本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種合江棘蛙皮膚抗菌肽及其編碼序列的基因及原核表達(dá)。

背景技術(shù)：

目前抗菌肽主要通過(guò)以下三種途徑獲得：從生物體中提取純化；化學(xué)合成；構(gòu)建抗菌肽基因工程菌株。其中，天然抗菌肽來(lái)源極為有限，且提取工藝較復(fù)雜，對(duì)技術(shù)和成本要求較高；化學(xué)合成成本也較高，且多用于研究，較難規(guī)模化生產(chǎn)。相比之下，基因工程技術(shù)成本低，回收效率高，可用于抗菌肽的大規(guī)模制備，為抗菌肽的開(kāi)發(fā)和利用提供了契機(jī)。

20世紀(jì)70年代初發(fā)展起來(lái)的基因工程技術(shù)，經(jīng)過(guò)40多年來(lái)的進(jìn)步與發(fā)展，已成為生物技術(shù)的核心內(nèi)容，通過(guò)基因重組技術(shù)，可以由微生物進(jìn)行生產(chǎn)，這是基因工程技術(shù)的最大貢獻(xiàn)。隨著重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)于克隆基因表達(dá)問(wèn)題的研究也日漸深入，外源基因表達(dá)系統(tǒng)的研究也日益深入，主要分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。

真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系，表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達(dá)蛋白的分離和純化工藝較復(fù)雜。而以大腸桿菌為代表的原核表達(dá)系統(tǒng)具有高效、方便操作等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。

原核表達(dá)系統(tǒng)主要是將已克隆入目的基因片段的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得所需要的目的蛋白。該系統(tǒng)最早被采用，是目前研究最清楚的表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，且所需成本相對(duì)較低，故為外源基因的首選表達(dá)系統(tǒng)。其中由于對(duì)大腸桿菌的背景了解甚多，構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)豐富，材料也多，因此將其作為首選的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水平高，表達(dá)產(chǎn)物不具有天然蛋白質(zhì)構(gòu)型，表達(dá)產(chǎn)物大都積聚在細(xì)菌的包涵體內(nèi)，要將細(xì)菌破碎提取后，分離純化，并經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)復(fù)性加工，成為具生物活性的產(chǎn)品。

目前已知的大腸桿菌表達(dá)載體有以下幾種：非融合型表達(dá)、融合型表達(dá)和分泌型表達(dá)。非融合型表達(dá)方式表達(dá)的非融合蛋白與天然蛋白狀態(tài)下存在的蛋白在結(jié)構(gòu)、功能以及免疫圓形等方面基本一致。融合表達(dá)載體通常將目的蛋白與某個(gè)或某些標(biāo)簽（如：FLAG-tag、His-tag等）合理融合之后進(jìn)行表達(dá)，簡(jiǎn)化了蛋白的分離純化工藝。蛋白分泌型表達(dá)可根據(jù)場(chǎng)所的不同分為周質(zhì)分泌表達(dá)和胞外分泌表達(dá)。

由于抗菌肽對(duì)宿主菌大腸桿菌具有毒性, 會(huì)反饋性地抑制宿主細(xì)胞的增殖，所以不能直接運(yùn)用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),從而影響抗菌膚的進(jìn)一步表達(dá)；并且抗菌肽對(duì)蛋白酶非常敏感,容易被大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的酶降解,難以實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)。目前采用融合表達(dá)的方式已完成多種抗菌肽在大腸桿菌中的表達(dá)，大腸桿菌的基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善，具有生長(zhǎng)快、成本低和表達(dá)量高，遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，是原核表達(dá)系統(tǒng)的代表, 應(yīng)用也最多。但抗菌肽對(duì)大腸桿菌有毒性，所以要選擇一種融合載體和抗菌肽融合表達(dá)，使抗菌肽完全以包涵體的形式表達(dá)，這有利于重組蛋白高水平表達(dá)并且獲得的重組蛋白相對(duì)較純，方便以后的純化操作。

雖然原核表達(dá)技術(shù)已十分成熟，且能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，但目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，致使蛋白后續(xù)處理相對(duì)困難，而真核系統(tǒng)由于具有翻譯后的加工修飾體系，也常常被用于外源蛋白的表達(dá)。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。

總之，酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖然成本低，蛋白表達(dá)水平高，但由于翻譯后加工修飾體系與哺乳動(dòng)物不完全相同；而哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)雖相對(duì)接近于天然狀態(tài)，但表達(dá)量低操作繁瑣，且相關(guān)文獻(xiàn)資料不如原核表達(dá)系統(tǒng)充分，相關(guān)技術(shù)研究不如原核表達(dá)體系深入。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)要求

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種合江棘蛙皮膚抗菌肽Cathelicidin PR1-2。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述蛋白的編碼序列。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述蛋白的原核表達(dá)。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：合江棘蛙皮膚抗菌肽Cathelicidin PR1-2，它是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列編碼的蛋白。

所述的合江棘蛙皮膚抗菌肽Cathelicidin PR1-2具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；該抗菌肽為直鏈多肽，含有54個(gè)氨基酸殘基，分子量為5990.1 Da，理論等電點(diǎn)為9.59。

合江棘蛙皮膚抗菌肽Cathelicidin PR1-2的編碼基因，它是下列核苷酸之一：

（1）序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

（2）編碼序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸。

抗菌肽Cathelicidin PR1-2的原核表達(dá)方法，將合江棘蛙皮膚抗菌肽Cathelicidin PR1和Cathelicidin PR2成熟區(qū)基因串聯(lián)后進(jìn)行原核表達(dá)。

合江棘蛙皮膚抗菌肽Cathelicidin PR1-2在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

有益效果

本發(fā)明克隆得到兩種合江棘蛙皮膚CATH家族抗菌肽Cathelicidin PR1和Cathelicidin PR2的編碼基因，將Cathelicidin PR1和Cathelicidin PR2的成熟區(qū)序列拼接得到Cathelicidin PR1-2，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了該融合蛋白。抑菌試驗(yàn)表明表達(dá)出的蛋白與化學(xué)合成的蛋白有相似的抑菌效果。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

本發(fā)明的實(shí)施例1：抗菌肽Cathelicidin PR1-2原核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)：

將合江棘蛙皮膚抗菌肽Cathelicidin PR1和Cathelicidin PR2成熟區(qū)基因序列拼接得到Cathelicidin PR1-2，在Cathelicidins PR1-2的成熟肽cDNA前后加入酶切位點(diǎn)KpnⅠ(GGTACC)和Hind Ⅲ(AAGCTT)以及甲酸切割位點(diǎn)（GACCCG）。Cathelicidins PR1-2基因合成，提供的基因模板在載體pUC 57s上。

設(shè)計(jì)引物：

PR1-2F-KpnI：CGGGGTACCGACCCGCGGAAGTGTAACTTG

M13-R：AGCGGATAACAATTTCACACAGG

1目的序列擴(kuò)增

以載體pUC 57s為模板，用PR1-2F-KpnI/M13-R、2×Super Pfu Master mix（杭州寶賽生物），PCR擴(kuò)增得到目的序列。PCR條件：94℃預(yù)變性5min，30次循環(huán)：94℃變性30s，55℃退火30s，68℃延伸10s，68℃延伸5min，10℃冷卻2min。擴(kuò)增體系如下：

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2雙酶切

將上一步所得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物快速純化試劑盒（杭州寶賽生物）回收后，用KpnI/HindIII(Takara)進(jìn)行雙酶切，同時(shí)pET-32a質(zhì)粒也用KpnI/HindIII(Takara)進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系如下：

將雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

3連接與轉(zhuǎn)化

酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收后，用T4 DNA連接酶連接。連接體系為：

4℃過(guò)夜連接。

將連接好的PR- pET-32a轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。

將制備好的感受態(tài)細(xì)胞DH5α置于冰上融化，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰上放置30min。42℃熱激60s，立即放入冰中2min，加入1000ul的LB培養(yǎng)基，然后放搖床150r/min振搖1h。然后室溫下，12000rpm，4-5min離心，棄掉500ul的上清，混勻后取200ul均勻涂布于含氨芐的LB（A⁺）固體培養(yǎng)基上，倒置放入培養(yǎng)箱中，過(guò)夜培養(yǎng)。

挑取單菌落用2×Taq PCR mix（杭州寶賽生物）、T7/T7ter通用引物進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

若插入片段無(wú)誤，將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3）中,挑取單克隆菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)，菌種保存于-80℃甘油中。將菌種接種于含氨芐的LB（A⁺）液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6-1.0。加入IPTG至終濃度為1.0mM，誘導(dǎo)表達(dá)4h。同時(shí)培養(yǎng)未用IPTG誘導(dǎo)的菌作為對(duì)照。然后，室溫下12000rpm,5min離心取菌體，用Tris HCl ,ph7.0重懸菌液，SDS-PAGE(15%)電泳檢測(cè)融合蛋白是否成功表達(dá)。將重懸菌液超聲破碎1min（工作3s,休息3s），4℃，12000rmp離心5min，收集上清液用于SDS-PAGE(15%)電泳檢測(cè)。

測(cè)序結(jié)果：

通過(guò)DNAstar軟件分析，編碼合江棘蛙皮膚抗菌肽Cathelicidins PR1-2的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No：1所示。

合江棘蛙皮膚抗菌肽Cathelicidins PR1-2基因核苷酸的序列表為：序列長(zhǎng)度為162個(gè)堿基，序列類型：核酸，鏈數(shù)：?jiǎn)捂?，拓?fù)鋵W(xué)：直鏈狀，序列種類：cDNA，來(lái)源： 原核表達(dá)。

實(shí)施例2：合江棘蛙抗菌肽Cathelicidins PR1-2藥理實(shí)驗(yàn)：

1、原核表達(dá)合江棘蛙抗菌肽Cathelicidins PR1-2抗菌活性檢測(cè)：

分別挑取試驗(yàn)菌株（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，將經(jīng)過(guò)滅菌的0.5 cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加20ul上清液，于37℃倒置培養(yǎng)18－20小時(shí)，觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會(huì)在濾紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈。

2、原核表達(dá)合江棘蛙抗菌肽Cathelicidins PR1-2含量測(cè)定：

取0.9%NaCl或磷酸緩沖鹽溶液將5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）10ul稀釋至100ul，使終濃度為0.5mg/ml。將上述稀釋樣品按0,1,2,4,8,12,16,20ul分別加到96孔板中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將所有標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)足到20u。加適當(dāng)體積上清液到96孔板中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20ul。各孔加入200ul Bradford染色液，輕輕用加樣槍吹打混勻（不要產(chǎn)生氣泡），室溫靜置3-5分鐘。測(cè)定A595的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下：

(1) SEQ ID NO. 1的信息

(i)序列特征：

(A)長(zhǎng)度：162bp

(B)類型：核苷酸

(C)鏈性：?jiǎn)捂?/u>

(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：直鏈狀

(ii)分子類型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.：1

(2) SEQ ID NO. 2的信息

(i)序列特征：

(A)長(zhǎng)度：54 aa

(B)類型：氨基酸

(C)鏈性：?jiǎn)捂?/u>

(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：直鏈狀

(ii)分子類型：蛋白質(zhì)

(iii)序列描述：SEQ ID NO.：2。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 貴州師范大學(xué)

<120> 合江棘蛙皮膚抗菌肽及其編碼序列的基因及原核表達(dá)

<130> nm:

<160> 4

<170> PatentIn version

<210> SEQ ID NO： 1

<211> 162

<212> DNA

<213> 合江棘蛙皮膚

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(162)

<400> 1

cggaa gtgta acttg ttctg caaag cgaag cagaa gctga aatct ctgag ctccg tcatc 60

gggac ggtcg ttcat ccacc tcgag gaaaa gaatg caaag attat tcgtg taaac tgctt 120

atgaa acttg gatcc tccag ccaca tcgaa agcat cgatc cc 162

<210> SEQ ID NO： 2

<211> 54

<212> 蛋白質(zhì)

<213> 原核表達(dá)

<400> 2

Arg Lys Cys Asn Leu Phe Cys Lys Ala Lys Gln Lys Leu Lys Ser

5 10 15

Leu Ser Ser Val Ile Gly Thr Val Val His Pro Pro Arg Gly Lys

20 25 30

Glu Cys Lys Asp Tyr Ser Cys Lys Leu Leu Met Lys Leu Gly Ser

35 40 45

Ser Ser His Ile Glu Ser Ile Asp Pro

50 54

<210> SEQ ID NO. 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>在抗菌肽Cathelicidins PR1-2序列的N端加入KpnⅠ和甲酸切割位點(diǎn)，以用于PCR擴(kuò)增。

<400> 3

CGGGG TACCG ACCCG CGGAA GTGTA ACTTG 30

<210> SEQ ID NO： 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質(zhì)粒pUC57s的通用引物，以用于PCR擴(kuò)增

<400> 4

AGCGG ATAAC AATTT CACAC AGG 23