本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及抗體藥物開發(fā)和生產(chǎn)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種分離純化重組抗人-EGFR單克隆抗體的方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在各種疾病所致的死亡中緊跟心臟病之后位居第二位。隨著人口老齡化和城市化進(jìn)程的不斷發(fā)展，惡性腫瘤的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因C-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，erbB-1廣泛分布于除血管組織外的上皮細(xì)胞膜上。目前在多種實體瘤如結(jié)直腸癌、頭頸癌、肺癌中均發(fā)現(xiàn)EGFR的過渡表達(dá)。EGFR是一種跨膜糖蛋白，分子量約為170KD，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)3部分組分：胞外區(qū)由氨基端的621個氨基酸構(gòu)成，是配體結(jié)合區(qū)；跨膜區(qū)是由23個氨基酸殘基螺旋構(gòu)成的疏水區(qū)；胞內(nèi)區(qū)含有保守的酪氨酸激酶磷酸化位點。EGFR的信號傳導(dǎo)途徑是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，在腫瘤細(xì)胞的增值、損失修復(fù)、侵襲及新生血管形成等方面起著重要作用。大量研究證明，EGFR可以作為腫瘤治療的一個有效靶點。

靶向EGFR的藥物主要有兩類：一類是作用于受體胞內(nèi)區(qū)的小分子酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼、厄洛替尼等；另一類是作用于受體胞外區(qū)的單克隆抗體，如西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗等。

分離純化工藝的開發(fā)是抗體藥物開發(fā)的核心，是決定產(chǎn)品的安全、有效、收率和成本的技術(shù)基礎(chǔ)。

然而，目前的重組抗人-EGFR單克隆抗體的分離純化方法，仍有待改進(jìn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

目前文獻(xiàn)報道的制備重組抗人-EGFR單克隆抗體的方法主要集中在上游方面，關(guān)于下游分離純化工藝報道的較少，并且目前的重組抗人-EGFR單克隆抗體的純化工藝，是將細(xì)胞上清液依次經(jīng)過親和層析、低pH值滅活病毒、陰離子交換層析、除病毒過濾、切向流膜包洗濾更換緩沖液、陽離子交換層析、切向流膜包洗濾更換緩沖液及超濾濃縮、無菌過濾等步驟實現(xiàn)，該工藝存在所得產(chǎn)品的內(nèi)毒素不合格的風(fēng)險，且陽離子交換層析純化步驟前后均需要用切向流膜包洗濾更換緩沖液，過程較繁瑣，在工業(yè)生產(chǎn)中延長了時間和增加了成本。

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種在重組抗人-EGFR單克隆抗體制備工藝中，高效分離純化制備的重組抗人-EGFR單克隆抗體的手段。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種分離純化單克隆抗體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟：將包含單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行Protein A親和層析，以便獲得第一洗脫組分；將所述第一洗脫組分保持特定pH值狀態(tài)下室溫放置特定時間，以便獲得經(jīng)過低pH值滅活病毒處理的第一洗脫組分；將經(jīng)過低pH值滅活病毒處理的第一洗脫組分中和后進(jìn)行陽離子交換層析，以便獲得第二洗脫組分；將所述第二洗脫組分稀釋后進(jìn)行陰離子交換層析，以便獲得流穿；利用除病毒過濾器，將所述流穿進(jìn)行過濾，以便獲得濾液；以及將所述濾液依次進(jìn)行超濾濃縮和洗濾更換緩沖液，以便得到所述單克隆抗體的原液。

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的分離純化單克隆抗體的方法簡單易行，所得產(chǎn)品內(nèi)毒素含量及其它各項質(zhì)量指標(biāo)均符合單克隆抗體藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。具體地，本發(fā)明的方法創(chuàng)造性地將陰離子交換層析步驟置于陽離子交換層析步驟之后，由此，既能通過陰離子交換層析有效去除內(nèi)毒素，使得內(nèi)毒素更容易控制，而且經(jīng)過陽離子交換層析獲得的第二洗脫組分通過簡單的稀釋即可直接上樣于陰離子層析柱，省去了切向流膜包洗濾更換緩沖液步驟，節(jié)省了時間和成本。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的分離純化單克隆抗體的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述單克隆抗體為選自重組抗人-EGFR單克隆抗體、重組抗人TNF-α單克隆抗體、重組抗人CD-20單克隆抗體、重組抗人HER-2單克隆抗體和重組抗人-VEGF單克隆抗體的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述Protein A親和層析進(jìn)一步包括：將所述包含單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液上樣于平衡后的protein A親和層析柱中，然后依次進(jìn)行緩沖液A洗滌、緩沖液B沖洗、緩沖液A洗滌和緩沖液C洗脫，以便得到所述第一洗脫組分，其中，緩沖液A為含100-200mM NaCl的磷酸鹽緩沖液，緩沖液B為含0.5-1.5M NaCl的磷酸鹽緩沖液，緩沖液C為醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或甘氨酸鹽緩沖液。由此，捕獲純化效率高。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述緩沖液A包含20mM磷酸鹽緩沖液和100-200mM NaCl，pH值為7.0-7.5；所述緩沖液B包含20mM磷酸鹽緩沖液和0.5-1.5M NaCl，pH值為5.5-7.0；所述緩沖液C為0.05-0.15M的醋酸鹽緩沖液或甘氨酸鹽緩沖液，pH值為3.0-3.5。由此，洗脫效果好。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，Protein A親和層析所采用的層析填料不受特別限制，只要能夠有效捕獲目標(biāo)抗體，實現(xiàn)純化的目的即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，可以利用選自Mabselect SuRe、Mabselect SuRe LX、ProSep Ultra Plus和POROS MabCapture A層析填料的至少一種進(jìn)行所述Protein A親和層析。由此，純化效果好，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將所述第一洗脫組分保持pH值為3.2-3.7狀態(tài)下室溫放置0.5-4 小時。由此，可以有效滅活病毒。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述陽離子交換層析進(jìn)一步包括：將所述經(jīng)過低pH值滅活病毒處理的第一洗脫組分進(jìn)行中和，然后上樣于平衡后的陽離子交換層析柱中，再依次進(jìn)行緩沖液D洗滌和緩沖液E洗脫，以便得到所述第二洗脫組分，其中，所述緩沖液D包含20mM磷酸鹽緩沖液和0-50mM NaCl、pH值為5.8-6.4，緩沖液E包含20mM磷酸鹽緩沖液和100-200mM NaCl、pH值為5.8-6.4。由此，純化效果好，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將所述經(jīng)過低pH值滅活病毒處理的第一洗脫組分中和至pH值為5.0-5.8后進(jìn)行所述陽離子交換層析。由此，可將單克隆抗體有效的結(jié)合于陽離子交換層析柱上。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用pH值為7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，將所述經(jīng)過低pH值滅活病毒處理的第一洗脫組分進(jìn)行中和。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述陽離子交換層析采用的層析填料不受特別限制，只要能夠有效實現(xiàn)純化目標(biāo)抗體的目的即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，利用選自Capto SP ImpRes、POROS XS和Eshmuno CPX層析填料的至少一種進(jìn)行所述陽離子交換層析。由此，純化效果好。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述陰離子交換層析進(jìn)一步包括：將所述第二洗脫組分稀釋后上樣于平衡后的陰離子交換層析柱中，收集流穿。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用pH值為6.0-7.0的15-25mM的磷酸鹽緩沖液，將所述第二洗脫組分進(jìn)行2-5倍稀釋。由此可以降低第二洗脫組分的鹽濃度并使其pH值與陰離子交換層析所使用的平衡緩沖液pH值相近，有利于目標(biāo)抗體流穿，而內(nèi)毒素、宿主DNA、宿主蛋白等雜質(zhì)結(jié)合與陰離子交換層析填料，實現(xiàn)有效純化目標(biāo)抗體。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述陰離子交換層析采用的層析填料不受特別限制，只要能夠有效實現(xiàn)純化目標(biāo)抗體的目的即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，利用選自Capto Q、POROS XQ和Eshmuno Q層析填料的至少一種進(jìn)行所述陰離子交換層析。由此，純化效果好。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述除病毒過濾器的處理量為200-800L/m²。由此，能夠有效過濾去除病毒。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將所述濾液超濾濃縮4-8倍。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，進(jìn)一步包括，利用除菌過濾器將所述單克隆抗體的原液進(jìn)行無菌過濾。

由此，本發(fā)明所帶來的有益效果為：

(1)所得產(chǎn)品的純度和活性合格，且雜質(zhì)如內(nèi)毒素、宿主DNA、宿主蛋白、protein A等殘留量易于控制；

(2)純化方法簡單可行，易于放大，且產(chǎn)品收率高。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了實施例1中，Mabselect SuRe親和層析純化色譜圖；

圖2顯示了實施例1中，Capto SP ImpRes層析純化色譜圖；

圖3顯示了實施例1中，Capto Q層析純化色譜圖；

圖4顯示了實施例1中所得重組抗人-EGFR單克隆抗體原液純度的SEC-HPLC色譜圖；

圖5顯示了實施例1中所得重組抗人-EGFR單克隆抗體原液的還原性SDS-PAGE電泳圖，

其中：泳道1為對照品；泳道2為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量marker；泳道3、4、5均為實施例1重組抗人-EGFR單克隆抗體原液樣品；以及

圖6顯示了實施例1中所得重組抗人-EGFR單克隆抗體原液的非還原性SDS-PAGE電泳圖，

其中：泳道1為對照品；泳道2、3、4均為實施例1重組抗人-EGFR單克隆抗體原液樣品；泳道5為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量marker。

具體實施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

需要說明的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。

在下列實施例中所使用的術(shù)語“PB”是指磷酸鹽緩沖液。

實施例1：

將150L發(fā)酵罐收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清液分三份，分三次用Mabselect SuRe層析柱進(jìn)行第一步的純化，第一次上樣40L于平衡后的Mabselect SuRe層析柱(BPG200/50)中，上樣結(jié)束后，用緩沖液A(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 7.2)淋洗層析柱，再依次用緩沖液B(包含20mM PB、1M NaCl、pH 6.5)和緩沖液A(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 7.2)沖洗層析柱，然后用緩沖液C(即0.1M NaAC-HAc、pH 3.4)洗脫，收集洗脫組分；重復(fù)此純化步驟兩次，純化過程色譜圖見圖1；將每次收集的洗脫組分(pH 3.7，稱為“洗脫組分I”)室溫放置2小時，然后用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋中和至pH 5.2；合并三次稀釋中和后的洗脫組分I，然后分成兩份，分兩次進(jìn)行Capto SP ImpRes層析純化，將其中一份上樣于平衡后的Capto SP ImpRes層析柱(BPG200/50)中，上樣結(jié)束后，用緩沖液D(20mM PB，pH 6.0)沖洗層析柱，然后用緩沖液E(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 6.0)洗脫，收集洗脫組分，再重復(fù)此純化步驟一次，合并兩次的洗脫組分稱為洗脫組分II，此純化過程色 譜圖見圖2；將洗脫組分II用20mM PB(pH 6.5)5倍稀釋，然后上樣于平衡后的Capto Q層析柱(BPG140/50)中，收集流穿約100L，此純化過程色譜圖見圖3；將Capto Q流穿用有效過濾面積為0.2m²的除病毒過濾器過濾，收集濾液；將除病毒過濾后的濾液用30KD切向流膜包超濾濃縮8倍后再洗濾換液，保持跨膜壓為10psi；然后用0.22μm除菌過濾器無菌過濾得到重組抗人-EGFR單克隆抗體原液。

實施例2：

將7.5L發(fā)酵罐收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清液上樣于平衡后的Mabselect SuRe LX層析柱(XK50/30)中，上樣結(jié)束后，用緩沖液A(包含20mM PB、120mM NaCl、pH 7.5)淋洗層析柱，再依次用緩沖液B(包含20mM PB、1M NaCl、pH 7.0)和緩沖液A(包含20mM PB、120mM NaCl、pH 7.5)沖洗層析柱，然后用緩沖液C(即0.1M glycine、pH 3.2)洗脫，收集洗脫組分，稱為洗脫組分I；將洗脫組分I(pH 3.5)室溫放置1小時，然后用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋中和(至pH 5.5)，上樣于平衡后的POROS XS層析柱(XK50/20)中，上樣結(jié)束后，用緩沖液D(20mM PB，pH 6.2)沖洗層析柱，然后用緩沖液E(20mM PB、100mM NaCl、pH 6.2)洗脫，收集洗脫組分，稱為洗脫組分II；將洗脫組分II用20mM PB(pH 6.2)2倍稀釋，然后上樣于平衡后的POROS XQ層析柱(XK26/20)中，收集流穿約2L；將POROS XQ流穿用有效過濾面積為0.01m²的除病毒過濾器過濾，收集濾液；將除病毒過濾后的濾液用30KD切向流膜包超濾濃縮4倍后再洗濾換液，保持跨膜壓為10psi；然后用0.22μm除菌過濾器無菌過濾得到重組抗人-EGFR單克隆抗體原液。

實施例3：

將7.5L發(fā)酵罐收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清液上樣于平衡后的ProSep Ultra Plus層析柱中，上樣結(jié)束后，用緩沖液A(包含20mM PB、180mM NaCl、pH 7.0)淋洗層析柱，再依次用緩沖液B(包含20mM PB、1.5M NaCl、pH 6.0)和緩沖液A(包含20mM PB、180mM NaCl、pH 7.0)沖洗層析柱，然后用緩沖液C(即0.1M glycine、pH 3.0)洗脫，收集洗脫組分，稱為洗脫組分I；將洗脫組分I(pH 3.2)室溫放置0.5小時，然后用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液稀釋中和至pH5.8，上樣于平衡后的Eshmuno CPX層析柱中，上樣結(jié)束后，用緩沖液D(20mM PB、50mM NaCl、pH 5.8)沖洗層析柱，然后用緩沖液E(20mM PB、200mM NaCl、pH 5.8)洗脫，收集洗脫組分，稱為洗脫組分II；將洗脫組分II用20mM PB(pH 7.0)4倍稀釋，然后上樣于平衡后的Eshmuno Q層析柱中，收集流穿約3L；將Eshmuno CPX流穿用有效過濾面積為0.01m²的除病毒過濾器過濾，收集濾液；將除病毒過濾后的濾液用30KD切向流膜包超濾濃縮6倍后再洗濾換液，保持跨膜壓為10psi；然后用0.22μm除菌過濾器無菌過濾得到重組抗人-EGFR單克隆抗體原液。

實施例4：

將7.5L發(fā)酵罐收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清液上樣于平衡后的POROS MabCapture A層析柱中， 上樣結(jié)束后，用緩沖液A(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 7.0)淋洗層析柱，再依次用緩沖液B(包含20mM PB、0.5M NaCl、pH 5.5)和緩沖液A(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 7.0)沖洗層析柱，然后用緩沖液C(即0.15M NaAC-HAc、pH 3.5)洗脫，收集洗脫組分，稱為洗脫組分I；將洗脫組分I(pH 3.7)室溫放置4小時，然后用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋中和至pH5.0，上樣于平衡后的POROS XS層析柱中，上樣結(jié)束后，用緩沖液D(20mM PB、10mM NaCl、pH 6.4)沖洗層析柱，然后用緩沖液E(20mM PB、150mM NaCl、pH 6.4)洗脫，收集洗脫組分，稱為洗脫組分II；將洗脫組分II用20mM PB(pH 6.4)3倍稀釋，然后上樣于平衡后的POROS XQ層析柱中，收集流穿約2.4L；將POROS XQ流穿用有效過濾面積為0.01m²的除病毒過濾器過濾，收集濾液；將除病毒過濾后的濾液用30KD切向流膜包超濾濃縮6倍后再洗濾換液，保持跨膜壓為10psi；然后用0.22μm除菌過濾器無菌過濾得到重組抗人-EGFR單克隆抗體原液。

實施例5：

將實施例1-實施例4中的重組抗人-EGFR單克隆抗體原液，分別進(jìn)行蛋白含量、生物學(xué)活性、結(jié)合活性、還原性SDS-PAGE、SEC-HPLC純度、宿主DNA殘留量、宿主蛋白殘留量、蛋白A殘留量和內(nèi)毒素含量的檢測，結(jié)果如下表和圖4-圖6所示。

其中，圖4是測定本發(fā)明實施例1中所得重組抗人-EGFR單克隆抗體原液純度的SEC-HPLC色譜圖。圖5為實施例1重組抗人-EGFR單克隆抗體原液樣品的還原性SDS-PAGE電泳圖，其中：泳道1為對照品，泳道2為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量marker，泳道3、4、5均為實施例1重組抗人-EGFR單克隆抗體原液樣品。圖6為實施例1重組抗人-EGFR單克隆抗體原液樣品的非還原性SDS-PAGE電泳圖，其中：泳道1為對照品；泳道2、3、4均為實施例1重組抗人-EGFR單克隆抗體原液樣品；泳道5為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量marker。

由上述結(jié)果可知，實施例1-4獲得的產(chǎn)品純度和活性合格，且雜質(zhì)含量如內(nèi)毒素含量、宿主DNA殘留量、宿主蛋白殘留量、protein A殘留量等其它各項質(zhì)量指標(biāo)均符合單克隆抗體藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。且該方法簡單易行，易于放大，同時所得產(chǎn)品收率高。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。