、或豬)中估算治療有效劑量。還可以使用動(dòng)物模型來(lái)確定濃度范圍和給藥途徑。這種信息可以進(jìn)而用來(lái)確定對(duì)于在人類中給藥有用的劑量和途徑。這些技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的，并且治療有效劑量是指改善癥狀或病癥的活性成分的量?？梢酝ㄟ^(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物中或用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序確定治療效力和毒性，例如通過(guò)計(jì)算和比較ED₅₀(在50％的群體中治療有效的劑量)和LD₅₀(對(duì)50％的群體致死的劑量)統(tǒng)計(jì)量?？梢詫⒁陨纤龅娜魏沃委熃M合物應(yīng)用至對(duì)這種治療有需要的任何受試者，包括但不限于哺乳動(dòng)物，例如狗、貓、牛、馬、兔、猴子、和人。

可以通過(guò)任何數(shù)目的途徑給予在此發(fā)明中利用的藥物組合物，包括但不局限于：口服、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、或直腸的方式。

用于本披露的目的的術(shù)語(yǔ)“治療”是指治療性治療和預(yù)防性或防止性措施，其中目的是減慢(減輕)目標(biāo)病理性病癥或失調(diào)。對(duì)治療有需要的那些包括已經(jīng)患有失調(diào)的那些連同易于患有失調(diào)的那些或者其中失調(diào)有待預(yù)防的那些。具體而言，有需要的受試者包括具有升高水平的一種或多種癌癥標(biāo)記的受試者。

抗-KAAG1抗體和其抗原結(jié)合片段可以在不同癌癥類型的治療中具有治療用途，例如卵巢癌、腎癌、結(jié)腸癌、肺癌、黑色素瘤，等等。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，抗體和片段在卵巢癌中具有治療用途。在一個(gè)更具體的實(shí)施例中，受試者可以具有例如復(fù)發(fā)的卵巢癌。在又另一個(gè)實(shí)施例中，受試者可以具有例如轉(zhuǎn)移癌。

在某些例子中，抗-KAAG1抗體和片段可以阻斷KAAG1與其蛋白質(zhì)伴侶的相互作用。本發(fā)明的抗-KAAG1抗體可以特別地用來(lái)將治療部分遞送至表達(dá)KAAG1的細(xì)胞。

抗-KAAG1抗體和其抗原結(jié)合片段可以在不同類型的卵巢癌的治療中具有治療用途。若干不同的細(xì)胞類型可以產(chǎn)生不同的卵巢癌組織型。卵巢癌的最常見形式包括源于卵巢或輸卵管的上皮細(xì)胞層的腫瘤。此類上皮性卵巢癌包括漿液性腫瘤、卵巢子宮內(nèi)膜樣瘤(endometroid tumor)、粘液性腫瘤、透明細(xì)胞瘤、以及交界性腫瘤。在其他實(shí)施例中，抗-KAAG1抗體和其抗原結(jié)合片段具有在其他類型的卵巢癌的治療中的用途，例如種系和性索卵巢癌。

在某些情況下，可以同步地聯(lián)合針對(duì)相同病癥給予的其他治療而給予抗-KAAG1抗體和其抗原結(jié)合片段。像這樣，可以將抗體與抗有絲分裂物質(zhì)(例如，紫杉烷)、基于鉑的藥劑(例如，順鉑)、DNA損傷劑(例如阿霉素)以及其他對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的抗癌療法一起給予。在其他情況下，可以將抗-KAAG1抗體和其抗原結(jié)合片段與其他治療性抗體一起給予。這些包括但不限于靶向EGFR、CD-20、和Her2的抗體。

本發(fā)明在其另外的方面中涉及一種用于抑制表達(dá)KAAG1細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，該方法可以包括使這種細(xì)胞與有效量的在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段接觸。

本發(fā)明還包括在哺乳動(dòng)物中治療癌癥或抑制表達(dá)KAAG1的細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，該方法可以包括將例如與在此所述的治療部分結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段給予至有需要的受試者。

在另外的方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段的治療方法、診斷方法、和檢測(cè)方法，以及這些抗體或抗原結(jié)合片段在用于這種目的的藥物組合物或藥物的制造中的用途。

因此，本發(fā)明涉及在此所述的分離的抗體或抗原結(jié)合片段在癌癥的治療中(在用于癌癥的治療的藥物組合物的制造中)的用途。

抗體或抗原結(jié)合片段可以更特別地可應(yīng)用于惡性腫瘤，包括例如具有轉(zhuǎn)移能力的惡性腫瘤和/或由錨定非依賴性生長(zhǎng)所表征的腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段還可以用于癌癥的診斷中?？梢酝ㄟ^(guò)將本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段給予至患有或疑似患有癌癥的哺乳動(dòng)物而體內(nèi)進(jìn)行癌癥的診斷。還可以通過(guò)使從哺乳動(dòng)物獲得的樣品與抗體或抗原結(jié)合片段接觸、并且確定表達(dá)KAAG1或KAAG1變體的細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)的存在或不存在而離體進(jìn)行診斷。

因此，本發(fā)明還包括在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)癌癥或檢測(cè)表達(dá)KAAG1的細(xì)胞的方法，該方法可以包括將在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段給予至有需要的受試者。

本發(fā)明在其另一方面涉及用于檢測(cè)表達(dá)KAAG1或KAAG1變體的細(xì)胞的方法，該方法可以包括使這種細(xì)胞與在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段接觸，并且檢測(cè)由抗體和表達(dá)KAAG1或KAAG1變體的細(xì)胞形成的復(fù)合物。在檢測(cè)方法中使用的抗體或抗原結(jié)合片段的示例性實(shí)施例是能夠結(jié)合至KAAG1的細(xì)胞外區(qū)的那些。

在檢測(cè)方法中使用的抗體或抗原結(jié)合片段的其他示例性實(shí)施例是結(jié)合至在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的KAAG1或KAAG1變體的那些。

將會(huì)從在此所述的治療、檢測(cè)或診斷方法受益的有需要的受試者是那些患有或疑似患有癌癥(例如，卵巢癌(例如，漿液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞或粘液性的)、皮膚癌(例如，黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌)、腎癌(例如，乳頭狀細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌)、結(jié)腸直腸癌癥(例如，結(jié)腸直腸癌)、肉瘤、白血病、腦腫瘤、甲狀腺瘤、乳癌(例如，乳腺癌)、前列腺癌癥(例如，前列腺癌)、食管腫瘤、膀胱腫瘤、肺腫瘤(例如，肺癌)或頭頸部腫瘤，并且尤其是當(dāng)癌癥表征為惡性時(shí)和/或當(dāng)表達(dá)KAAG1或KAAG1變體的細(xì)胞表征為錨定非依賴性生長(zhǎng)時(shí))的受試者。

可以通過(guò)成像、組織活檢、基因檢測(cè)來(lái)鑒定患有癌癥的受試者?？商娲兀梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)測(cè)定(例如，ELISA等等)通過(guò)在他們體液中的癌癥標(biāo)記的存在而鑒定患有癌癥的患者。

特別地被本發(fā)明包括的是患有或傾向于患有卵巢癌(例如，漿液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞或粘液性的)、皮膚癌(例如黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌)或腎癌(例如，乳頭狀細(xì)胞癌)并且尤其是當(dāng)癌癥表征為是惡性的和/或當(dāng)表達(dá)KAAG1或KAAG1變體的細(xì)胞表征為錨定非依賴性生長(zhǎng)時(shí)的患者。

本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測(cè)KAAG1(SEQ ID NO.:29)、具有與SEQ ID NO.:29至少80％序列一致性的KAAG1變體、或者KAAG1或KAAG1變體的循環(huán)形式的分泌形式的方法，該方法可以包括使表達(dá)KAAG1或KAAG1變體的細(xì)胞或包含或疑似包含KAAG1或KAAG1變體的樣品(活檢、血清、血漿、尿液，等等)與在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段接觸，并且對(duì)結(jié)合進(jìn)行測(cè)量。樣品可以源于可能患有癌癥(例如，卵巢癌、轉(zhuǎn)移癌)或可能疑似患有癌癥(例如，卵巢癌、轉(zhuǎn)移癌)的哺乳動(dòng)物(例如，人類)。樣品可以是從哺乳動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)上清獲得的組織樣品。

根據(jù)本發(fā)明，樣品可以是從哺乳動(dòng)物獲得的血清樣品、血漿樣品、血液樣品、精液或腹水液。在此所述的抗體或抗原結(jié)合片段可以有利地檢測(cè)KAAG1的分泌或循環(huán)形式(在血液中循環(huán))。

該方法可以包括將結(jié)合至KAAG1或KAAG1變體的抗體或抗原結(jié)合片段所形成的復(fù)合物進(jìn)行定量。

抗體結(jié)合至抗原將引起預(yù)期的抗原的分子量的增加。因此，在抗體或抗原結(jié)合片段與抗原結(jié)合后發(fā)生物理變化。

可以使用例如電泳，隨后為蛋白質(zhì)印跡以及凝膠或印跡的著色，連接計(jì)算機(jī)的質(zhì)譜、HPLC，F(xiàn)ACS或其他方式來(lái)檢測(cè)這樣的變化。能夠計(jì)算分子量的移位的裝置在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括例如Phosphorimager^TM。

當(dāng)抗體包括例如可檢測(cè)標(biāo)記時(shí)，可以通過(guò)由標(biāo)記發(fā)射的熒光、標(biāo)記的輻射發(fā)射、與其底物一起提供的標(biāo)記的酶活性或其他方式而檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物。

可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的不同方法進(jìn)行在抗體或抗原結(jié)合片段與抗原之間的結(jié)合的檢測(cè)和/或測(cè)量?？梢杂媚軌驒z測(cè)由可檢測(cè)標(biāo)記(輻射發(fā)射、熒光、顏色變化等等)發(fā)射的信號(hào)的裝置來(lái)監(jiān)測(cè)在抗體或抗原結(jié)合片段與抗原之間的結(jié)合。這種裝置提供了指示如所發(fā)生的結(jié)合的數(shù)據(jù)，并且還提供了關(guān)于結(jié)合至抗原的抗體的量的指示。裝置(通常與計(jì)算機(jī)連接)可能還能夠計(jì)算在背景信號(hào)(例如，在不存在抗原-抗體結(jié)合的情況下獲得的信號(hào))或背景噪聲與在特異性的抗體-抗原結(jié)合后獲得的信號(hào)之間的差。因此這樣的裝置可以給用戶提供關(guān)于抗原是否已經(jīng)被檢測(cè)的指示和結(jié)論。

本發(fā)明的另外的方面涉及試劑盒，這些試劑盒可以包含一個(gè)或多個(gè)容器，這些容器包含在此所述的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段。

核酸、載體和細(xì)胞

抗體通常是在允許表達(dá)輕鏈和重鏈的細(xì)胞中產(chǎn)生的，該輕鏈和重鏈?zhǔn)菑囊环N或多種載體表達(dá)的，該一種或多種載體包含編碼輕鏈和/或重鏈的核酸序列。

因此本發(fā)明包括能夠編碼在此所述的CDR、輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈、重鏈中任何一個(gè)的核酸。

因此本發(fā)明在另外的方面涉及編碼能夠特異性地結(jié)合至KAAG1的抗體的輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的核酸。

本發(fā)明的核酸的示例性實(shí)施例包括編碼輕鏈可變區(qū)的核酸，該輕鏈可變區(qū)包含：

a.一個(gè)CDRL1，該CDRL1如在SEQID NO.:8中所列出的或包含SEQ ID NO.:8；

b.一個(gè)CDRL2，該CDRL2如在SEQID NO.:9中所列出的或包含SEQ ID NO.:9，或；

c.一個(gè)CDRL3序列，該CDRL3序列如在SEQID NO.:10中所列出的或包含SEQ ID NO.:10。

根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼可以包含CDRL1、CDRL2或CDRL3中的至少兩個(gè)CDR的輕鏈可變區(qū)。

同樣，根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼可以包含一個(gè)CDRL1、一個(gè)CDRL2和一個(gè)CDRL3的輕鏈可變區(qū)。

本發(fā)明還涉及編碼重鏈可變區(qū)的核酸，該重鏈可變區(qū)包含：

a.一個(gè)CDRH1序列，該CDRH1如在SEQ ID NO.:5中所列出的或包含SEQ ID NO.:5；

b.一個(gè)CDRH2序列，該CDRH2序列如在SEQID NO.:6中所列出的或包含SEQ ID NO.:6，或；

c.一個(gè)CDRH3序列，該CDRH3序列如在SEQID NO.:7中所列出的或包含SEQ ID NO.:7。

根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼可以包含CDRH1、CDRH2或CDRH3中的至少兩個(gè)CDR的重鏈可變區(qū)。

根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼可以包含一個(gè)CDRH1、一個(gè)CDRH2和一個(gè)CDRH3的重鏈可變區(qū)。

還被本發(fā)明包括的是編碼具有至少一個(gè)保守性氨基酸置換的抗體變體的核酸。

根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼包含至少一個(gè)保守性氨基酸置換的CDR。

根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼包含在這些CDR的至少兩個(gè)中的至少一個(gè)保守性氨基酸置換的CDR。

根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼包含在3個(gè)CDR中的至少一個(gè)保守性氨基酸置換的CDR。

根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼包含在至少一個(gè)CDR中的至少兩個(gè)保守性氨基酸置換的CDR。

根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼包含在這些CDR的至少兩個(gè)中的至少兩個(gè)保守性氨基酸置換的CDR。

根據(jù)本發(fā)明，該核酸可以編碼包含在3個(gè)CDR中的至少兩個(gè)保守性氨基酸置換的CDR。

本發(fā)明的其他方面涉及編碼具有與SEQ ID NO.:4至少70％、75％、80％的序列一致性的輕鏈可變區(qū)的核酸。

本發(fā)明的又其他方面涉及編碼具有與SEQ ID NO.:2至少70％、75％、80％的序列一致性的重鏈可變區(qū)的核酸。

在又另一方面，本發(fā)明涉及包含在此所述的核酸的載體。

根據(jù)本發(fā)明，該載體可以是表達(dá)載體。

包含用于在特定宿主中的插入編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制的元件的載體在本領(lǐng)域中是已知的。這些元件可以包含調(diào)節(jié)序列，例如增強(qiáng)子、組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、以及5'和3'非翻譯區(qū)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來(lái)構(gòu)建這樣的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、以及體內(nèi)基因重組。

在另一方面，本發(fā)明涉及分離的細(xì)胞，這種分離的細(xì)胞可以包含在此所述的核酸、抗體或抗原結(jié)合片段。

這種分離的細(xì)胞可以包含在分開的載體上或在相同的載體上的、編碼輕鏈可變區(qū)的核酸以及編碼重鏈可變區(qū)的核酸。這種分離的細(xì)胞還可以包含在分離的載體上或在相同的載體上的、編碼輕鏈的核酸以及編碼重鏈的核酸。

根據(jù)本發(fā)明，這種細(xì)胞可以能夠表達(dá)、組裝和/或分泌一種抗體或其抗原結(jié)合片段。

在另一方面，本發(fā)明提供了可以包含和/或可以表達(dá)在此所述的抗體的細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明，這種細(xì)胞可以包含編碼一個(gè)輕鏈可變區(qū)的一種核酸、以及編碼一個(gè)重鏈可變區(qū)的一種核酸。

這種細(xì)胞可以能夠表達(dá)、組裝和/或分泌一種抗體或其抗原結(jié)合片段。

呈現(xiàn)了以下實(shí)例以進(jìn)一步概述本發(fā)明的細(xì)節(jié)。

實(shí)例

實(shí)例1

這個(gè)實(shí)例描述了抗體3A4結(jié)合至KAAG1。

結(jié)合KAAG1的抗體是使用Alere噬菌體展示技術(shù)而產(chǎn)生的。用于產(chǎn)生這些抗體的技術(shù)和方法的詳細(xì)說(shuō)明可以在美國(guó)專利號(hào)6,057,098中找到。另外，產(chǎn)生針對(duì)KAAG1的抗體的詳細(xì)說(shuō)明可以在PCT/CA 2009/001586中找到。簡(jiǎn)言之，該技術(shù)利用了展示抗原結(jié)合片段(Fab)的噬菌體文庫(kù)的嚴(yán)格篩選(stringent panning)。在幾輪的篩選之后，獲得稱為Omniclonal的文庫(kù)，將該文庫(kù)針對(duì)重組Fab進(jìn)行富集，該Fab含有輕鏈和重鏈可變區(qū)，這些輕鏈和重鏈可變區(qū)以非常高的親和力和特異性結(jié)合至KAAG1。根據(jù)這個(gè)文庫(kù)(更精確地指定為Omniclonal AL0003A2ZB)，從大腸桿菌制備96個(gè)單獨(dú)的重組單克隆Fab，并且測(cè)試KAAG1結(jié)合。單克隆指定的3A4基于它對(duì)重組KAAG1的高結(jié)合活性以及它對(duì)卵巢癌細(xì)胞表面上的KAAG1的親和力而衍生自單克隆抗體的這個(gè)96孔板。

重鏈和輕鏈免疫球蛋白鏈的可變區(qū)的核苷酸序列分別顯示在SEQ ID NO.:1和3中，而重鏈和輕鏈免疫球蛋白鏈的可變區(qū)的多肽序列分別顯示在SEQ ID NO.:2和4中。3A4重鏈免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)分別顯示在SEQ ID NO.:5、6和7中，而3A4輕鏈免疫球蛋白的CDR分別顯示在SEQ ID NO.:8、9和10中。

除了進(jìn)行Fab單克隆與KAAG1蛋白之間的相互作用研究的可能性以外，F(xiàn)ab的用途在關(guān)于有意義的體外和體內(nèi)研究以確認(rèn)抗原的生物功能的方面受限制。因此，有必要的是將包含在3A4Fab中的輕鏈和重鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移至全抗體支架，從而產(chǎn)生小鼠-人嵌合IgG1。構(gòu)建用于輕和重免疫球蛋白鏈兩者的表達(dá)載體，使得i)Fab表達(dá)載體的原始細(xì)菌信號(hào)肽序列上游替換為哺乳動(dòng)物信號(hào)肽，并且ii)在小鼠抗體中的輕鏈和重鏈恒定區(qū)替換為人恒定區(qū)。完成這個(gè)轉(zhuǎn)移的方法利用了本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。在此描述了該方法的簡(jiǎn)要概述。

輕鏈表達(dá)載體-將目前的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒(稱為pTTVH8G(Durocher等人，2002)，被設(shè)計(jì)為在293E瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中使用)進(jìn)行修飾以適應(yīng)小鼠輕鏈可變區(qū)。所得的小鼠-人嵌合輕鏈包含小鼠可變區(qū)、之后為人κ恒定結(jié)構(gòu)域。通過(guò)用引物OGS1773和OGS1774(分別為SEQ ID NO:11和12)的PCR來(lái)擴(kuò)增編碼人κ恒定結(jié)構(gòu)域的cDNA序列。人κ恒定區(qū)的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO:13和14中。將所得321個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物連接到pTTVH8G中，使其剛好在人VEGF A(NM_003376)的信號(hào)肽序列的下游。這個(gè)克隆步驟還定位了獨(dú)特的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，這些限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)容許編碼小鼠輕鏈可變區(qū)的cDNA的精確定位。最終的表達(dá)質(zhì)粒(稱為pTTVK1)的序列，顯示在SEQ ID NO.:15中。基于在SEQ ID NO.:3中顯示的3A4輕鏈可變序列，將對(duì)于輕鏈可變區(qū)具有特異性的PCR引物設(shè)計(jì)為在其5’-端摻入與VEGF A信號(hào)肽的最后20個(gè)堿基對(duì)一致的序列。這個(gè)引物的序列顯示在SEQ ID NO:16中。反向引物(SEQ ID NO.:17)在其3’-端摻入與人κ恒定結(jié)構(gòu)域的前面的20個(gè)堿基對(duì)一致的序列。將PCR片段和消化的pTTVK1兩者用T4DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性處理，產(chǎn)生經(jīng)由退火連接的互補(bǔ)末端。將退火反應(yīng)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌中，并且通過(guò)測(cè)序來(lái)驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒以確保小鼠輕鏈可變區(qū)被適當(dāng)?shù)夭迦雙TTVK1表達(dá)載體中。

重鏈表達(dá)載體-按照與以上所述的用于產(chǎn)生輕鏈免疫球蛋白的pTTVK1相似的方式設(shè)計(jì)產(chǎn)生3A4重鏈免疫球蛋白的表達(dá)載體。通過(guò)連接編碼人恒定CH1區(qū)的cDNA序列將包含人IgGK信號(hào)肽序列連同IgG1的人Fc結(jié)構(gòu)域的CH2和CH3區(qū)的質(zhì)粒pYD11(迪羅謝(Durocher)等人，2002)進(jìn)行修飾。將被設(shè)計(jì)為包含獨(dú)特的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的PCR引物OGS1769和OGS1770(SEQ ID NO:18和19)用于擴(kuò)增人IgG1CH1區(qū)，該人IgG1CH1區(qū)包含在SEQ ID NO:20和21中顯示的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在將人CH1的309個(gè)堿基對(duì)片段剛好連接在IgGK信號(hào)肽序列的下游之后，修飾的質(zhì)粒(SEQ ID NO.:22)指定為pYD15。當(dāng)將選擇的重鏈可變區(qū)連接到這個(gè)載體時(shí)，所得的質(zhì)粒編碼具有人恒定區(qū)的全I(xiàn)gG1重鏈免疫球蛋白。將對(duì)于抗體3A4的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO:1)具有特異性的PCR引物設(shè)計(jì)為在其5’-端摻入一個(gè)與IgGK信號(hào)肽的最后20個(gè)堿基對(duì)一致的序列。這個(gè)引物的序列顯示在SEQ ID NO:23中。反向引物(SEQ ID NO.:24)在其3’-端摻入與人CH1恒定結(jié)構(gòu)域的前面的20個(gè)堿基對(duì)一致的序列。將PCR片段和消化的pYD15兩者用T4DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性處理，產(chǎn)生經(jīng)由退火連接的互補(bǔ)末端。將退火反應(yīng)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌中，并且通過(guò)測(cè)序來(lái)驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒以確保小鼠重鏈可變區(qū)被適當(dāng)?shù)夭迦雙YD15表達(dá)載體中。

人3A4嵌合IgG1在293E細(xì)胞中的表達(dá)–使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(迪羅謝(Durocher)等人，2002)將以上制備的編碼輕鏈和重鏈免疫球蛋白的表達(dá)載體在293E細(xì)胞中表達(dá)。將輕鏈與重鏈的比率進(jìn)行優(yōu)化以便實(shí)現(xiàn)在組織培養(yǎng)基中抗體的最大產(chǎn)率，并且發(fā)現(xiàn)它是9:1(L:H)。

嵌合3A4結(jié)合至KAAG1-為了測(cè)量3A4單克隆抗體的相對(duì)結(jié)合，使用大規(guī)模的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)(迪羅謝(Durocher)等人，2002；迪羅謝(Durocher)，2004)使重組人KAAG1在293E細(xì)胞中產(chǎn)生。作為Fc融合蛋白的人重組KAAG1的表達(dá)和純化發(fā)現(xiàn)于PCT/CA2009/001586中。為了進(jìn)行Fc-KAAG1與抗體制劑的結(jié)合，將Fc-KAAG1用NHS-生物素(Pierce公司，羅克福德(Rockford)，伊利諾伊州(IL))進(jìn)行生物素?；?，并且將10ng/孔在室溫下包被在鏈霉親和素96孔板中持續(xù)1小時(shí)。將純化的嵌合3A4以漸增的濃度添加，并且在室溫下孵育30分鐘。在TMB液體底物(加拿大西格瑪-奧德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Canada Ltd.)，奧克維爾(Oakville)，安大略省(ON))的存在下，將結(jié)合的抗體用HRP結(jié)合的人抗-κ輕鏈抗體進(jìn)行檢測(cè)，并且在酶標(biāo)儀(microtiter plate reader)中在450nm下進(jìn)行讀取。如在圖1中所示，3A4與固定的KAAG1蛋白是以劑量依賴性方式進(jìn)行相互作用。當(dāng)將無(wú)關(guān)IgG對(duì)照與重組KAAG1一起孵育時(shí)，甚至在非常最高的濃度下，沒(méi)有觀察到結(jié)合活性。這個(gè)結(jié)果證明3A4結(jié)合至人KAAG1上。將3A4的結(jié)合與具有不同表位特異性的嵌合3D3的結(jié)合進(jìn)行比較(描述于特倫布萊(Tremblay)和菲利翁(Filion)(2009)中)(參見實(shí)例2)。在這個(gè)類型的測(cè)定中，3A4的結(jié)合活性非常類似于3D3(參見圖1)。

實(shí)例2

這個(gè)實(shí)例描述了表位作圖研究，以便確定3A4抗體結(jié)合至KAAG1的哪個(gè)區(qū)。

為了進(jìn)一步描繪被3A4抗體結(jié)合的KAAG1的區(qū)域，使KAAG1的截短突變體表達(dá)并且將其用于ELISA中。關(guān)于全長(zhǎng)KAAG1，將截短形式通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并且將其連接進(jìn)BamHI/HindIII消化的pYD5中。所使用的引物組合了具有在SEQ ID NO.:25中顯示的序列的正向寡核苷酸與SEQ ID NO:26和27的引物，從而產(chǎn)生分別在KAAG1的氨基酸數(shù)60和35處結(jié)束的Fc融合的片段。如以上針對(duì)全長(zhǎng)Fc-KAAG1所述的，進(jìn)行這些重組突變體的表達(dá)，并且用蛋白-A進(jìn)行純化。

基于特倫布萊(Tremblay)和菲利翁(Filion)(2009)的傳授，已知的是其他抗體與重組KAAG1的特異性區(qū)域相互作用。因此，抗-KAAG1抗體3C4、3D3、和3G10分別與KAAG1的1-35、36-60、和61-84區(qū)相互作用。這些結(jié)合結(jié)果復(fù)現(xiàn)并示于圖2中。為了確定由3A4抗體結(jié)合的KAAG1中的區(qū)域，根據(jù)在實(shí)例1中所述的相似方案，使用KAAG1截短的Fc融合體進(jìn)行ELISA。僅有的改變是使用了不同的生物素酰化的Fc-KAAG1截短突變體。結(jié)果顯示3A4的結(jié)合特異性與3G10相似。在不具有超過(guò)氨基酸60的氨基酸序列的KAAG1突變體中，3A4與KAAG1不發(fā)生結(jié)合。這指示3A4與由人KAAG1的氨基酸61-84所描繪的區(qū)域相互作用。3A4和3D3具有如由ELISA所測(cè)量的幾乎相同的結(jié)合活性(實(shí)例1)但具有非常不同的表位特異性的觀察表明3A4的結(jié)合特性與3D3是相當(dāng)不同的。

實(shí)例3

這個(gè)實(shí)例描述了3A4結(jié)合至在癌細(xì)胞系的表面上的KAAG1的能力。

使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)在細(xì)胞系表面上的KAAG1?；谑褂肒AAG1mRNA特異性引物的RT-PCR表達(dá)分析，預(yù)期所選擇的的癌細(xì)胞系表達(dá)KAAG1蛋白。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，卵巢癌細(xì)胞(SKOV-3和TOV-21G)和顯示非常少的KAAG1表達(dá)的對(duì)照細(xì)胞系(293E)。使用5mM EDTA將細(xì)胞收獲，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且以2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重懸浮于FCM緩沖液(1×PBS中的0.5％BSA、10μg/ml山羊血清)中。將嵌合3A4或?qū)φ誌gG以5μg/ml的終濃度添加至100μl的細(xì)胞，并且在冰上孵育2小時(shí)。將細(xì)胞在冷PBS中進(jìn)行洗滌以去除未結(jié)合的抗體，將其重懸浮于包含與FITC結(jié)合的抗-人IgG(作為第二抗體)(以1:200稀釋)的100μl FCM緩沖液中，并且在冰上孵育持續(xù)45分鐘。在冷PBS中的另一個(gè)洗滌步驟之后，將細(xì)胞重懸浮于250μl FCM緩沖液中，并且用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。來(lái)自這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖3A和3B中。細(xì)胞系與對(duì)照抗體的孵育導(dǎo)致相應(yīng)于典型地在抗體從細(xì)胞略去時(shí)獲得的信號(hào)的頻率曲線(histogram)。這確立了這些FCM值的背景信號(hào)(圖3A和3B)。相比之下，SKOV-3、TOV-21G與3A4嵌合抗體的孵育導(dǎo)致強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖3A)。這指示抗體有效地檢測(cè)在這些癌細(xì)胞表面上的KAAG1。293E細(xì)胞，即人腎細(xì)胞系，預(yù)期顯示非常少的KAAG1表達(dá)，并且事實(shí)上，F(xiàn)CM頻率曲線顯示與對(duì)照抗體相比較幾乎沒(méi)有偏移(參見圖3B)。因此，3A4特異性地檢測(cè)在癌細(xì)胞表面上的KAAG1。將3A4的活性與3D3(在特倫布萊(Tremblay)和菲利翁(Filion)(2009)的傳授內(nèi)容中所描述的一種抗-KAAG1抗體)進(jìn)行比較。基于此專利申請(qǐng)，已知的是，如通過(guò)FCM所測(cè)量的，3D3可以檢測(cè)在癌細(xì)胞表面上的KAAG1。這在將3D3在SKOV-3和TOV-21G細(xì)胞的存在下孵育時(shí)被證實(shí)(參見圖3A)。該熒光信號(hào)與3A4相比較不是那么高，指示3A4具有檢測(cè)在卵巢癌細(xì)胞表面上的KAAG1的不同的并且增強(qiáng)的能力。在我們實(shí)驗(yàn)室獲得的其他結(jié)果表明，在3D3未在這個(gè)測(cè)定中展現(xiàn)活性(結(jié)果未顯示)的條件下，3A4可以檢測(cè)在癌細(xì)胞表面上的KAAG1。綜上所述，在與3D3比較時(shí)3A4在表位特異性方面的這些觀察和差異表明這些抗體具有不同的抗-KAAG1特性。

實(shí)例4

用于使用3A4抗-KAAG1抗體作為抗體結(jié)合物的方法

如上所證明，使用流式細(xì)胞術(shù)在癌細(xì)胞表面上通過(guò)3A4檢測(cè)KAAG1抗原。有一些不同的分子事件，這些事件可以在抗體結(jié)合至其在細(xì)胞表面上的靶標(biāo)后發(fā)生。這些包括i)阻滯對(duì)另一個(gè)細(xì)胞表面抗原/受體或配體的可及性，ii)形成相對(duì)穩(wěn)定的抗體-抗原復(fù)合物，從而允許細(xì)胞經(jīng)由ADCC或CDC而被靶向，iii)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件可以如由激動(dòng)性抗體所例示而發(fā)生，iv)該復(fù)合物可以被內(nèi)化，或v)該復(fù)合物可以從細(xì)胞表面脫落。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們希望檢查3A4抗體-KAAG1復(fù)合物在細(xì)胞表面上的行為。將SKOV-3細(xì)胞鋪板、洗滌、并且與5μg/ml的如在實(shí)例3中所述的嵌合3A4抗體一起孵育。在洗滌之后，添加OSE完全培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞置于37℃，持續(xù)高達(dá)90分鐘。將細(xì)胞在指示的時(shí)間處移出(參見圖4)，快速冷卻，進(jìn)行制備以用于使用FITC-結(jié)合的抗-人IgG的細(xì)胞計(jì)量術(shù)，并且結(jié)果表達(dá)為剩余的平均熒光強(qiáng)度的百分比(平均熒光強(qiáng)度，％)。如在圖4中所展示，熒光信號(hào)在30-45分鐘的時(shí)期內(nèi)快速降低。這個(gè)結(jié)果指示3A4/KAAG1復(fù)合物從細(xì)胞消失，這指示復(fù)合物的內(nèi)化可能發(fā)生。解釋造成在細(xì)胞表面熒光中這個(gè)降低的機(jī)理的初級(jí)研究已經(jīng)揭示該復(fù)合物似乎被內(nèi)化。

通過(guò)在活細(xì)胞上進(jìn)行免疫熒光法以判斷這種內(nèi)化是否可以用顯微鏡觀察而進(jìn)一步證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)。將SKOV-3細(xì)胞接種在全培養(yǎng)基(OSE培養(yǎng)基(Wisent)，含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、1×非必需氨基酸、以及抗生素)中的蓋玻片上。一旦細(xì)胞適當(dāng)?shù)馗街?，添加新鮮的包含10ug/ml的3A4抗-KAAG1嵌合抗體的培養(yǎng)基，并且在37℃孵育4小時(shí)。將細(xì)胞在PBS中洗滌，然后固定在4％多聚甲醛(在PBS中)中持續(xù)20分鐘。在洗滌之后，將細(xì)胞用在PBS中的0.1％Triton X-100進(jìn)行透性化，持續(xù)5分鐘。用在PBS中的1.5％奶粉進(jìn)行封閉，持續(xù)1小時(shí)。通過(guò)在PBS中的1.5％奶中與抗-LAMP1(圣克魯茲，sc-18821，以1:100稀釋)孵育2小時(shí)而檢測(cè)溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMP1，常(Chang)等人，2002)。在PBS中洗滌之后，將第二抗體一起添加在1.5％的奶中，并且孵育1小時(shí)。對(duì)于抗-KAAG1嵌合抗體，第二抗體是以1:300稀釋的、羅丹明紅-X結(jié)合的驢抗-人IgG(H+L)。對(duì)于抗-LAMP1抗體，第二抗體是以1:300稀釋的、DyLight488結(jié)合的山羊抗-小鼠IgG(H+L)。兩種第二抗體都來(lái)自杰克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)。將蓋玻片在PBS中洗滌，并且封固在具有DAPI的ProLong Gold抗熒光衰減封片劑(antifade reagent)中。如在圖5A中所見，在37℃在SKOV-3卵巢癌細(xì)胞的存在下孵育4小時(shí)之后，能夠在其主要位于核周區(qū)域附近的復(fù)合物中檢測(cè)到3A4抗體(箭頭，參見在圖5A中的左圖中的紅色染色)，這是典型的基于內(nèi)體-溶酶體的內(nèi)化途徑。當(dāng)溶酶體標(biāo)記LAMP1被可視化并且被發(fā)現(xiàn)也在這些區(qū)域中表達(dá)時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)觀察(箭頭，參見在圖5A的中間圖中的綠色染色)。重要的是，兩個(gè)圖像的合并導(dǎo)致黃橙色結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，指示3A4和抗-LAMP1抗體存在于相同的結(jié)構(gòu)中(箭頭，參見在圖5A的右圖中的黃色染色)。3A4(與癌細(xì)胞表面上的KAAG1結(jié)合)與LAMP1(晚期內(nèi)體/溶酶體的標(biāo)記)的共定位顯示抗體/抗原復(fù)合物被內(nèi)化，并且它遵循適合于將要結(jié)合至3A4抗體上的有效載荷的釋放的一種途徑。在另一個(gè)細(xì)胞系TOV-21G中觀察到了相同的結(jié)果(參見圖5B)。

綜上所述，這些研究證明了對(duì)于KAAG1具有特異性的抗體(例如3A4)可以具有作為抗體-藥物結(jié)合物(ADC)的用途。因此，KAAG1的高水平卵巢癌特異性連同這個(gè)靶標(biāo)被內(nèi)化到細(xì)胞中的能力將支持作為ADC應(yīng)用的開發(fā)。

實(shí)例5

在癌細(xì)胞表面上的KAAG1的優(yōu)先檢測(cè)。

雖然開發(fā)了與KAAG1蛋白的不同表位相互作用的若干抗體，當(dāng)KAAG1表達(dá)在完整癌細(xì)胞的表面上時(shí)這些表位的可及性未被完全闡明。KAAG1的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)(在人蛋白質(zhì)中的氨基酸總數(shù)是84)的生物信息學(xué)分析未揭示可以相應(yīng)于跨膜結(jié)構(gòu)域的任何明顯的序列，并且因此KAAG1如何錨定至細(xì)胞膜是不完全清楚的。

發(fā)現(xiàn)針對(duì)KAAG1產(chǎn)生的抗體結(jié)合至KAAG1蛋白中的三個(gè)不同區(qū)域上(參見PCT/CA2009/001586)。大多數(shù)抗體與KAAG1蛋白中的氨基酸35-60相互作用，并且在本申請(qǐng)中由抗體3D3和3G12舉例說(shuō)明。與KAAG1的在氨基酸61-84之間的羧基端相互作用的抗體是由抗體3A4來(lái)舉例說(shuō)明。最后，如由3C4所舉例說(shuō)明的，與蛋白質(zhì)的氨基端區(qū)域相互作用的抗體顯示對(duì)于表達(dá)KAAG1的細(xì)胞的非常少的結(jié)合。

本申請(qǐng)表明，當(dāng)KAAG1表達(dá)在細(xì)胞中時(shí)，羧基端區(qū)域(氨基酸61-84)暴露于細(xì)胞外空間，并且靶向這個(gè)區(qū)域的抗體在KAAG1-陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)和潛在的處理上是最有效的。結(jié)合至KAAG1的中間區(qū)(氨基酸35-60)的抗體還可以檢測(cè)在細(xì)胞表面上的KAAG1，但與和羧基端相互作用的抗體相比達(dá)到較低的程度。

卵巢癌細(xì)胞系，例如SKOV-3，對(duì)于KAAG1表達(dá)是陽(yáng)性的。使用這些細(xì)胞以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)KAAG1，流式細(xì)胞術(shù)是一種允許細(xì)胞表面蛋白的檢測(cè)的方法并且為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。簡(jiǎn)言之，對(duì)于每個(gè)樣品，將100,000個(gè)細(xì)胞與在1μg/ml濃度下的第一抗體(抗-KAAG1、或?qū)φ湛贵w)在冰上孵育1小時(shí)。在用冰冷的PBS洗滌幾次之后，將染色細(xì)胞與結(jié)合至熒光染料(FITC)上的第二抗體一起孵育，檢測(cè)結(jié)合至這些細(xì)胞的第一抗體的存在。在幾次另外的洗滌之后，將細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。在圖6中表達(dá)的結(jié)果顯示Y軸和X軸，Y軸代表計(jì)數(shù)數(shù)目(細(xì)胞)，而X軸表示熒光的數(shù)量(熒光信號(hào))。當(dāng)將SKOV-3細(xì)胞與3A4抗體孵育時(shí)，觀察到大的熒光移位，指示在細(xì)胞的表面上有豐富的KAAG1蛋白(圖6A)并且它被這種抗體有效地識(shí)別。在相同條件下，與KAAG1的中間區(qū)相互作用的抗體3G12和3D3(圖6A)對(duì)于檢測(cè)KAAG1而言顯著更不有效。當(dāng)將細(xì)胞與增加濃度的3G12或3D3孵育時(shí)，可以在細(xì)胞表面上檢測(cè)到KAAG1(未顯示)。當(dāng)將細(xì)胞與對(duì)照IgG(圖6A)或3C4(一種針對(duì)KAAG1氨基端的抗體)(圖6A)孵育時(shí)，沒(méi)有觀察到信號(hào)。這些結(jié)果指示與KAAG1的羧基端相互作用的抗體可以比針對(duì)KAAG1的其他區(qū)域的抗體更有效地檢測(cè)在癌細(xì)胞表面上的抗原。這隱含了KAAG1的羧基端暴露于細(xì)胞的細(xì)胞外(外部)空間。針對(duì)其他表達(dá)KAAG1的癌細(xì)胞系獲得了相似的結(jié)果。

還在SKOV-3細(xì)胞中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，這些細(xì)胞是用Triton X-100進(jìn)行了透性化的。Triton X-100典型地用于透性化細(xì)胞膜并且釋放膜蛋白。當(dāng)透性化的細(xì)胞與3A4孵育并在流式細(xì)胞儀中測(cè)量時(shí)(參見圖6B)，該信號(hào)類似于在完整細(xì)胞中獲得的信號(hào)。引人注目地，當(dāng)透性化細(xì)胞與結(jié)合至KAAG1中間區(qū)上的3G12抗體孵育時(shí)(圖6B)，該信號(hào)與3A4的一樣強(qiáng)。這些結(jié)果指示KAAG1的中間區(qū)可能存在于細(xì)胞膜中或細(xì)胞內(nèi)部。用3D3抗體(另一個(gè)中間區(qū)結(jié)合劑)獲得了相似的結(jié)果(圖6B)，但針對(duì)3D3獲得的信號(hào)不是那么強(qiáng)。如前，在這個(gè)測(cè)定中，IgG對(duì)照未顯示任何可檢測(cè)的信號(hào)(圖6B)。有趣的是，細(xì)胞與結(jié)合至KAAG1氨基區(qū)上的3C4抗體的孵育未導(dǎo)致任何可檢測(cè)的信號(hào)(圖6B)。這個(gè)最終結(jié)果表明KAAG1的氨基區(qū)可能在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜過(guò)程中被切掉。

總體上，這些實(shí)驗(yàn)提供了KAAG1抗原在表達(dá)在癌細(xì)胞表面上時(shí)它的結(jié)構(gòu)和取向的許多深入的了解。基于這些數(shù)據(jù)，提出兩種針對(duì)在細(xì)胞表面處KAAG1結(jié)構(gòu)的模型(圖7)。在第一個(gè)模型中(圖7，模型A)，數(shù)據(jù)表明中間部分實(shí)際上是KAAG1的跨膜區(qū)，該跨膜區(qū)僅部分地暴露于細(xì)胞外空間。這將使得KAAG1的羧基端可容易地檢測(cè)，而使得中間區(qū)更難以結(jié)合。在第二個(gè)模型中(圖7，模型B)，KAAG1通過(guò)另一種其自身埋入細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)而錨定至膜上。再者，羧基端將是由抗體(例如3A4)易于接近的，但在KAAG1與蛋白質(zhì)伴侶之間的相互作用將使得難于進(jìn)入中間區(qū)。顯示由羧基端結(jié)合劑(如由3A4舉例說(shuō)明的)和中間區(qū)結(jié)合劑(如由3G12和3D3舉例說(shuō)明的)兩者組成的抗體在透性化細(xì)胞的存在下測(cè)試的結(jié)果與兩種模型一致。3C4抗體不能結(jié)合至完整的或透性化細(xì)胞中的KAAG1上很可能是由于缺乏包含在KAAG1的成熟加工膜形式的氨基端中的氨基酸，并且兩種模型均與此一致。

這些結(jié)果隱含了靶向癌細(xì)胞中KAAG1的羧基端(具體而言是由氨基酸61-84跨過(guò)的區(qū)域)的抗體最適合于用作治療表達(dá)KAAG1的癌的治療劑的抗體的開發(fā)。此外，結(jié)合至羧基端區(qū)域上的KAAG1抗體的其他用途包括用于檢測(cè)表達(dá)KAAG1的癌的診斷試劑。

根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法，可以通過(guò)用KAAG1的C-端部分免疫一種動(dòng)物而產(chǎn)生或分離具有與3A4抗體相似的結(jié)合特異性的抗體或抗原結(jié)合片段，這些方法包括雜交瘤技術(shù)、通過(guò)用KAAG1的C-端部分篩選抗體或抗原結(jié)合片段的文庫(kù)和/或用在此所述的3A4抗體對(duì)分離的抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定。

實(shí)例6

通過(guò)3A4小鼠單克隆抗體的設(shè)計(jì)而人源化

小鼠3A4單克隆抗體的可變區(qū)的3D建模

這項(xiàng)任務(wù)是通過(guò)同源建模而完成的。與輕鏈和重鏈的鼠3A4可變區(qū)序列(SEQ ID NO:4和2)最相似的模板結(jié)構(gòu)是通過(guò)針對(duì)PDB的BLAST檢索而鑒定的。為了建立小鼠3A4可變區(qū)的初始模型，使用了以下模板結(jié)構(gòu)(PDB碼)：對(duì)于輕鏈為2IPU(L鏈)，而對(duì)于重鏈為1F11(B鏈)。其他適合的模板，針對(duì)輕鏈而言可以在PDB入口2DDQ中找到，針對(duì)重鏈而言可以在PDB入口3IY3、1KTR、2VXT、1A6T和1IGI中找到。在這些根據(jù)鼠3A4序列的模板結(jié)構(gòu)上操作所需要的突變：在2IPU輕鏈中7個(gè)突變，而在1F11重鏈中17個(gè)突變加3-殘基缺失。通過(guò)將對(duì)應(yīng)的模板結(jié)構(gòu)的重鏈和輕鏈進(jìn)行疊加將相應(yīng)于鼠3A4可變區(qū)的重鏈和輕鏈的突變結(jié)構(gòu)組裝為二鏈抗體結(jié)構(gòu)。將組裝的3A4可變區(qū)的所得結(jié)構(gòu)首先通過(guò)用AMBER力場(chǎng)的能量最低化和約束的逐步釋放(范圍為從首先松弛的CDR環(huán)至框架區(qū)的主鏈重原子(只有在最后階段才完全松弛))而細(xì)化。然后將在每個(gè)抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)中的CDR-H3環(huán)通過(guò)蒙特卡羅最小化(Monte-Carlo-minimization，MCM)構(gòu)象采樣(其中在每個(gè)MCM循環(huán)中對(duì)CDR-H3區(qū)中的二面角進(jìn)行采樣，隨后為預(yù)定義區(qū)的能量最低化，該預(yù)定義區(qū)在CDR-H3環(huán)的初始構(gòu)象周圍處延伸)而細(xì)化。小鼠3A4抗體的模型化可變區(qū)的表示給出在圖8中。與每個(gè)3A4可變序列最相似的人或人源化可變序列的結(jié)構(gòu)也是從PDB鑒定的，并且然后將其疊加在鼠3A4可變區(qū)的模型化結(jié)構(gòu)上。這些結(jié)構(gòu)包括針對(duì)輕鏈的PDB入口3QCT、3AAZ、1WT5和3M8O以及針對(duì)重鏈的PDB入口1I9R、3NFP、1T04、1ZA6、3HC4、2D7T和1WT5。這些結(jié)構(gòu)用于輔助在框架區(qū)中的突變的建模，以便建立起始于模型化鼠3D結(jié)構(gòu)的人源化3D結(jié)構(gòu)。

小鼠3A4氨基酸序列和模型化結(jié)構(gòu)的表征

進(jìn)行這個(gè)步驟以估算人源化指數(shù)(humanness index)、抗原接觸傾向指數(shù)，以描繪CDR、規(guī)范殘基、鏈間包裝(VH/VL界面殘基)、可變-/恒定-區(qū)包裝(VH/CH和VL/CL界面殘基)、特殊的框架殘基、潛在的N-和O-糖基化位點(diǎn)、隱蔽殘基、Vernier區(qū)殘基、以及與CDR的靠近?；ヂ?lián)網(wǎng)可獲得的資源和本地軟件可以用來(lái)評(píng)定這些特性。

針對(duì)小鼠CDR的最好的人輕鏈和重鏈框架的選擇

這是通過(guò)針對(duì)人種系數(shù)據(jù)庫(kù)(VBASE)的局部拷貝、針對(duì)其他序列文庫(kù)(Genbank和SwissProt)的標(biāo)準(zhǔn)序列同源性比較、連同人框架共有序列的集合而進(jìn)行的。進(jìn)行BLAST檢索以檢索僅在框架區(qū)中具有最高同源性的序列匹配(因此排除CDR)同時(shí)匹配CDR環(huán)長(zhǎng)度的序列。經(jīng)鑒定用于3A4抗體的輕鏈和重鏈的人框架分別相應(yīng)于k2和h1類別。對(duì)于這些類別，除了人共有序列之外，還保留了與3A4框架序列最相似的若干人種系框架序列。

用于回復(fù)突變的框架殘基的鑒定以及多重人源化變體的設(shè)計(jì)

這是標(biāo)記應(yīng)當(dāng)特別謹(jǐn)慎地突變?yōu)橄鄳?yīng)的人序列的氨基酸殘基的重要步驟。這些殘基代表在親和力丟失的情況下用于回復(fù)突變?yōu)樾∈笮蛄械闹饕蜻x者。它是最困難的并且不可預(yù)測(cè)的經(jīng)設(shè)計(jì)的人源化步驟，特別是在不存在抗體-抗原復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)的情況下。它依賴于在以下類別的一項(xiàng)或多相中的殘基的鑒定：規(guī)范CDR-H3、Vernier區(qū)，特殊的靠近CDR的(在之內(nèi))鏈間包裝、以及糖基化位點(diǎn)殘基。這樣的殘基可能直接或間接地影響抗原結(jié)合部位和親和力。在人種系數(shù)據(jù)庫(kù)中在每個(gè)位置處的抗原接觸傾向性指數(shù)連同氨基酸發(fā)生在決定是否某些殘基可以安全地從小鼠序列突變?yōu)槿诵蛄兄幸彩菢O其重要的。3A4抗體輕鏈可變區(qū)的人源化涉及11個(gè)突變，突變?yōu)槠浣ㄗh的人源化框架，以用于100％的框架人源化。3A4抗體重鏈可變區(qū)的人源化涉及23個(gè)突變，突變?yōu)槠浣ㄗh的人源化框架，以用于100％的框架人源化。這些100％人源化可變區(qū)序列分別為標(biāo)記的Lvh1和Hvh1(SEQ ID NO:33和38)。另外的人源化序列還被設(shè)計(jì)為：其中將若干來(lái)自3A4小鼠序列的殘基基于謹(jǐn)慎的結(jié)構(gòu)和比較序列分析而保留，這些分析指示如果在這些位置將突變引入則有高的改變抗原結(jié)合親和力的概率?？勺儏^(qū)的這些序列是標(biāo)記的Lvh2、Hvh2、Hvh3和Hvh4(SEQ ID NO:34、39、40和41)。

兩種人源化輕鏈變體(包括恒定區(qū))在此被鑒定為L(zhǎng)h1(SEQ ID NO.:43)和Lh2(SEQ ID NO.:44)。四種人源化重鏈變體(包括恒定區(qū)_)在此被鑒定為Hh1(SEQ ID NO.:46)、Hh2(SEQ ID NO.:47)、Hh3(SEQ ID NO.:48)和Hh4(SEQ ID NO.:49)。兩種人源化輕鏈和4種人源化重鏈可以組裝為8種人源化抗體(Lh1Hh1、Lh1Hh2、Lh1Hh3、Lh1Hh4、Lh2Hh1、Lh2Hh2、Lh2Hh3、和Lh2Hh4)。對(duì)于所有的這些組合的分子模型是通過(guò)起始于鼠3A4可變區(qū)的3D模型的同源建模而構(gòu)建的，并且它們描繪于圖9a-9h中。

在3A4輕鏈人源化序列Lvh2(SEQ ID NO:34)的情況下，來(lái)自小鼠序列的框架殘基Val-L2和Lys-L45被保留，這是因?yàn)闅埢鵏2是半隱蔽的、與CDR-L1和CDR-L3兩者接觸，并且具有抗原接觸傾向，而殘基L45接近重鏈。我們注意到這些鼠殘基兩者均可以出現(xiàn)在人框架中。在3A4重鏈人源化序列Hvh2(SEQ ID NO:39)的情況下，來(lái)自小鼠序列的框架殘基Ile-H2和Lys-L73被保留，這是因?yàn)闅埢鵋2是半隱蔽的、與CDR-H1和CDR-H3兩者接觸，并且具有抗原接觸傾向，而殘基H73屬于支持CDR-H2的Vernier區(qū)，并且這些鼠殘基兩者均可以出現(xiàn)在人框架中。在3A4重鏈人源化序列Hvh3(SEQ ID NO:40)的情況下，Ile-H2和Lys-L73回復(fù)突變被保留，并且除了這些之外還保留了來(lái)自小鼠序列的框架殘基Ile-H48、Ala-H67、Leu-H69和Val-H71，這是因?yàn)樗羞@些另外的鼠殘基是隱蔽的殘基，并且屬于支持CDR-H2的Vernier區(qū)，并且鼠殘基H71也可以出現(xiàn)在人框架中。在3A4重鏈人源化序列Hvh4(SEQ ID NO:41)的情況下，包括Hvh3人源化變體的所有的6個(gè)回復(fù)突變加上另外的兩個(gè)小鼠框架殘基Lys-H38和Lys-H66(這是因?yàn)樗鼈兇斫咏贑DR-H2的半隱蔽殘基)。所得的鼠和人源化鏈的氨基酸序列列于表1中。鼠和人源化輕鏈可變區(qū)的比對(duì)顯示在圖10a中，并且鼠和人源化重鏈可變區(qū)的比對(duì)顯示在圖10b中。

圖11a和11b分別是鼠輕鏈可變區(qū)與100％人源化輕鏈可變區(qū)的比對(duì)、以及鼠重鏈可變區(qū)與100％人源化重鏈可變區(qū)的比對(duì)。這個(gè)圖展示了保留的氨基酸以及已經(jīng)被選擇用于置換的那些氨基酸。

實(shí)例7

3A4人源化變體抗體的組裝和表達(dá)

這些研究的目的是確定抗-凝聚素抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。具體而言，是為了確定3A4抗-KAAG1單克隆抗體的人源化是否影響它與人KAAG1結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。為此，使用來(lái)自BioRad的ProteOn XPR36儀器開發(fā)動(dòng)力學(xué)分析方法。將人KAAG1固定在傳感器芯片上。注入全長(zhǎng)抗體或Fab片段并且允許其與固定的KAAG1相互作用。

編碼3A4的嵌合(鼠)重鏈和輕鏈的質(zhì)粒的構(gòu)建

使用以下寡核苷酸引物對(duì)將嵌合抗體的重鏈和輕鏈通過(guò)PCR從原始鼠免疫球蛋白鏈擴(kuò)增：重鏈，由SEQ ID NO:50編碼的5’-寡核苷酸和由SEQ ID NO:51編碼的3’-寡核苷酸；輕鏈，由SEQ ID NO:52編碼的5’-寡核苷酸和由SEQ ID NO:53編碼的3’-寡核苷酸。將所得的PCR產(chǎn)物通過(guò)Hind III消化，并且克隆道預(yù)先用Hind III消化的pK-CR5(SEQ ID NO:21)中。

編碼人源化重鏈3A4變體1、2、3和4的質(zhì)粒的構(gòu)建

編碼抗體3A4的人源化重鏈區(qū)(Hh1、Hh2、Hh3和Hh4)的片段訂購(gòu)自GenScript(皮斯卡塔韋(Piscataway)，美國(guó))。將包含kozak序列和終止密碼子序列的DNA片段用HindIII消化，并且克隆到質(zhì)粒pK-CR5的HindIII位點(diǎn)中，該質(zhì)粒被預(yù)先用小牛腸堿性磷酸酶(NEB)脫磷酸化以防止重新環(huán)化。圖12a顯示了質(zhì)粒pK-CR5-3A4-HC-變體1的圖譜。將人源化3A4的所有重鏈變體以相似的方式進(jìn)行構(gòu)建。

編碼人源化輕鏈3A4變體1和2的質(zhì)粒的構(gòu)建

編碼抗體3A4的人輕鏈區(qū)(Lh1和Lh2)的片段訂購(gòu)自GenScript。將包含kozak序列和終止密碼子序列的DNA片段用BamHI消化，并且克隆到質(zhì)粒pMPG-CR5(SEQ ID NO:55)的BamHI位點(diǎn)中，該質(zhì)粒被預(yù)先用小牛腸堿性磷酸酶(NEB)脫磷酸化以防止重新環(huán)化。圖12b顯示了質(zhì)粒pMPG-CR5-3A4-LC-變體1的圖譜。將人源化3A4的所有輕鏈變體以相似的方式進(jìn)行構(gòu)建。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染研究

使用Mini-Prep試劑盒(凱杰(Qiagen)公司，米西索加(Mississauga)，安大略省(ON))，根據(jù)制造商的建議，將質(zhì)粒DNA從大腸桿菌的少量培養(yǎng)物分離。簡(jiǎn)言之，將含有100μg/ml氨芐西林的2ml LB培養(yǎng)基用在連接和轉(zhuǎn)化之后挑出的單一菌落接種。將培養(yǎng)物在37℃在伴隨劇烈震蕩(250RPM)下培養(yǎng)過(guò)夜。然后使用由試劑盒提供的方案、緩沖液、以及柱子將質(zhì)粒從1.5ml的培養(yǎng)物分離。使用50μl的無(wú)菌水將DNA洗脫。使用Plasmid Plus Maxi試劑盒(凱杰(Qiagen)公司，米西索加(Mississauga)，安大略省(ON))，根據(jù)制造商的建議，將質(zhì)粒DNA從大腸桿菌的大量培養(yǎng)物分離。將含有100μg/mL氨芐西林的200mL LB培養(yǎng)基用大腸桿菌的單一新鮮菌落接種，并且在37℃在劇烈震蕩(250RPM)下培養(yǎng)過(guò)夜。使細(xì)菌(針對(duì)重鏈為130mL培養(yǎng)物，而針對(duì)輕鏈為180mL培養(yǎng)物)通過(guò)在6000×g、在4℃離心持續(xù)15分鐘而沉淀，并且使用由試劑盒提供的方案、緩沖液和柱子將質(zhì)粒分離。將純的質(zhì)粒重懸浮于無(wú)菌50mM Tris(pH 8)中，并且通過(guò)測(cè)量在260nm下的光密度值而定量。在轉(zhuǎn)染之前，將純化的質(zhì)粒通過(guò)用苯酚/氯仿抽提而滅菌，隨后進(jìn)行乙醇沉淀。將質(zhì)粒重懸浮于無(wú)菌50mM Tris(pH 8)中，并且通過(guò)在260nm下的光密度值而定量。

在轉(zhuǎn)染之前，將細(xì)胞(CHO-cTA)用PBS進(jìn)行洗滌，并且將其以4.0×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸浮于不含硫酸葡聚糖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CD-CHO，英杰公司(Invitrogen))中，在懸浮培養(yǎng)中持續(xù)3小時(shí)。對(duì)于每個(gè)質(zhì)粒組合，通過(guò)緩慢添加補(bǔ)充有10μg/ml各質(zhì)粒以及50μg/ml聚乙烯亞胺(PEI Max；Polysciences)的5ml CDCHO培養(yǎng)基而使45ml的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。終濃度是：各個(gè)質(zhì)粒為1μg/ml，并且PEI為5μg/m1。在2小時(shí)之后，在30℃轉(zhuǎn)移細(xì)胞。接下來(lái)的幾天，將50μg/mL的硫酸葡聚糖和3.75ml的各個(gè)補(bǔ)充物(高效進(jìn)料A和B，英杰公司(Efficient Feed A and B Invitrogen))添加至細(xì)胞，并且將它們?cè)?0℃培養(yǎng)13天。在4、6、8和11天添加2.5ml的進(jìn)料A和2.5ml的進(jìn)料B。在13天時(shí)，將上清液經(jīng)過(guò)離心和通過(guò)0.22μM過(guò)濾器過(guò)濾進(jìn)行澄清。

將CHO細(xì)胞(CHOcTA)用編碼3A4抗體的人源化重鏈和輕鏈的不同變體的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，這些質(zhì)粒由CR5啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。進(jìn)行用輕鏈和重鏈的不同組合的轉(zhuǎn)染。作為對(duì)照，還用編碼嵌合/鼠抗體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

抗體的純化

通過(guò)在1500rpm下使用Amicon Ultra(Ultacell-50k)盒離心將來(lái)自CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染的15ml上清液濃縮。根據(jù)制造商的建議，使用Nab spin試劑盒蛋白A加(賽默科學(xué))，將濃縮抗體(550μl)純化。然后使用PBS以及濃縮Amicon Ultra(Ultracel-10K)盒在2500rpm下將純化抗體脫鹽至250μl的終體積。通過(guò)使用Nanodrop分光光度計(jì)讀取OD₂₈₀而將純化抗體定量，并且將其保持在-20℃的冷凍下。將純化抗體的等分部分重懸浮于等體積的Laemmli 2X中，并且將其在95℃加熱5分鐘，并在冰上冷卻。使用已知量的從人骨髓瘤血漿純化的人IgG1κ(Athens Research)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品在聚丙烯酰胺Novex 10％Tris-甘氨酸凝膠(加拿大英杰公司(Invitrogen Canada Inc.)，伯靈頓(Burlington)，安大略省(ON))上進(jìn)行分離，并且將其轉(zhuǎn)移至Hybond-N硝酸纖維素膜(阿莫仙生物科學(xué)公司(Amersham Bioscience Corp.)，Baie d’Urfée，魁北克省(QC))上在275mA下持續(xù)1小時(shí)。將膜在PBS中的0.15％吐溫20、5％脫脂乳中封閉1小時(shí)，并且用結(jié)合至Cy5的山羊抗-人IgG(H+L)(杰克遜公司(Jackson)，目錄號(hào)109-176-099)孵育1小時(shí)。通過(guò)用Typhoon Trio+掃描儀(通用醫(yī)療(GE Healthcare))掃描來(lái)對(duì)信號(hào)進(jìn)行揭示和定量。如在圖13中所示，在CHO細(xì)胞中表達(dá)3A4人源化抗體變體的所有組合。

實(shí)例8

鼠和人源化3A4抗體的動(dòng)力學(xué)分析

輔助材料

GLM傳感器芯片、Biorad ProteOn胺偶聯(lián)試劑盒(EDC，sNHS和乙醇胺)，以及10mM乙酸鈉緩沖液是從Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室(米西索加(Mississauga)，安大略省(ON))購(gòu)買的。HEPES緩沖液、EDTA、和NaCl是從西格瑪奧德里奇(奧克維爾(Oakville)，安大略省(ON))購(gòu)買的。10％的吐溫20溶液是從Teknova(霍利斯特(Hollister)，加利福尼亞州(CA))購(gòu)買的。山羊抗-人IgG Fc片段特異性抗體是從杰克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)購(gòu)買的。凝膠過(guò)濾柱Superdex 75 10/300GL是從通用醫(yī)療(GE Healthcare)購(gòu)買的。

凝膠過(guò)濾

將在3.114mg/ml濃度和220μL體積的KAAG1蛋白注入Superdex G75柱。在不含吐溫20的HBST電泳緩沖液(參見下文)中以0.4ml/min進(jìn)行分離。所收集的部分的體積是500μL。使用5500的延伸系數(shù)(extension coefficient)和8969的MW通過(guò)OD₂₈₀確定在每個(gè)部分中KAAG1的濃度。圖14代表KAAG1的凝膠過(guò)濾的曲線。潛在聚集體的小峰是在11ml左右處洗脫出。將在13ml處洗脫的蛋白質(zhì)用作SPR測(cè)定的分析物(部分15-19)。

SPR生物傳感器測(cè)定

使用BioRad ProteOn XPR36儀器(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室有限公司，米西索加(Mississauga)，安大略省(ON))，在25℃的溫度下，用HBST電泳緩沖液(10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，以及0.05％吐溫20，pH 7.4)進(jìn)行所有的表面等離子體共振測(cè)定。使用GLM傳感器芯片產(chǎn)生抗-小鼠Fc捕獲表面，該傳感器芯片用在分析物(水平)方向上以30μL/min注入(持續(xù)300秒)的1:5稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)BioRad sNHS/EDC溶液活化。在剛好活化之后，將在10mM NaOAc(pH 4.5)中的13μg/mL的特異性抗-人IgG Fc片段溶液在分析物方向上以25μL/min的流速注入，直到大致8000個(gè)共振單位(RU)被固定。將剩余的活性基團(tuán)通過(guò)在分析物方向上以30μL/min注入1M乙醇胺(持續(xù)300秒)進(jìn)行淬滅，并且這還確保產(chǎn)生用于空白對(duì)比的模擬活化的中間點(diǎn)(mock-activated interspot)。用于結(jié)合至KAAG1的3A4變體的篩選以兩步進(jìn)行：在配體方向(垂直)上將來(lái)自細(xì)胞上清液的3A4變體間接地捕獲在抗-人IgG Fc片段特異性表面上，隨后在分析物方向上注入KAAG1。首先，在配體方向上，將一種緩沖液以100uL/min注入持續(xù)30秒，用于穩(wěn)定基線。對(duì)于每個(gè)3A4捕獲物，將在細(xì)胞培養(yǎng)基中未純化的3A4變體在HBST中稀釋至4％，或大致使用在HBST中的1.25μg/mL的純化3A4。將四至五種3A4變體連同野生型3A4一起同時(shí)以25μL/min流量注入單獨(dú)的配體通道中，持續(xù)240秒。這導(dǎo)致在抗-人IgG Fc片段特異性表面上大致400RU-700RU的飽和3A4捕獲物。將第一配體通道留空以用作空白對(duì)照(如果需要的話)。3A4捕獲步驟之后立即進(jìn)行在分析物方向上的兩次緩沖液注入，以穩(wěn)定基線，并且然后將凝膠過(guò)濾純化的KAAG1注入。對(duì)于典型的篩選，將五個(gè)KAAG1濃度(8、2.66、0.89、0.29、和0.098nM)和緩沖液對(duì)照以50μL/min同時(shí)注入單獨(dú)的分析物通道中持續(xù)120秒，具有600秒的解離相，導(dǎo)致一組結(jié)合傳感圖，其中針對(duì)每個(gè)捕獲3A4變體具有緩沖液參照。通過(guò)0.85％的磷酸以100μL/min持續(xù)18秒的18秒脈沖而再生特異性抗-人IgG Fc片段-3A4復(fù)合物，以便制備用于下一個(gè)注入循環(huán)的抗-人IgG Fc片段特異性表面。將傳感圖進(jìn)行比對(duì)并且使用緩沖液空白注射和中間點(diǎn)(interspot)進(jìn)行雙重參照，并且使用ProteOn Manager軟件v3.0分析所得的傳感圖。使用局部R_max，通過(guò)將參照的傳感圖擬合為1:1朗繆爾結(jié)合模型來(lái)確定動(dòng)力學(xué)和親和力值，并且從所得的速率常數(shù)(k_d s^-1/k_a M^-1s^-1)導(dǎo)出親和常數(shù)(K_D M)。

速率常數(shù)和親和常數(shù)的確定

圖15概述了針對(duì)KAAG1與純化的鼠3A4、瞬時(shí)表達(dá)為嵌合變體和瞬時(shí)表達(dá)為人源化變體的鼠3A4相互作用的締合速率常數(shù)(k_a，1/Ms)和解離速率常數(shù)(k_d，1/s)以及親和常數(shù)(K_D，M)。這些常數(shù)圖解地表示于圖16中。針對(duì)純化的親本、嵌合的和人源化的3A4變體而言，締合速率常數(shù)是非常相似的(圖16a)。與純的親本3A4相比，針對(duì)瞬時(shí)表達(dá)嵌合體的解離速率常數(shù)是相似的，這表明轉(zhuǎn)染程序未改變KAAG1與抗體的相互作用的參數(shù)(圖16b)。然而，所有的人源化變體似乎具有略微改變的解離速率(off rate)，即較快的解離速率(dissociation rate)(圖16b)。這反映在親和常數(shù)上(圖16c)。總之，在人源化變體的結(jié)合常數(shù)(logK_D)與在親本抗體(LcHc)中制得的回復(fù)突變的數(shù)目之間存在著線性相關(guān)，其中當(dāng)突變數(shù)目增加時(shí)，結(jié)合親和力下降。然而，在沒(méi)有保留小鼠殘基的較差的變體(H1L1，0.47nM)與保留了10個(gè)小鼠殘基的最佳變體(H4L2，0.1nM)之間在結(jié)合親和力方面的差異僅差4倍。最后，發(fā)現(xiàn)所有變體針對(duì)KAAG1的結(jié)合親和力是納摩爾之下的，并且最佳變體(H4L2，0.1nM)展現(xiàn)出比鼠(LcHc，0.057nM)大約弱6倍的親和力?？傮w上，這些結(jié)果表明，當(dāng)所有變體展示出針對(duì)KAAG1的非常高的親和力時(shí)人源化是成功的。

實(shí)例9

在ELISA中3A4人源化變體結(jié)合至KAAG1

還使用ELISA方法來(lái)比較人源化3A4變體的結(jié)合活性與鼠3A4抗體的結(jié)合活性。將重組人KAAG1隔夜(O/N)包被在96-孔板中，洗滌，并且在室溫下與漸增量的鼠的或人源化的3A4變體孵育1小時(shí)。在另一輪的洗滌步驟之后，將結(jié)合至HRP的抗-人抗體添加至孔中，并且將結(jié)合的3A4抗體在Abs₄₅₀下進(jìn)行量熱式測(cè)量。如在圖17A中所示，當(dāng)與鼠3A4(LcHc)比較時(shí)，人源化變體(Lh1Hh1、Lh1Hh2、Lh1Hh3和Lh1Hh4)展示出與KAAG1的非常相似的結(jié)合這個(gè)結(jié)果表明，當(dāng)與人源化輕鏈的L1變體組裝時(shí)，所有四種人源化重鏈變體相對(duì)原始的h3A4重鏈而言是相當(dāng)?shù)?。圖17B顯示了當(dāng)重鏈變體與3A4人源化輕鏈的Lh2變體組裝時(shí)的結(jié)果。在這種情況下，變體的結(jié)合有差異。例如，Lh2hh4是與鼠3A4相比較具有最接近的曲線的變體。這與SPR數(shù)據(jù)一致(參見實(shí)例3)，顯示重鏈的變體4對(duì)于KAAG1具有最高親和力。綜上所述，這些結(jié)合結(jié)果顯示，在這個(gè)測(cè)定中，所有人源化變體均與人KAAG1相互作用。雖然有細(xì)微差異，但ELISA的結(jié)合SPR結(jié)果相符。

實(shí)例10

在癌細(xì)胞表面上3A4人源化變體的結(jié)合

使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估人源化3A4變體與在癌細(xì)胞表面上表達(dá)的KAAG1相互作用的能力。為此，將SKOV-3卵巢癌細(xì)胞(先前我們已經(jīng)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)顯示這些卵巢癌細(xì)胞有效地被3A4結(jié)合)與八種人源化變體以及原始鼠抗體孵育。簡(jiǎn)言之，用EDTA使SKOV-3細(xì)胞從板脫離，并且將其與3.0mg/ml、0.3mg/ml或0.3mg/ml的抗體在冰上孵育持續(xù)1小時(shí)。在三次洗滌步驟之后，將細(xì)胞與第二抗體(結(jié)合至FITC的抗-人IgG)在冰上孵育1小時(shí)。在流式細(xì)胞儀中測(cè)量細(xì)胞表面熒光，并且將這些值顯示在圖18的直方圖中。如所描繪的，所有變體可以檢測(cè)在未透性化時(shí)的表面上的KAAG1，并且最強(qiáng)的信號(hào)是在3A4抗體的最高濃度下(3mg/ml)獲得的，并且隨著抗體濃度降低而降低。在不同的變體之間，具有最多的鼠回復(fù)突變的變體(圖18，參見Lh1Hh4和Lh2Hh4)與在細(xì)胞表面上的KAAG1以最高的活性相互作用。事實(shí)上，與鼠3A4抗體(LcHc)相比較，Lh1Hh4和Lh2hh4表現(xiàn)為略微改進(jìn)的與KAAG1的細(xì)胞表面結(jié)合。

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在說(shuō)明書中引用的序列

SEQ ID NO.：1-3A4重鏈可變區(qū)核苷酸序列

CAGATCCAGTTGGTGCAATCTGGACCTGAGATGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACGACTACATGAGCTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTTACAACGGTGATACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCGGAAGACTCAGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGACCCGGGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO.：2-3A4重鏈可變區(qū)多肽序列

QIQLVQSGPEMVKPGASVKMSCKASGYTFTDDYMSWVKQSHGKSLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKAILTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDPGAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO.：3-3A4輕鏈可變區(qū)核苷酸序列

GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGGCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTCTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTTCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCCACACAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAGGCTGGAGCTGAAA

SEQ ID NO.：4-3A4輕鏈可變區(qū)多肽序列

DVVMTQTPLSLAVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTRLELK

SEQ ID NO.：5-3A4重鏈CDR1多肽序列

GYTFTDDYMS

SEQ ID NO.：6-3A4重鏈CDR2多肽序列

DINPYNGDTN

SEQ ID NO.：7-3A4重鏈CDR3多肽序列

DPGAMDY

SEQ ID NO.：8-3A4輕鏈CDR1多肽序列

RSSQSLLHSNGNTYLE

SEQ ID NO.：9-3A4輕鏈CDR2多肽序列

TVSNRFS

SEQ ID NO.：10-3A4輕鏈CDR3多肽序列

FQGSHVPLT

SEQ ID NO.：11-OGS1773

GTAAGCAGCGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC

SEQ ID NO.：12-OGS1774

GTAAGCGCTAGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC

SEQ ID NO.：13-人κ恒定核苷酸序列

GCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

SEQ ID NO.:14-人κ恒定多肽序列

AVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.：15

CTTGAGCCGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGCATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTTGAGACGGAGCTTACAGCGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGGTACCGCGGCCGCTTCGAATGAGATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGCCCCGCCGCCGGACGAACTAAACCTGACTACGGCATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGATACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCACGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAGCTAGAGGTCGACCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGCAGATCCGGGCAACGTTGTTGCATTGCTGCAGGCGCAGAACTGGTAGGTATGGCAGATCTATACATTGAATCAATATTGGCAATTAGCCATATTAGTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGT

SEQ ID NO.：16-OGS18500

ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGATGTTGTGATGACCCAAACTCC

SEQ ID NO：.17-OGS2084

GGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTCCG

SEQ ID NO.：18-OGS1769

GTAAGCGCTAGCGCCTCAACGAAGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCC

SEQ ID NO.：19-OGS1770

GTAAGCGAATTCACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTG

SEQ ID NO.：20-人免疫球蛋白CH1區(qū)核苷酸序列

GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT

SEQ ID NO.：21-人免疫球蛋白CH1區(qū)多肽序列

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

SEQ ID NO.：22

CTTGAGCCGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCC

TCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGCGGAGACGGAGCTTACGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAATTCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGCCCCGCCGCCGGACGAACTAAACCTGACTACGGCATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGATGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCACGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGT

SEQ ID NO.：23-OGS1879

GGGTTCCAGGTTCCACTGGCCAGATCCAGTTGGTGCAATCTGG

SEQ ID NO.：24-OGS1810

GGGGCCAGGGGAAAGACAGATGGGCCCTTCGTTGAGGC

SEQID NO.：25

GTAAGCGGATCCATGGATGACGACGCGGCGCCC

SEQ ID NO.：26

GTAAGCAAGCTTAGGCCGCTGGGACAGCGGAGGTGC

SEQ ID NO.：27

GTAAGCAAGCTTGGCAGCAGCGCCAGGTCCAGC

SEQ ID NO.：28

GAGGGGCATCAATCACACCGAGAAGTCACAGCCCCTCAACCACTGAGGTGTGGGGGGGTAGGGATCTGCATTTCTTCATATCAACCCCACACTATAGGGCACCTAAATGGGTGGGCGGTGGGGGAGACCGACTCACTTGAGTTTCTTGAAGGCTTCCTGGCCTCCAGCCACGTAATTGCCCCCGCTCTGGATCTGGTCTAGCTTCCGGATTCGGTGGCCAGTCCGCGGGGTGTAGATGTTCCTGACGGCCCCAAAGGGTGCCTGAACGCCGCCGGTCACCTCCTTCAGGAAGACTTCGAAGCTGGACACCTTCTTCTCATGGATGACGACGCGGCGCCCCGCGTAGAAGGGGTCCCCGTTGCGGTACACAAGCACGCTCTTCACGACGGGCTGAGACAGGTGGCTGGACCTGGCGCTGCTGCCGCTCATCTTCCCCGCTGGCCGCCGCCTCAGCTCGCTGCTTCGCGTCGGGAGGCACCTCCGCTGTCCCAGCGGCCTCACCGCACCCAGGGCGCGGGATCGCCTCCTGAAACGAACGAGAAACTGACGAATCCACAGGTGAAAGAGAAGTAACGGCCGTGCGCCTAGGCGTCCACCCAGAGGAGACACTAGGAGCTTGCAGGACTCGGAGTAGACGCTCAAGTTTTTCACCGTGGCGTGCACAGCCAATCAGGACCCGCAGTGCGCGCACCACACCAGGTTCACCTGCTACGGGCAGAATCAAGGTGGACAGCTTCTGAGCAGGAGCCGGAAACGCGCGGGGCCTTCAAACAGGCACGCCTAGTGAGGGCAGGAGAGAGGAGGACGCACACACACACACACACACAAATATGGTGAAACCCAATTTCTTACATCATATCTGTGCTACCCTTTCCAAACAGCCTA

SEQ ID NO.：29

MDDDAAPRVEGVPVAVHKHALHDGLRQVAGPGAAAAHLPRWPPPQLAASRREAPPLSQRPHRTQGAGSPPETNEKLTNPQVKEK

SEQ ID NO.：30(變體輕鏈可變區(qū))

DXVMTQTPLSLXVXXGXXASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXLLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXGVYYCFQGSHVPLTFGXGTXLEXK

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：4中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。氨基酸置換可以是例如保守性的。

SEQ ID NO.：31(變體輕鏈可變區(qū))

DX_a1VMTQTPLSLX_a2VX_a3X_a4GX_a5X_a6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPX_a7LLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDX_a8GVYYCFQGSHVPLTFGX_a9GTX_a10LEX_a11K

其中X_a1可以是疏水性氨基酸；

其中X_a2可以是A或P；

其中X_a3可以是中性親水性氨基酸；

其中X_a4可以是L或P；

其中X_a5可以是酸性氨基酸；

其中X_a6可以是Q或P；

其中X_a7可以是堿性氨基酸；

其中X_a8可以是疏水性氨基酸；

其中X_a9可以是A或Q；

其中X_a10可以是堿性氨基酸；或

其中X_a11可以是疏水性氨基酸，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：4中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。

SEQ ID NO.：32(變體輕鏈可變區(qū))

DX_A1VMTQTPLSLX_A2VX_A3X_A4GX_A5X_A6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPX_A7LLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDX_A8GVYYCFQGSHVPLTFGX_A9GTX_A10LEX_A11K

其中X_A1可以是V或I

其中X_A2可以是A或P

其中X_A3可以是S或T

其中X_A4可以是L或P

其中X_A5可以是D或E

其中X_A6可以是Q或P；

其中X_A7可以是K或Q

其中X_A8可以是L或V

其中X_A9可以是A或Q

其中X_A10可以是R或K，或

其中X_A11可以是L或I，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：4中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。

SEQ ID NO.：33(變體1輕鏈可變區(qū)：Lvh1)

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO.：34(變體2輕鏈可變區(qū)：Lvh2)

DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO.：35(變體重鏈可變區(qū))

QXQLVQSGXEXXKPGASVKXSCKASGYTFTDDYMSVVVXQXXGXXLEWXGDINPYNGDTNYNQKFKGXXXXTXDXSXSTAYMXLXSLXSEDXAVYYCARDPGAMDYWGQGTXVTVSS

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：2中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。氨基酸置換可以是例如保守性的。

SEQ ID NO.：36(變體重鏈可變區(qū))

QX_b1QLVQSGX_b2EX_b3X_b4KPGASVKX_b5SCKASGYTFTDDYMSWVX_b6QX_b7X_b8GX_b9X_b10LEWX_b11GDINPYNGDTNYNQKFKGX_b12X_b13X_b14X_b15TX_b16DX_b17SX_b18STAYMX_b19LX_b20SLX_b21SEDX_b22AVYYCARDPGAMDYWGQGTX_b23VTVSS

其中X_b1可以是疏水性氨基酸；

其中X_b2可以是P或A；

其中X_b3可以是疏水性氨基酸；

其中X_b4可以是V或K；

其中X_b5可以是疏水性氨基酸；

其中X_b6可以是堿性氨基酸；

其中X_b7可以是S或A；

其中X_b8可以是H或P；

其中X_b9可以是堿性氨基酸；

其中X_b10可以是S或G；

其中X_b11可以是疏水性氨基酸；

其中X_b12可以是堿性氨基酸；

其中X_b13可以是疏水性氨基酸；

其中X_b14可以是I或T；

其中X_b15可以是疏水性氨基酸；

其中X_b16可以是疏水性氨基酸；

其中X_b17可以是K或T；

其中X_b18可以是中性親水性氨基酸；

其中X_b19可以是Q或E；

其中X_b20可以是N或S；

其中X_b21可以是T或R；

其中X_b22可以是中性親水性氨基酸；或

其中X_b23可以是S或L，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：2中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。

SEQ ID NO.：37(變體重鏈可變區(qū))

QX_B1QLVQSGX_B2EX_B3X_B4KPGASVKX_B5SCKASGYTFTDDYMSWVX_B6QX_B7X_B8GX_B9X_B10LEWX_B11GDINPYNGDTNYNQKFKGX_B12X_B13X_B14X_B15TX_B16DX_B17SX_B18STAYMX_B19LX_B20SLX_B21SEDX_B22AVYYCARDPGAMDYWGQGTX_B23VTVSS

其中X_B1可以是I或V；

其中X_B2可以是P或A；

其中X_B3可以是M或V；

其中X_B4可以是V或K；

其中X_B5可以是M或V；

其中X_B6可以是K或R；

其中X_B7可以是S或A；

其中X_B8可以是H或P；

其中X_B9可以是K或Q；

其中X_B10可以是S或G；

其中X_B11可以是I或M；

其中X_B12可以是K或R；

其中X_B13可以是A或V；

其中X_B14可以是I或T；

其中X_B15可以是L或I，

其中X_B16可以是V或A；

其中X_B17可以是K或T；

其中X_B18可以是S或T

其中X_B19可以是Q或E；

其中X_B20可以是N或S；

其中X_B21可以是T或R；

其中X_B22可以是S或T；或

其中X_B23可以是S或L，

其中，由X確定的氨基酸的至少一個(gè)是與在SEQ ID NO.：2中列出的多肽中的相應(yīng)氨基酸相比較的氨基酸置換(保守性或非保守性)。

SEQ ID NO.：38(變體1重鏈可變區(qū)：Hvh1)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.：39(變體2重鏈可變區(qū)：Hvh2)

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.：40(變體3重鏈可變區(qū)：Hvh3)

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.：41(變體4重鏈可變區(qū)：Hvh4)

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：42 3A4鼠輕(κ)鏈

DVVMTQTPLSLAVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTRLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO：43 3A4人源化輕(κ)鏈變體1；Lh1

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO：44 3A4人源化輕(κ)鏈變體2；Lh2

DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO：45 3A4鼠重(Igg1)鏈

QIQLVQSGPEMVKPGASVKMSCKASGYTFTDDYMSWVKQSHGKSLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKAILTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDPGAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：46 3A4人源化重(Igg1)鏈變體1；Hh1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：47 3A4人源化重(Igg1)鏈變體2；Hh2

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：48 3A4人源化重(Igg1)鏈變體3；Hh3

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：49 3A4人源化重(Igg1)鏈變體4：Hh4

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：50

ATACCCAAGCTTGCCACCATGGAGAGAGACACAC

SEQ ID NO：51

ATACCCAAGCTTCATTTCCCGGGAGACAGGGAG

SEQ ID NO：52

ATACCCAAGCTTGGGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG

SEQ ID NO:53

ATACCCAAGCTTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG

SEQ ID NO:54pK-CR5

CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCACATCGGCGCGCCAAATGATTTGCCCTCCCATATGTCCTTCCGAGTGAGAGACACAAAAAATTCCAACACACTATTGCAATGAAAATAAATTTCCTTTATTAGCCAGAGGTCGAGATTTAAATAAGCTTGCTAGCAGATCTTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTCATTGTCACTCAAGTGTATGGCCAGATCGGGCCAGGTGAATATCAAATCCTCCTCGTTTTTGGAAACTGACAATCTTAGCGCAGAAGTAATGCCCGCTTTTGAGAGGGAGTACTCACCCCAACAGCTGGATCTCAAGCCTGCCACACCTCACCTCGACCATCCGCCGTCTCAAGACCGCCTACTTTAATTACATCATCAGCAGCACCTCCGCCAGAAACAACCCCGACCGCCACCCGCTGCCGCCCGCCACGGTGCTCAGCCTACCTTGCGACTGTGACTGGTTAGACGCCTTTCTCGAGAGGTTTTCCGATCCGGTCGATGCGGACTCGCTCAGGTCCCTCGGTGGCGGAGTACCGTTCGGAGGCCGACGGGTTTCCGATCCAAGAGTACTGGAAAGACCGCGAAGAGTTTGTCCTCAACCGCGAGCCCAACAGCTGGCCCTCGCAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGACCGCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGGCCTCCCACCGTACACGCCTACCTCGACCCGGGTACCAATCTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTAAGGTTGTCGAGTGAAGACGAAAGGGTTCATTAAGGCGCGCCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC

SEQ ID NO：55pMPG-CR5

GTCGACGATACCGTGCACTTAATTAAGCGCGCTCGACCAAATGATTTGCCCTCCCATATGTCCTTCCGAGTGAGAGACACAAAAAATTCCAACACACTATTGCAATGAAAATAAATTTCCTTTATTAGCCAGAGGTCGAGGTCGGGGGATCCGTTTAAACTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTCATTGTCACTCAAGTGTATGGCCAGATCGGGCCAGGTGAATATCAAATCCTCCTCGTTTTTGGAAACTGACAATCTTAGCGCAGAAGTAATGCCCGCTTTTGAGAGGGAGTACTCACCCCAACAGCTGGATCTCAAGCCTGCCACACCTCACCTCGACCATCCGCCGTCTCAAGACCGCCTACTTTAATTACATCATCAGCAGCACCTCCGCCAGAAACAACCCCGACCGCCACCCGCTGCCGCCCGCCACGGTGCTCAGCCTACCTTGCGACTGTGACTGGTTAGACGCCTTTCTCGAGAGGTTTTCCGATCCGGTCGATGCGGACTCGCTCAGGTCCCTCGGTGGCGGAGTACCGTTCGGAGGCCGACGGGTTTCCGATCCAAGAGTACTGGAAAGACCGCGAAGAGTTTGTCCTCAACCGCGAGCCCAACAGCTGGCCCTCGCAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGACCGCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGGCCTCCCACCGTACACGCCTACCTCGACCCGGGTACCAATCTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTAAGGTTGTCGAGTGAAGACGAAAGGGTTAATTAAGGCGCGCCGTCGACTAGCTTGGCACGCCAGAAATCCGCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCGGTGTTCGTGTCGCGCCAGTACATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCAGTCGTGGACCAGACCCCACGCAACGCCCAAAATAATAACCCCCACGAACCATAAACCATTCCCCATGGGGGACCCCGTCCCTAACCCACGGGGCCAGTGGCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGGTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGCCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTGAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCATTGCCCGGGATCTGCGGCACGCTGTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGCTGCAGGGTCGCTCGGTGTTCGAGGCCACACGCGTCACCTTAATATGCGAAGTGGACCTGGGACCGCGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAGGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCTCTAGCAGATCCGGAATTCCCCTCCCCAATTTAAATGAGGACCTAACCTGTGGAAATCTACTGATGTGGGAGGCTGTAACTGTACAAACAGAGGTTATTGGAATAACTAGCATGCTTAACCTTCATGCAGGGTCACAAAAAGTGCATGACGATGGTGGAGGAAAACCTATTCAAGGCAGTAATTTCCACTTCTTTGCTGTTGGTGGAGACCCCTTGGAAATGCAGGGAGTGCTAATGAATTACAGGACAAAGTACCCAGATGGTACTATAACCCCTAAAAACCCAACAGCCCAGTCCCAGGTAATGAATACTGACCATAAGGCCTATTTGGACAAAAACAATGCTTATCCAGTTGAGTGCTGGGTTCCTGATCCTAGTAGAAATGAAAATACTAGGTATTTTGGGACTTTCACAGGAGGGGAAAATGTTCCCCCAGTACTTCATGTGACCAACACAGCTACCACAGTGTTGCTAGATGAACAGGGTGTGGGGCCTCTTTGTAAAGCTGATAGCCTGTATGTTTCAGCTGCTGATATTTGTGGCCTGTTTACTAACAGCTCTGGAACACAACAGTGGAGAGGCCTTGCAAGATATTTTAAGATCCGCCTGAGAAAAAGATCTGTAAAGAATCCTTACCTAATTTCCTTTTTGCTAAGTGACCTTATAAACAGGAGAACCCAGAGAGTGGATGGGCAGCCTATGTATGGTATGGAATCCCAGGTAGAAGAGGTTAGGGTGTTTGATGGCACAGAAAGACTTCCAGGGGACCCAGATATGATAAGATATATTGACAAACAGGGACAATTGCAAACCAAAATGCTTTAAACAGGTGCTTTTATTGTACATATACATTTAATAAATGCTGCTTTTGTATAAGCCACTTTTAAGCTTGTGTTATTTTGGGGGTGGTGTTTTAGGCCTTTTAAAACACTGAAAGCCTTTACACAAATGCAACTCTTGACTATGGGGG TCTGACCTTTGGGAATGTTCAGCAGGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCAGTGCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATCCTCTTCTCTTGTAATATCAAGAATACATTTCCCCATGCATATATTATATTTCATCCTTGAAAAAGTATACATACTTATCTCAGAATCCAGCCTTTCCTTCCATTCAACAATTCTAGAAGTTAAAACTGGGGTAGATGCTATTACAGAGGTAGAATGCTTCCTAAACCCAGAAATGGGGGATCTGC

SEQ ID NO.：56-3A4人源化重鏈CDR2多肽序列

DINPYNGDTNYNQKFKG

本發(fā)明的一些實(shí)施方案如下：

1.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體或其抗原結(jié)合片段能夠特異性地結(jié)合至腎相關(guān)抗原1(KAAG1)上，這種腎相關(guān)抗原1具有與SEQ ID NO.:4至少70％一致的一個(gè)輕鏈可變區(qū)和/或與SEQ ID NO.:2至少70％一致的一個(gè)重鏈可變區(qū)，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與SEQ ID NO.:4或SEQ ID NO.:2相比包含至少一個(gè)氨基酸置換，并且其中所述氨基酸置換是在一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)之外。

2.如實(shí)施方案1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO.:4是至少80％一致的。

3.如實(shí)施方案1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO.:4是至少90％一致的。

4.如實(shí)施方案1至3中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO.:2是至少80％一致的。

5.如實(shí)施方案4所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO.:2是至少90％一致的。

6.如實(shí)施方案1至5中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該至少一個(gè)氨基酸置換是在該輕鏈可變區(qū)之內(nèi)。

7.如實(shí)施方案1至6中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該至少一個(gè)氨基酸置換是在該重鏈可變區(qū)之內(nèi)。

8.如實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中這些重鏈CDR包含在SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7中列出的這些氨基酸。

9.如實(shí)施方案1至8中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中這些輕鏈CDR包含在SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10中列出的這些氨基酸。

10.如實(shí)施方案1至9中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體是一種單克隆抗體、一種嵌合抗體、一種雜交抗體、一種人源化抗體或一種人抗體、或它們的一種抗原結(jié)合片段。

11.如實(shí)施方案1至10中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)是如在SEQ ID NO.:30中所列出的。

12.如實(shí)施方案11所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)是如在SEQ ID NO.:32中所列出的。

13.如實(shí)施方案12所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該輕鏈可變區(qū)是如在SEQ ID NO.:33中或在SEQ ID NO.:34中所列出的。

14.如實(shí)施方案1至13中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)是如在SEQ ID NO.:35中所列出的。

15.如實(shí)施方案14所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)是如在SEQ ID NO.:36中所列出的。

16.如實(shí)施方案15所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)是如在SEQ ID NO.:37中所列出的。

17.如實(shí)施方案16所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變區(qū)是如在SEQ ID NO.:38、SEQ ID NO.:39、SEQ ID NO.:40或SEQ ID NO.:41中所列出的。

18.一種抗體或抗原結(jié)合片段，該抗體或抗原結(jié)合片段能夠與如實(shí)施方案1至17中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)并且具有少1nM的親和力。

19.如實(shí)施方案1至17中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，該抗體或抗原結(jié)合片段與一種治療部分相結(jié)合。

20.如實(shí)施方案1至17中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，該抗體或抗原結(jié)合片段與一種可檢測(cè)部分相結(jié)合。

21.一種核酸，該核酸編碼如實(shí)施方案1至17中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段的一個(gè)輕鏈可變區(qū)和/或一個(gè)重鏈可變區(qū)。

22.一種載體，該載體包含如實(shí)施方案21所述的核酸。

23.如實(shí)施方案22所述的載體，其中所述載體是一種表達(dá)載體。

24.一種分離的細(xì)胞，這種分離的細(xì)胞包含如實(shí)施方案21所述的核酸。

25.如實(shí)施方案24所述的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含編碼一個(gè)輕鏈可變區(qū)的一種核酸、以及編碼一個(gè)重鏈可變區(qū)的一種核酸。

26.如實(shí)施方案25所述的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)、組裝和/或分泌一種抗體或其抗原結(jié)合片段。

27.一種分離的細(xì)胞，這種分離的細(xì)胞包含或表達(dá)如實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段。

28.如實(shí)施方案27所述的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含編碼一個(gè)輕鏈可變區(qū)的一種核酸、以及編碼一個(gè)重鏈可變區(qū)的一種核酸。

29.如實(shí)施方案28所述的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)、組裝和/或分泌一種抗體或其抗原結(jié)合片段。

30.一種藥物組合物，該藥物組合物包含如實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段、以及一種藥學(xué)上可接受的載體。

31.一種組合物，該組合物包含如實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段、以及一種載體。

32.一種治療癌癥的方法，該癌癥包含表達(dá)KAAG1或一種KAAG1變體的細(xì)胞，該方法包括將如實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段給予至有需要的受試者。

33.如實(shí)施方案32所述的方法，其中該癌癥選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦腫瘤、甲狀腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、食管腫瘤、膀胱腫瘤、肺腫瘤以及頭頸部腫瘤。

34.如實(shí)施方案33所述的方法，其中該癌癥是卵巢癌。

35.如實(shí)施方案34所述的方法，其中該癌癥是復(fù)發(fā)性卵巢癌。

36.如實(shí)施方案32至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中該癌癥是轉(zhuǎn)移性的。

37.一種檢測(cè)腫瘤的方法，該腫瘤包含表達(dá)KAAG1或一種KAAG1變體的細(xì)胞，該方法包括將如實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段給予至有需要的受試者。

38.如實(shí)施方案37所述的方法，其中有需要的受試者患有一種選自下組的癌癥，該組由以下各項(xiàng)組成：卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及頭頸癌。

39.一種用于檢測(cè)KAAG1或KAAG1變體的方法，該方法包括使一種表達(dá)KAAG1或KAAG1變體的細(xì)胞或一種包含或疑似包含KAAG1或該KAAG1變體的樣品與如實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段接觸，并且對(duì)結(jié)合進(jìn)行測(cè)量。

40.如實(shí)施方案39所述的方法，其中受試者患有或疑似患有癌癥。

41.如實(shí)施方案40所述的方法，其中該癌癥是轉(zhuǎn)移性的。

42.如實(shí)施方案39至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中該樣品是從一種哺乳動(dòng)物獲得的一種血清樣品、一種血漿樣品或一種血液樣品。

43.如實(shí)施方案39至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中該樣品是從一種哺乳動(dòng)物獲得的一種組織樣品。

44.如實(shí)施方案39至41所述的方法，其中該樣品是一種細(xì)胞培養(yǎng)物或一種上清液。

45.如實(shí)施方案39至44中任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括將結(jié)合至KAAG1或該KAAG1變體上的抗體的量進(jìn)行定量。

46.一種試劑盒，該試劑盒包含如實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段。

47.如實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段在一種藥劑的制造中的用途，該藥劑用于治療癌癥，該癌癥包含表達(dá)KAAG1或一種KAAG1變體的細(xì)胞。

48.如實(shí)施方案47所述的用途，其中該癌癥選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及頭頸癌。

49.如實(shí)施方案48所述的用途，其中該癌癥是卵巢癌。

50.如實(shí)施方案49所述的用途，其中該癌癥是復(fù)發(fā)性卵巢癌。

51.如實(shí)施方案47至50中任一項(xiàng)所述的用途，其中該癌癥是轉(zhuǎn)移性的。

52.如實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段在包含表達(dá)KAAG1或一種KAAG1變體的細(xì)胞的癌癥的診斷中的用途，或在表達(dá)KAAG1或一種KAAG1變體的細(xì)胞的檢測(cè)中的用途。

53.如實(shí)施方案52所述的用途，其中該癌癥選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：卵巢癌、皮膚癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、肉瘤、白血病、腦癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及頭頸癌。

54.如實(shí)施方案53所述的用途，其中該癌癥是卵巢癌。

55.如實(shí)施方案54所述的用途，其中該癌癥是復(fù)發(fā)性卵巢癌。

56.如實(shí)施方案52至55中任一項(xiàng)所述的用途，其中該癌癥是轉(zhuǎn)移性的。

57.一種用于獲得抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，該抗體或其抗原結(jié)合片段適合于用作一種治療癌癥的抗體-藥物結(jié)合物，該癌癥包含表達(dá)KAAG1或一種KAAG1變體的細(xì)胞，該方法包括：

a.提供特異性地結(jié)合至一種表位的一種抗體或一種抗原結(jié)合片段，該表位被包含在KAAG1或一種KAAG1變體的氨基酸61與84之間；

b.對(duì)該抗體或抗原結(jié)合片段在表達(dá)KAAG1或一種KAAG1變體的一種細(xì)胞之內(nèi)的內(nèi)化進(jìn)行測(cè)試；并且

c.對(duì)被內(nèi)化的一種抗體或一種抗原結(jié)合片段進(jìn)行分離。