本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，具體涉及一種含鹵代丙烯酰胺側(cè)鏈的嘧啶衍生物、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是原癌基因HER1的表達(dá)產(chǎn)物，具有配體誘導(dǎo)的酪氨酸蛋白激酶活性。原癌基因的激活即基因變異是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因之一。EGFR在細(xì)胞周期中起重要作用，與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移有關(guān)。研究表明，超過(guò)60％的惡性腫瘤科出現(xiàn)一種或幾種EGFR家族受體過(guò)表達(dá)或突變。盡管在過(guò)去的時(shí)間里，EGFR抑制劑在腫瘤治療中得到了快速發(fā)展，但仍留有大量的研究空間，靶點(diǎn)的突變所導(dǎo)致的治療抗藥性對(duì)靶向抗腫瘤藥物的研究提出了新的挑戰(zhàn)，不可逆抑制劑(包括Afatinib、Dacomitinib、Neratinib等)可與EGFR酪氨酸激酶以共價(jià)鍵結(jié)合，可以對(duì)抗T790M突變，克服了T790M引起的耐藥。其中，近FDA已批準(zhǔn)勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)開(kāi)發(fā)的afatinib片以商品名Gilotrif上市，作為一種口服的、新的一線(xiàn)治療藥物，證實(shí)可以用于腫瘤表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)19號(hào)外顯子缺失或21號(hào)外顯子突變(L858R)的轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的治療。Afatinib是首個(gè)不可逆ErbB家族阻斷劑，該藥積極的臨床證據(jù)，加上全新的作用模式，使其成為一種杰出的治療選擇，有望為肺癌患者提供其急需的臨床需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種含鹵代丙烯酰胺側(cè)鏈的嘧啶類(lèi)衍生物，具有以下結(jié)構(gòu)通式I：

其中：

R₁為鹵素、甲基、甲氧基、三氟甲基和含氮雜環(huán)。

R₂為甲基或乙?；?/p>

R₃為氫、鹵素或者三氟甲基。

X為氧原子或者氨原子。

Y為三氟甲基，鹵素原子。

本發(fā)明所述的一種含鹵代丙烯酰胺嘧啶衍生物為如下任一化合物：

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例1)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例2)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-苯基丙烯酰胺(實(shí)施例3)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(實(shí)施例4)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例5)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(實(shí)施例6)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例7)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例8)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例9)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例10)；

N-[3-[[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例11)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(實(shí)施例12)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例13)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-氟苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例14)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例15)；

N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例16)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例17)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(實(shí)施例18)；

N-[3-[[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例19)；

N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例20)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例21)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例22)；

N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(實(shí)施例23)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例24)；

N-[3-[[2-[[5-(4-乙?；?1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例25)；

N-[3-[[2-[[5-(4-乙酰基-1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例26)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例27)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(實(shí)施例28)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例29)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例30)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例31)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(實(shí)施例32)；

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的一種含鹵代丙烯酰胺側(cè)鏈的嘧啶衍生物的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：

以2，5-二氯嘧啶a為起始原料，和(3-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯(或者是(3-羥基苯基)氨基叔丁酯)b在正丁醇中反應(yīng)生成中間體c，中間體c在稀鹽酸作用下在正丁醇中回流得到5-位取代的中間體d，中間體d結(jié)構(gòu)中的叔丁基保護(hù)基在三氟乙酸作用下，脫保護(hù)得到游離氨基結(jié)構(gòu)的中間體e，最后與各種鹵素取代的丙烯酰氯縮合反應(yīng)得到目標(biāo)化合物I；反應(yīng)式為：

其中取代基的定義同上通式I化合物所述，反應(yīng)條件：i)二異丙基乙胺，正丁醇，室溫；ii)稀鹽酸，正丁醇，回流；iii)三氟乙酸，二氯甲烷，冰??；iv)含鹵素丙烯酰氯，三乙胺，二氯甲烷，冰浴到室溫。

本發(fā)明所涉及的原料或中間體，可直接購(gòu)買(mǎi)，或按照實(shí)施例中提及的文獻(xiàn)方法制備。

本發(fā)明制備方法中所述的式I化合物，可以使用上面所描述的方法來(lái)制備本發(fā)明的化合物，將理解的是當(dāng)給出典型的或優(yōu)選的工藝操作條件(即反應(yīng)溫度、時(shí)間、反應(yīng)物的摩爾比、溶劑、壓力等等)，還可以使用其他工藝操作條件，除非另有說(shuō)明。最佳反應(yīng)條件可以隨所用的具體反應(yīng)物或溶劑而變化，但這些條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)最佳化過(guò)程加以確定。通常，可以使用如上所述的反應(yīng)路線(xiàn)及工藝制備本發(fā)明化合物，但并不限于反應(yīng)條件中的試劑和溶劑。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的含鹵代丙烯酰胺嘧啶衍生物在制備抗腫瘤細(xì)胞和靶向EGFR激酶藥物中的應(yīng)用，所述腫瘤細(xì)胞是指過(guò)表達(dá)EGFR的人表皮癌細(xì)胞株A431、對(duì)Gefitinib耐藥的人肺腺癌細(xì)胞株H1975和低表達(dá)EGFR人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620，所述EGFR激酶是指野生型EGFR激酶和[L858R/T790M]突變的EGFR激酶。

本發(fā)明提供了一類(lèi)全新的含鹵代丙烯酰胺嘧啶衍生物，其中含鹵素的丙烯酰胺側(cè)鏈可作為新型的不可逆共價(jià)反應(yīng)官能團(tuán)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，其在分子水平上對(duì)野生型和[L858R/T790M]突變的EGFR酪氨酸激酶具有較佳的抑制作用，且對(duì)[L858R/T790M]突變的EGFR激酶選擇性高，在細(xì)胞水平上對(duì)與EGFR酪氨酸激酶活性相關(guān)的腫瘤細(xì)胞也具有顯著的增殖抑制作用，對(duì)低表達(dá)EGFR人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620的抑制活性較弱，可制備相應(yīng)的抗腫瘤藥物，為設(shè)計(jì)新型克服Gefitinib耐藥的EGFR抑制劑提供可能。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。

實(shí)施例1 N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺；

步驟1：3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基苯的制備

原料1:3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯按照文獻(xiàn)Cancer Discov.2013,12,1404-1415的方法制備；

將3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯(537mg，1mmol)溶于二氯甲烷(2ml)中，隨后滴加三氟乙酸(2ml)，反應(yīng)過(guò)夜。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液減壓旋蒸得到棕紅色黏液，隨后滴加乙醚(5ml)，溶液中析出固體，抽濾得到黃色固體(400mg)，粗產(chǎn)品收率為95％，該產(chǎn)物直接進(jìn)行下步反應(yīng)。

步驟2：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺的制備

將上一步得到的產(chǎn)物(400mg)溶解在二氯甲烷(5mL)中，冷至0℃-2℃滴入2-氯丙烯酰氯(124mg，1mmol)，隨后滴加三乙胺(235ul，4mmol)，繼續(xù)低溫反應(yīng)過(guò)夜。待反應(yīng)完全，加入水，用二氯甲烷萃取，取有機(jī)層減壓旋蒸，柱層析色譜純化(流動(dòng)相為CH₂Cl₂:MeOH＝100：1)，回收、干燥即得白色固體產(chǎn)物130mg，產(chǎn)率為28.8％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.34(s,1H),8.05(d,J＝13.0Hz,2H),7.43(d,J＝8.8Hz,2H),7.33(d,J＝5.3Hz,2H),7.14(s,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,2H),6.73(d,J＝1.0Hz,1H),5.92(s,1H),3.79–3.74(m,2H),3.64–3.59(m,2H),3.14-3.05(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H+)：562.1521。

按照實(shí)施例1相同方法，采用不同原料，制備以下化合物。

實(shí)施例2：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將步驟2中的2-氯丙烯酰氯換成2-氟丙烯酰氯反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體，¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.07(d,J＝20.1Hz,2H),7.95(s,1H),7.43-7.40(m,3H),7.35–7.32(m,2H),7.07(d,J＝33.0Hz,2H),6.87(d,J＝7.9Hz,2H),5.84(d,J＝48.4Hz,1H),5.27(d,J＝14.8Hz,1H),3.77-3.61(m,4H),3.10-3.08(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):510.1829。

實(shí)施例3：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-苯基丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將步驟2中的2-氯丙烯酰氯換成2-苯基丙烯酰氯反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.28(s,1H),9.11(s,1H),8.89(s,1H),8.09(s,1H),7.97(s,1H),7.48-7.47(m,5H),7.37-7.35(m 5H),6.76(d,J＝6.9Hz,2H),5.95(s,1H),5.73(s,1H),3.52(m,4H),2.98-2.92(m,4H),2.02(s,3H).ESI(M+H⁺):568.2236。

實(shí)施例4：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將步驟2中的2-氯丙烯酰氯換成2-三氟甲基丙烯酰氯反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ9.17(s,1H),8.91(s,1H),8.17(s,1H),7.58(d,J＝8.8Hz,1H),7.51(d,J＝8.9Hz,2H),7.28(s,1H),7.06(d,J＝7.9Hz,1H),6.92–6.82(m,3H),3.60–3.55(m,4H),3.09–3.02(m,2H),3.03–2.96(m,2H),2.04(s,3H).ESI(M+H⁺):560.1781。

實(shí)施例5：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例3的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.11(d,J＝8.8Hz,1H),8.07(s,1H),8.04–7.94(m,2H),7.46-7.43(t,,2H),7.39–7.34(m,2H),7.10(s,1H),6.54(d,J＝2.3Hz,1H),6.42(d,J＝8.7Hz,1H),5.90-5.79(m,1H),5.30-5.24(m,1H),3.88(s,3H),3.80–3.76(m,2H),3.65–3.60(m,2H),3.12–3.06(m,4H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):540.1928。

實(shí)施例6：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

參照實(shí)施例5的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.11(d,J＝8.8Hz,1H),8.07(s,1H),7.75(s,1H),7.46(d,J＝8.1Hz,1H),7.38(d,J＝7.4Hz,2H),7.36-7.34(m,3H),7.36-7.34(m,1H),7.20(d,J＝7.6Hz,1H),7.09(s,1H),6.52(d,J＝2.3Hz,1H),3.85(s,3H),3.78-3.76(m,2H),3.62-3.60(m,2H),3.08-3.05(m,4H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):590.1890。

實(shí)施例7：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.36(s,1H),8.12(d,J＝8.7Hz,1H),8.06(s,1H),8.01(d,J＝11.8Hz,1H),7.46(d,J＝7.8Hz,1H),7.42(d,J＝7.7Hz,2H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),7.11(s,1H),6.74(d,J＝1.3Hz,1H),6.53(d,J＝2.1Hz,1H),6.42(d,J＝8.6Hz,1H),5.93(d,J＝1.3Hz,1H),3.88(s,3H),3.79–3.76(m,2H),3.64–3.61(m,2H),3.13–3.06(m,4H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):566.1632。

實(shí)施例8：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例3的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.21(d,J＝6.4Hz,1H),9.67(s,1H),8.53(s,1H),8.32(s,1H),7.78(s,1H),7.41(d,J＝7.2Hz,1H),7.33(d,J＝6.9Hz,2H),7.24(d,J＝6.9Hz,1H),7.05(s,1H),6.93(d,J＝8.3Hz,2H),5.71(dd,J＝47.5,2.8Hz,1H),5.43(dd,J＝15.3,3.1Hz,1H),3.60(s,4H),3.11(d,J＝35.4Hz,4H),2.06(s,3H).ESI(M+H+)：544.2081.

實(shí)施例9：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺。

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.40(s,1H),8.14(s,1H),8.08(s,1H),7.62-7.58(m,1H),7.44(d,J＝8.7Hz,1H),7.37(t,1H),7.13(s,1H),7.08(s,1H),7.02(d,J＝8.5Hz,1H),6.85-6.81(m,1H),6.74(d,J＝1.2Hz,1H),5.93(d,J＝1.2Hz,1H),3.80–3.77(m,2H),3.64–3.61(m,2H),3.03–2.97(m,4H),2.14(s,3H),1.65(s,3H).ESI(M+H+):590.1990。

實(shí)施例10：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例3的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.31(s,1H),9.44(s,1H),8.38(s,1H),7.86(s,1H),7.37(m,2H),7.14(m,3H),5.68(d,J＝47.5Hz,1H),5.54–5.43(m,2H),5.33(d,J＝14.1Hz,1H),3.60(s,4H),2.97(d,J＝31.6Hz,4H),2.05(s,3H).ESI(M+H⁺):544.1429。

實(shí)施例11：N-[3-[[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例3的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.23(s,1H),8.02(s,1H),7.63(d,J＝7.0Hz,2H),7.51(s,1H),7.46(t,J＝8.1Hz,2H),7.05(d,J＝7.5Hz,1H),6.45(s,1H),6.20(s,1H),5.88-5.78(m,1H),5.31–5.23(m,1H),3.81(s,3H),3.11(m,4H),2.58(m,4H),2.36(s,3H).ESI(M+H⁺):513.1819。

實(shí)施例12：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

參照實(shí)施例5的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.30(s,1H),8.04(s,1H),7.85(s,1H),7.60(s,1H),7.45(t,1H),7.37(s,2H),6.87(s,1H),6.58(s,1H),6.49(s,1H),6.34(s,1H),3.86(s,3H),3.75(s,2H),3.61(s,2H),3.07(d,J＝17.2Hz,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):624.6266。

實(shí)施例13：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例3的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.25(s,1H),8.03(d,J＝4.5Hz,1H),7.66(d,J＝7.4Hz,2H),7.49-7.45(m,3H),7.06-7.04(m,1H),6.46(d,J＝1.9Hz,1H),6.19(s,1H),5.88-5.78(m,1H),5.29-5.25(m,1H),3.83(s,3H),3.78–3.73(m,2H),3.64–3.58(m,2H),3.10–2.97(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):541.1763。

實(shí)施例14：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氟苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例3的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-3-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.15(s,1H),8.10–8.01(m,2H),7.58(d,J＝14.5Hz,1H),7.44–7.33(m,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),7.18(s,1H),7.13(s,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),6.83(t,1H),5.89-5.79(m,1H),5.28-5.25(m,1H),3.78(m,2H),3.62(m,2H),3.01-2.97(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):528.1725。

實(shí)施例15：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.36(s,1H),8.06(s,2H),7.52(d,J＝7.9Hz,1H),7.36–7.32(m,3H),7.28(s,1H),7.12(s,1H),6.99(s,1H),6.91(d,J＝8.4Hz,1H),6.74(d,J＝1.2Hz,1H),5.93(d,J＝1.2Hz,1H),3.75-3.71(m,2H),3.61–3.57(m,2H),2.87–2.80(m,4H),2.27(s,3H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):540.1682。

實(shí)施例16：N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例3的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.53(s,1H),8.54(d,J＝8.0Hz,1H),8.51(d,J＝2.4Hz,1H),8.36(s,1H),8.29(s,1H),7.71-7.69(m,1H),7.39(d,J＝8.1Hz,1H),7.33(t,1H),7.24(d,J＝7.5Hz,1H),7.22-7.20(m,2H),5.86-5.76(m,1H),5.26-5.23(m,1H),3.90(s,3H),2.67(s,6H).ESI(M+H⁺):465.1605。

實(shí)施例17：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例3的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.08(d,J＝9.8Hz,2H),7.95(s,1H),7.49(d,J＝7.3Hz,1H),7.35-7.30(m,4H),7.11(s,1H),6.96(s,1H),6.94–6.87(m,1H),5.90-5.80(m,1H),5.30-5.26(m,1H),3.75–3.72(m,2H),3.62–3.56(m,2H),2.88–2.79(m,4H),2.28(s,3H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):524.1978。

實(shí)施例18：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

參照實(shí)施例5的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成換成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.08(s,1H),7.88(s,1H),7.45(d,J＝8.1Hz,1H),7.37(d,J＝2.4Hz,1H),7.33(t,1H),7.30-7.28(m 1H),7.11(s,1H),7.02(d,J＝7.8Hz,1H),6.98(s,1H),6.92(d,J＝8.6Hz,1H),3.75(t,2H),3.60(t,2H),2.88–2.82(m,4H),2.27(s,3H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):547.1962。

實(shí)施例19：N-[3-[[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.43(s,1H),8.23(s,1H),7.63(d,J＝7.8Hz,1H),7.53(t,1H),7.46(t,2H),7.06-7.04(m,1H),6.73(d,J＝1.3Hz,1H),6.45(d,J＝2.3Hz,1H),6.21(s,1H),5.92(d,J＝1.4Hz,1H),3.82(s,3H),3.15–3.04(m,4H),2.61–2.54(m,4H),2.37(s,3H).ESI(M+H⁺):529.1519。

實(shí)施例20：N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例20的方法，只是將原料2-氟丙烯酰氯換成2-氯丙烯酰氯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ10.01(s,1H),8.55(d,J＝8.0Hz,1H),8.50(d,J＝2.5Hz,1H),8.37(s,1H),8.28(s,1H),7.71-7.69(m,1H),7.38(d,J＝8.1Hz,1H),7.36–7.30(m,1H),7.26(s,1H),7.24(d,J＝7.1Hz,1H),7.20(d,J＝8.7Hz,1H),6.71(d,J＝1.3Hz,1H),5.91(d,J＝1.3Hz,1H),3.89(s,3H),2.69(s,6H).ESI(M+H⁺):481.1311。

實(shí)施例21：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.47(s,1H),8.24(s,1H),7.66(d,J＝7.6Hz,1H),7.51-7.45(m,3H),7.06-7.04(m,1H),6.72(d,J＝1.4Hz,1H),6.46(d,J＝2.2Hz,1H),6.20(s,1H),5.93(d,J＝1.3Hz,1H),3.83(s 3H),3.79–3.72(m,2H),3.63–3.57(m,2H),3.10–2.98(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):557.1467。

實(shí)施例22：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.38(s,1H),8.12(s,1H),8.06(s,1H),7.60-7.56(m,1H),7.42(d,J＝8.7Hz,1H),7.35(t,1H),7.11(s,1H),7.06(s,1H),7.01-6.99(m,1H),6.81(t,1H),6.72(d,J＝1.2Hz,1H),5.91(d,J＝1.2Hz,1H),3.76(t,3H),3.61(t,3H),3.00–2.95(m,4H),2.12(s,3H).ESI(M+H⁺):544.1431。

實(shí)施例23：N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

參照實(shí)施例20的方法，只是將原料2-氟丙酰氯換成2-三氟甲基丙烯酰氯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ11.78(s,1H),8.69(d,J＝7.6Hz,1H),8.40(s,1H),8.24(s,1H),8.16(d,J＝8.8Hz,1H),7.40(d,J＝7.7Hz,1H),7.37-7.35(m,1H),7.34-7.33(m,1H),7.31-7.30(m,1H),7.19(d,J＝8.8Hz,1H),5.83(s,1H),3.91(s,3H),2.62(s,6H).ESI(M+H⁺):515.1572。

實(shí)施例24：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例15的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.31(s,1H),8.24(s,1H),7.81(s,1H),7.49(d,J＝3.0Hz,1H),7.40(d,J＝8.9Hz,2H),7.33(d,J＝8.9Hz,2H),7.22(t,1H),6.93–6.90(m,2H),6.78(s,1H),6.72(d,J＝1.3Hz,1H),5.91(d,J＝1.3Hz,1H),3.79–3.76(m,2H),3.65-3.63(m,2H),3.19-3.14(m,4H),2.16(s,3H).ESI(M+H⁺):560.1793。

實(shí)施例25：N-[3-[[2-[[5-(4-乙?；?1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[[2-[[5-(4-乙?；?1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.18(s,1H),9.14(s,1H),8.90(s,1H),8.27(s,1H),8.10(s,1H),7.92(s,1H),7.84(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),7.46(d,J＝7.4Hz,1H),7.35(d,J＝24.0Hz,1H),7.31(t,J＝8.0Hz,1H),6.66(d,J＝7.9Hz,1H),6.41(d,J＝2.5Hz,1H),6.10(d,J＝2.6Hz,1H),3.54-3.51(m,4H),3.41–3.38(m,2H),3.31(m,2H),2.04(s,3H).ESI(M+H⁺):527.1480。

實(shí)施例26：N-[3-[[2-[[5-(4-乙酰基-1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例29的方法，只是將原料2-氯丙烯酰氯換成2-氟丙烯酰氯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)，得到白色固體。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.27(d,J＝2.6Hz,1H),8.14(s,1H),8.04(s,1H),7.97(d,J＝2.5Hz,1H),7.82(dd,J＝9.0,2.7Hz,1H),7.38–7.28(m,3H),7.11(s,1H),6.89(s,1H),6.63(d,J＝9.0Hz,1H),5.84(dd,J＝47.8,3.4Hz,1H),5.27(dd,J＝15.2,3.4Hz,1H),3.78–3.72(m,2H),3.59-3.56(m,4H),3.47–3.40(m,2H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):511.1760。

實(shí)施例27：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。1H NMR(500MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),9.57(s,1H),9.01(s,1H),8.19(s,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.92(s,1H),7.82(s,1H),7.49(d,J＝6.5Hz,1H),7.40–7.32(m,2H),7.26(d,J＝8.3Hz,1H),6.41(d,J＝1.8Hz,1H),6.09(s,1H),3.51(m,4H),2.77–2.69(m,4H),2.04(s,3H).ESI(M+H⁺):594.1390。

實(shí)施例28：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

參照實(shí)施例31的方法，只是將原料2-氯丙酰氯換成并2-氟丙烯酰氯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.32(s,1H),9.57(s,1H),9.02(s,1H),8.19(s,1H),7.99(d,J＝11.7Hz,2H),7.81(s,1H),7.55(d,J＝6.3Hz,1H),7.34(d,J＝6.4Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,1H),5.69(dd,J＝47.6,3.0Hz,1H),5.42(dd,J＝15.4,3.0Hz,1H),3.51(m,4H),2.75-2.70(m,4H),2.04(s,3H).ESI(M+H⁺):578.1680。

實(shí)施例29：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.20(s,1H),9.41(s,1H),8.98(s,1H),8.16(s,1H),7.92(s,1H),7.74(s,1H),7.52(dd,J＝8.9,2.1Hz,2H),7.35(d,J＝4.8Hz,2H),6.91(d,J＝8.7Hz,1H),6.40(d,J＝2.2Hz,1H),6.08(d,J＝2.4Hz,1H),3.58–3.53(m,4H),2.88–2.83(m,2H),2.81–2.77(m,2H),2.03(s,3H).ESI(M+H⁺):560.1139。

實(shí)施例30：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-2-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.13(s,1H),8.82(s,1H),8.37(s,1H),8.06(s,1H),7.91(s,1H),7.48(d,J＝8.9Hz,1H),7.43(d,J＝7.7Hz,1H),7.34(d,J＝8.2Hz,1H),7.18(t,J＝8.1Hz,1H),7.01(d,J＝2.6Hz,1H),6.81(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.43(d,J＝2.5Hz,1H),6.10(d,J＝2.5Hz,1H),3.57-3.56(m,4H),3.15-3.06(m,4H),2.05(s,3H).ESI(M+H⁺):560.1143。

實(shí)施例31：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.38(s,1H),9.56(s,1H),8.42(s,1H),7.70(d,J＝7.9Hz,1H),7.62(d,J＝1.8Hz,1H),7.48(t,J＝8.2Hz,1H),7.25(s,2H),7.07(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.69(m,2H),6.43(d,J＝2.6Hz,1H),6.12(d,J＝2.6Hz,1H),3.56-3.53(m,4H),3.03–2.85(m,4H),2.03(s,3H).ESI(M+H⁺):527.1363。

實(shí)施例32：N-[3-[[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

參照實(shí)施例1的方法，只是將原料3-[2-[[4-(4-乙?；?1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯換成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮至干得到粗品，經(jīng)柱層析純化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固體。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.39(s,1H),9.96(s,1H),8.53(s,1H),7.73(s,1H),7.71–7.66(m,2H),7.65(t,J＝2.0Hz,1H),7.47(t,J＝8.1Hz,1H),7.22(d,J＝6.6Hz,1H),7.09–7.04(m,1H),6.43(d,J＝2.6Hz,1H),6.11(d,J＝2.6Hz,1H),3.51-3.50(m,4H),2.78–2.72(m,2H),2.69(t,J＝4.8Hz,2H),2.04(s,3H).ESI(M+H+):595.1250。

效果實(shí)施例1：本發(fā)明化合物對(duì)A431、H1975、SW620細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)定

本實(shí)施例用于測(cè)定本發(fā)明中所公開(kāi)的化合物對(duì)于野生型EGFR高表達(dá)人表皮癌細(xì)胞株A431，[L858R/T790M]EGFR點(diǎn)突變?nèi)朔蜗侔┘?xì)胞株H1975以及低表達(dá)EGFR人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620的增殖抑制活性，化合物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制活性用半數(shù)抑制濃度IC₅₀來(lái)表示。試驗(yàn)方案如下：野生型EGFR高表達(dá)人表皮癌細(xì)胞株A431，[L858R/T790M]EGFR點(diǎn)突變?nèi)朔蜗侔┘?xì)胞株H1975以及低表達(dá)EGFR人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620均購(gòu)于ATCC，以適宜的細(xì)胞濃度(A431：20000個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基；H1975：15000個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基，SW620:20000個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基)將細(xì)胞接種于白色不透明的384孔培養(yǎng)板上；之后將細(xì)胞放置于37℃，5％CO₂的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后，向培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入一系列濃度梯度的藥物，一般選擇10個(gè)濃度，之后將細(xì)胞放回原培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，之后按照MTT檢測(cè)方法，測(cè)定受試化合物對(duì)A431,H1975以及SW620細(xì)胞增殖的影響，并計(jì)算不同濃度的化合物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制活性，本發(fā)明受試化合物的IC₅₀數(shù)據(jù)如下表1。

表1

本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)上具有一定的新穎性，同時(shí)體外生物活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，本發(fā)明的化合物對(duì)過(guò)表達(dá)EGFR的人表皮癌細(xì)胞株A431、對(duì)Gefitinib耐藥的人肺腺癌細(xì)胞株H1975具有明顯的抑制增殖活性，低表達(dá)EGFR人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620的增殖抑制活性較弱。

效果實(shí)施例2：本發(fā)明化合物對(duì)EGFR^WT、EGFR^L858R/T790M酪氨酸激酶活性的抑制作用

酶活性測(cè)試采用Mobility shift assay方法進(jìn)行(Expert Opin Drug Discov.2008,3(6):607–621)。化合物稱(chēng)量后，配制成10mM的DMSO儲(chǔ)存液。試驗(yàn)前，根據(jù)所需濃度，取適量10mM的化合物儲(chǔ)存液，溶解于水中，配制成相應(yīng)濃度為最終濃度5倍的化合物工作液。并將反應(yīng)所需的各種激酶，EGFR^WT、EGFR^L858R/T790M溶解于濃度為所需濃度1.25倍的反應(yīng)緩沖液(62.5mM HEPES，pH7.5、0.001875％Brij-35、12.5mM MgCl2、2.5mM DTT)中，配制成濃度為最終濃度2.5倍的酶工作液。同時(shí)將反應(yīng)所需的ATP和FAM標(biāo)記的多肽底物也溶液于1.25X的反應(yīng)緩沖液中，配制成濃度為所需濃度2.5倍的底物和ATP工作液。之后向384孔檢測(cè)板中加入5μl化合物工作液，向空白對(duì)照(min)中加入5μl 250mM的EDTA，向陰性對(duì)照(Max)中加入不含藥物，但含相同體積的DMSO的工作液。同時(shí)加入10μl酶工作液，輕輕混勻后，室溫孵育10分鐘，之后向各反應(yīng)孔中加入10μl的底物和ATP工作液，將檢測(cè)板置于28度條件下孵育60分鐘，之后向各反應(yīng)孔中加入25μl的酶反應(yīng)中止液(100mM HEPES，pH7.5,、0.015％Brij-35、0.2％Coating Reagent#3,、50mM EDTA)，以中止酶反應(yīng)，之后將反應(yīng)板置于Caliper EZ reader中采集各反應(yīng)孔中的底物轉(zhuǎn)換率(底物被激酶磷酸化的比率)，并對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，化合物對(duì)激酶的抑制率計(jì)算按如下公式進(jìn)行：％inh＝(Max-conversion)/(Max-Min)×100，其中％inh為百分比抑制率，Max為陰性對(duì)照孔內(nèi)的底物轉(zhuǎn)換率，min為空白對(duì)照孔內(nèi)的底物轉(zhuǎn)換率，conversion為加入不同濃度化合物的各反應(yīng)孔內(nèi)的底物轉(zhuǎn)換率。將計(jì)算得到的各濃度化合物下的％inh導(dǎo)入Xlift中進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)IC₅₀，曲線(xiàn)擬合公式為：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*Hillslope))。表2為所得結(jié)果。

表2

本發(fā)明的化合物對(duì)EGFR^WT具有較好的抑制活性，特別是對(duì)EGFR^L858R/T790M的抑制活性?xún)?yōu)于EGFR^WT，說(shuō)明該類(lèi)化合物的選擇性較好。