本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及水稻鞘醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甾醇和皂苷類化合物具有重要的生理活性和生物學(xué)功能。甾醇類化合物結(jié)構(gòu)非常相似，都含有一個(gè)環(huán)戊烷并氫菲的四個(gè)相并的環(huán)構(gòu)成的基本骨架以及三個(gè)側(cè)鏈。甾醇廣泛分布在植物、動(dòng)物及真菌等細(xì)胞與組著的膜結(jié)構(gòu)中，既可以游離態(tài)形式存在，也可以結(jié)合態(tài)形式存在，根據(jù)來源不同可以分為植物甾醇、動(dòng)物甾醇。如植物中含有大量的谷甾醇(sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)和菜油甾醇(campesterol)，動(dòng)物組織及細(xì)胞中主要是膽固醇(cholesterol)，真菌類中含有豐富的麥角甾醇(ergosterol)菌類甾醇主要包括麥角甾醇。植物甾醇能夠抑制人體對(duì)膽固醇的吸收、促進(jìn)膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生化合成，具有抑制心血管疾病、抗癌、抗腫瘤、消炎、提高免疫、調(diào)節(jié)生長、抗病毒等作用，此外，植物甾醇還具有良好的抗氧化性，可用作食品抗氧化劑。β-谷甾醇(β-Sitosterol)是細(xì)胞膜的重要組成部分，對(duì)于維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的作用。植物甾醇中的油菜素內(nèi)酯(brassinolide)被稱為第六大類植物激素，在植物生長發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。三萜皂苷類代謝物在農(nóng)業(yè)科學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。齊墩果酸具有降低轉(zhuǎn)氨酶的功能，臨床用于治療急性黃疸肝炎；燕麥在根尖合的燕麥苷(avenacins)具有廣譜的抗菌功能，能防止多種病原菌侵染根部，發(fā)揮抗病作用(Haralampidisetal.,PNAS,98:13431-13436)；人參根部合成的人參皂苷類化合物是重要中藥的有效成分(Shuklaetal.,Phytochemistry,29:239-241)。柴胡皂苷(saikosaponin)能抑制Na+、K+-ATP酶的活性，具有抗菌、抗過敏、激活T細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)等功能；甘草甜素(glycyrrhizin)具有抗炎、護(hù)肝、抗?jié)儭⒖共《镜茸饔?，它的甜度是蔗糖?50倍，被廣泛應(yīng)用作藥物添加劑及甜品劑(KitagawaPureAppl.Chem.74:1189–1198.；Sekietal.,PlantCell,23:4112-4123)。植物中的三萜和甾醇是通過MVA途徑合成的，首先三個(gè)分子的乙酰CoA經(jīng)過兩步反應(yīng)生成3-羥基-3-甲基-戊二酰CoA(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA)，隨后在HMG-CoA還原酶的作用下生成甲羥戊酸(mevalonate，MVA)，MVA在一系列激酶和脫羧酶的作用下生成異戊烯焦磷酸(isopentenylpyrophosphate，IPP，C5)，IPP由異構(gòu)酶催化形成二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate，DMAPP，C5)，一分子IPP和一分子DMAPP在二丙烯丙基轉(zhuǎn)移酶催化下形成牻牛兒基焦磷酸(geranyldiphosphate，GPP，C10)，在牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶的催化下，一分子GPP和一分子IPP縮合形成法呢基焦磷酸(farnesyldiphosphate，F(xiàn)PP，C15)，兩分子FPP在鯊烯合酶催化下形成鯊烯(squalene，C30)，進(jìn)而在鯊烯環(huán)氧酶的作用下生成2,3-氧化鯊烯(2,3-oxidosqualene)。2,3-氧化鯊烯在2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶(2,3-Oxidosqualenecyclases，OSCs)的催化下生成甾醇類或三萜類骨架。根據(jù)其陽離子中間產(chǎn)物的特點(diǎn)，可把2,3-氧化鯊烯的環(huán)化分為前固醇陽離子型和達(dá)瑪烷陽離子型兩種類型。環(huán)阿屯醇合酶(cycloartenolsynthase，CAS，EC5.4.99.8)羊毛甾醇合酶(lanosterolsynthase，LSS，EC5.4.99.7)和一些四環(huán)三萜合酶催化2,3-氧化鯊烯形成“chair-boat-chair”構(gòu)象的前固醇陽離子，然后經(jīng)過一系列反應(yīng)分別轉(zhuǎn)化成環(huán)阿屯醇、羊毛甾醇及四環(huán)三萜。大多數(shù)五環(huán)三萜合酶能夠催化2,3-氧化鯊烯形成“chair-chair-chair”構(gòu)象的達(dá)瑪烷型陽離子，隨后經(jīng)過進(jìn)一步重排產(chǎn)生羽扇豆醇(lupeol)、α-amyrin和β-amyrin等五環(huán)三萜(Xueetal.,NewPhytol,193:1022-1038；Thimmappaetal.,Annu.Rev.Plant.Biol,65:225–57)，2,3-氧化鯊烯的環(huán)化成為甾醇和三萜生物合成途徑的分支點(diǎn)。合成的三萜類骨架在細(xì)胞色素P450單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和酰基轉(zhuǎn)移酶作用下被氧化、糖基化及?；然瘜W(xué)修飾，最終獲得不同種類的三萜類皂苷產(chǎn)物。目前已經(jīng)從不同植物中分離得到了約80種編碼OSCs酶的基因，包括環(huán)阿屯醇合成酶(Cycloartenolsynt|mse，CAS)、羊毛甾醇合成酶(lanosterolsynthase,LAS)、葫蘆二烯醇合成酶(cucurbitadienol,CPQ)、異山柑子萜醇合酶(isoarborinolsynthases)、β-香樹素合酶(β-amyrinsynthase，BAS)、羽扇醇合酶(Lupeolsynthas，LUP)、thalianolsynthase(THA)、marneralsynthase(MRN)、camelliolsynthase(CAMS)和baruolsynthase(BARS)(Thimmappaetal.,Annu.Rev.Plant.Biol,65:225–57)。其中β-香樹素合成酶參與起始多數(shù)皂苷類物質(zhì)的合成β-香樹素，然后通過加氧、糖基化及?；纫幌盗蟹磻?yīng)產(chǎn)生三萜皂苷(Qietal.,PNAS,101:8233-8238)。這是迄今為止植物中最大的一類三萜合酶基因；在單子葉植物中燕麥和水稻中也克隆到了β-amyrin合酶基因(Haralampidisetal.,PNAS,98:13431-13436；Sunetal.,doi:10.1093/mp/sst038.)。β-amyrin合酶是燕麥根中積累的抑菌類物質(zhì)燕麥苷合成途徑中的關(guān)鍵酶，它與燕麥苷合成途徑中至少有三個(gè)不同功能的基因形成一個(gè)基因簇。亞洲栽培稻分為秈稻(OryzasativaL.spp.indica)和粳稻(OryzasativaL.spp.japonica)兩大類，它們由野生稻Oryzarufipogon和Oryzanivara馴化而來(Huangetal.,Nature490:497-501)，這兩個(gè)亞種的水稻在形態(tài)及生理特性上都有很大不同，而且有很多直系同源基因在不同亞種中的功能產(chǎn)生分化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供水稻鞘醇合成相關(guān)蛋白。本發(fā)明提供的蛋白，是如下1)或2)：1)序列表中序列11-20任一所示的蛋白質(zhì)；2)將1)所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由1)所示的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。為了使(1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(2)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(2)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述DNA分子是如下1)-3)中任一種的DNA分子：1)編碼區(qū)為序列表中序列1-10任一所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的重組菌。和/或，所述宿主菌具體為酵母菌。上述蛋白在作為三萜類化合物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備三萜類化合物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備治療腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述三萜類化合物為式1所示的化合物：式1(C30H50O)；所述腫瘤為乳腺癌；所述腫瘤細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種制備式1所示的化合物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述重組菌；本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種化合物。本發(fā)明提供的化合物，為式1所示的化合物：上述化合物在制備治療腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述化合物在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；和/或，所述腫瘤具體為乳腺癌；和/或，所述腫瘤細(xì)胞具體為乳腺癌細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)用于擴(kuò)增權(quán)利所述OsOSC7i1-OsOSC7i10基因或所述OsOSC7i1-OsOSC7i10所述重組表達(dá)載體可將所述OsOSC7i1-OsOSC7i10基因插入任何常規(guī)表達(dá)載體得到，所述表達(dá)載體具體可為酵母表達(dá)載體，如畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)載體或釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YES載體庫，所述重組表達(dá)載體具體可為圖2所示的pPICZ-OSC7i。所述酵母表達(dá)載體還可以包括用于蛋白分泌表達(dá)的α因子、pho、用于產(chǎn)生融合蛋白的C末端和/或N末端的6個(gè)HIS標(biāo)簽、用于制備抗體的c-myc表位、用于轉(zhuǎn)化子篩選的Zeocin抗性或Amp抗性或者URA3或殺稻瘟菌素抗性、用于誘導(dǎo)表達(dá)的AOX1或GAP或AUG1或GAL1或TEF1等誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。攜帶本發(fā)明OsOSC7i1-OsOSC7i10的酵母表達(dá)載體可以通過電擊法，熱擊法等常規(guī)分子生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并獲得轉(zhuǎn)化的單克隆酵母細(xì)胞系。被轉(zhuǎn)化的酵母可是是畢赤酵母和/或釀酒酵母。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一類新蛋白OsOSC7i，通過克隆其編碼基因OsOSC7i，用酵母異源表達(dá)體系對(duì)它們的催化功能進(jìn)行研究，通過分離純化催化產(chǎn)物，鑒定出一種新的三萜骨架，命名為：水稻鞘醇(sheathenol),系統(tǒng)命名法為：(3R,3aS,13bR)-3-isopropyl-3a,5a,8,8,11a,13a-hexamethyl-2,3,3a,4,5,5a,7,7a,8,9,10,11,11a,11b,12,13,13a,13b-octadecahydro-1H-cyclopenta[a]chrysen-9-ol)，該化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖，該蛋白及其產(chǎn)生的化合物對(duì)三萜類骨架的功能研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值和深遠(yuǎn)的意義。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。附圖說明圖1為OsOSC7i1-OsOSC7i10基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖2為OsOSC7i1-OsOSC7i10酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定。圖3為發(fā)酵OsOSC7i1-OsOSC7i10酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)的水稻鞘醇的色譜圖。圖4為發(fā)酵OsOSC7i1-OsOSC7i10酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)的水稻鞘醇的MS分析圖。圖5為發(fā)酵OsOSC7i1-OsOSC7i10酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)的水稻鞘醇的立體結(jié)構(gòu)圖。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、OsOSC7i基因的獲得OsOSC7i基因?yàn)镺sOSC7i1-OsOSC7i10這10個(gè)同源性高的基因。一、引物的設(shè)計(jì)根據(jù)來源于燕麥的氧化鯊烯環(huán)化酶(OSC)基因序列AsCS1(GenBankAccessionNumber：AJ311790)和AsbAS(GenBankAccessionNumber：AJ311789)在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blastn檢索，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)12個(gè)同源性較高的全長cDNA序列，根據(jù)其中一個(gè)基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)以下引物：5’端引物：5′-ATGTGGAGGCTCAAGGTGTCG-3′；3’端引物：5′-CTATATGTTGCCTTCAAGCAGT-3′。二、OsOSC7i基因的擴(kuò)增以秈稻品種9311幼苗總RNA為模板，用上述引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：1、總RNA的提取RNA的提取用華越洋生物公司的QuickRNAisolationKit，具體操作步驟為下(注意防止RNase污染)：(1)將50-100mg植物組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入1ml細(xì)胞裂解液，渦旋振蕩使其充分溶解；(2)將細(xì)胞裂解液和組織研磨物的混合物中液體成分移至干凈的1.5ml塑料離心管中；(3)在離心管中加300μl的去蛋白液和200μl氯仿在振蕩器上振蕩30s混勻，此時(shí)溶液呈均勻的乳濁狀；(4)室溫12000rpm離心5-10分鐘，將上清(不超過700μl)轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5ml離心管中；(5)加入等體積的漂洗液，充分顛倒混勻，然后將混合物加入到一個(gè)離心吸附柱中，12000g室溫離心1分鐘，棄穿透液；(6)加500ul洗柱液，12000rpm室溫離心1分鐘，棄穿透液。再加入500μl洗柱液，重復(fù)一遍，然后室溫12000rpm離心1分鐘以去除殘留的液體。(7)將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到無RNA酶1.5ml離心收集管中，加入50-100μlRNA洗脫液，室溫放置3-5分鐘；(8)12000rpm室溫離心1分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。2、cDNA的合成應(yīng)用SuperscriptⅡRT試劑盒(Invitrogen)并按試劑盒說明書進(jìn)行操作：取1-5μg步驟1獲得的水稻總RNA放入滅活了RNase的PCR管中，加入1μLOligo(dT)12-18(500mg/mL)和1μLdNTP混合物(各10mM)，用DEPC處理后的雙蒸水補(bǔ)充至12μL，混勻后在65℃下加熱5分鐘，然后迅速置于冰上，1分鐘。短暫離心后再加入4μL5×第一鏈合成緩沖液、2μL0.1MDTT和1μLRNaseOut(40U/μL)，輕輕混勻后，50℃溫育2分鐘，然后加入1μLSuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)，混勻，50℃溫育1小時(shí)，70℃加熱15分鐘使酶失活，得到第一鏈cDNA。3、基因克隆取1μL步驟2獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在5’端引物和3’端引物的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)條件為：先95℃5分鐘；再94℃45秒，60℃45秒，72℃5分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。秈稻品種9311的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量D2000plusMarker；1：RT-PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明，得到了分子量約為2.2kb的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生物科技公司)回收該片段，然后將該回收片段與pGEM-TEasy(Promega)進(jìn)行連接。連接體系為：1μLT4DNA連接酶(3u/μL)、5μL2×連接酶緩沖液、0.5μLpGEM-TEasy(50ng/μL)和3.5μLPCR回收產(chǎn)物。連接反應(yīng)條件為：4℃反應(yīng)12-24小時(shí)，得到pTEOsOSC7i1。參照Cohen等的方法(PNAS，69:2110)，將連接產(chǎn)物pTEOsOSC7i1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-TEasy載體上的氨芐青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明pTEOsOSC7i1上含有擴(kuò)增到的序列由2280個(gè)堿基組成，其開放閱讀框(ORF)為序列表中序列1自5＇末端第1-2280位脫氧核糖核苷酸，將序列1所示的DNA序列命名為OsOSC7i1，該基因編碼的蛋白命名為OsOSC7i1，該蛋白的氨基酸序列為序列表中序列11。提取多個(gè)野外采集的水稻野生稻幼苗的總RNA為模板，用5’端引物和3’端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。經(jīng)所有的品種PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行測(cè)序，得到序列2-序列10所示的核苷酸序列，這些序列所示的基因依次命名為OsOSC7i2-OsOSC7i10。序列2所示的OsOSC7i2編碼的蛋白的氨基酸序列為序列12，編碼的蛋白命名為OsOSC7i2；序列3所示的OsOSC7i2編碼的蛋白的氨基酸序列為序列13，編碼的蛋白命名為OsOSC7i3；序列4所示的OsOSC7i2編碼的蛋白的氨基酸序列為序列14，編碼的蛋白命名為OsOSC7i4；序列5所示的OsOSC7i2編碼的蛋白的氨基酸序列為序列15，編碼的蛋白命名為OsOSC7i5；序列6所示的OsOSC7i2編碼的蛋白的氨基酸序列為序列16，編碼的蛋白命名為OsOSC7i6；序列7所示的OsOSC7i2編碼的蛋白的氨基酸序列為序列17，編碼的蛋白命名為OsOSC7i7；序列8所示的OsOSC7i2編碼的蛋白的氨基酸序列為序列18，編碼的蛋白命名為OsOSC7i8；序列9所示的OsOSC7i2編碼的蛋白的氨基酸序列為序列19，編碼的蛋白命名為OsOSC7i9；序列10所示的OsOSC7i2編碼的蛋白的氨基酸序列為序列20，編碼的蛋白命名為OsOSC7i10。將上述基因OsOSC7i2-OsOSC7i10(人工合成)分別插入pGEM-TEasy載體中，得到重組載體pTEOsOSC7i2-pTEOsOSC7i10。上述所有基因OsOSC7i1-OsOSC7i10均可人工合成。實(shí)施例2、OsOSC7i基因的功能驗(yàn)證一、酵母表達(dá)載體pPICZ-OsOSC7i的構(gòu)建1)用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和SacⅡ分別將pTEOsOSC7i1-pTEOsOSC7i10和pPICZA載體(Invitrogen)完全酶切。酶切體系為：5μgpPICZA和pTEOsOSC7i、2.5μL10×酶切緩沖液、1μLSpeⅠ和SacⅡ，加ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μL。酶切反應(yīng)條件為：37℃酶切3小時(shí)。2)用瓊脂糖電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，分別回收2.2kb左右的包含OsOSC7i的片段和3kb左右的pPICZA載體片段，分別溶解于20μLddH2O中。3)將步驟2)獲得的兩種片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為：1μLT4DNA連接酶、2μL10×連接酶緩沖液、3μL回收的包含OsOSC7i1-pTEOsOSC7i10基因的DNA片段、1μLpPICZA載體片段。連接反應(yīng)條件為：4℃連接12小時(shí)。得到pPICZ-OsOSC7i1-pPICZ-OsOSC7i10。4)將連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含有Zeocin的LB平板(Zeocin濃度為25ug/ml)進(jìn)行篩選。5)將陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，引物如下：5′AOX引物：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；OsOSC7i基因反向引物：5′-CTATATGTTGCCTTCAAGCAGT-3′。結(jié)果表明，OsOSC7i1-pTEOsOSC7i10i基因插入了pPICZA，且方向正確，將該重組質(zhì)粒命名為pPICZ-OsOSC7i1---pPICZ-OsOSC7i10。分別對(duì)重組質(zhì)粒pPICZ-OsOSC7i1---pPICZ-OsOSC7i10進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如下：pPICZ-OsOSC7i1為將序列表中序列1所示的OsOSC7i1基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。pPICZ-OsOSC7i2為將序列表中序列2所示的OsOSC7i2基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。pPICZ-OsOSC7i3為將序列表中序列3所示的OsOSC7i3基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。pPICZ-OsOSC7i4為將序列表中序列4所示的OsOSC7i4基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。pPICZ-OsOSC7i5為將序列表中序列5所示的OsOSC7i5基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。pPICZ-OsOSC7i6為將序列表中序列6所示的OsOSC7i6基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。pPICZ-OsOSC7i7為將序列表中序列7所示的OsOSC7i7基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。pPICZ-OsOSC7i8為將序列表中序列8所示的OsOSC7i8基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。pPICZ-OsOSC7i9為將序列表中序列9所示的OsOSC7i9基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。pPICZ-OsOSC7i10為將序列表中序列10所示的OsOSC7i10基因替換pPICZA載體的SpeⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間DNA片段得到的載體。二、表達(dá)載體pPICZ-OsOSC7i的重組酵母的構(gòu)建1、pPICZ-OsOSC7i轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞系應(yīng)用電激儀(德國Eppendorf公司)并參照說明書進(jìn)行操作。分別將質(zhì)粒pPICZ-OsOSC7i1-pPICZ-OsOSC7i10用電激法轉(zhuǎn)化野生型酵母X-33(Invitrogen)，用含有Zeocin的LB平板(Zeocin的濃度為100ug/ml)進(jìn)行篩選，用引物對(duì)(5′AOX引物和3′AOX引物)鑒定陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，得到重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i1-重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i10。鑒定具體步驟如下：選取一個(gè)陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，重懸于10μl水；加入5μl5U/μl溶壁酶(Sigma)溶液，30℃溫浴10min，-80℃冰凍10min。PCR體系：5μl10×buffer，5μl25mMMgCl2，1μl25mMdNTPs，1μl10pmol/μl5′AOX引物，1μl10pmol/μl3′AOX引物，27μl蒸餾水，5μl上述細(xì)胞裂解液，混勻，置于PCR儀，95℃5min；加入5μl0.16U/μlTaq(0.8unit)。PCR程序：30個(gè)循環(huán)(95℃1min；54℃1min；72℃1min)；72℃7min。陽性克隆鑒定所用引物對(duì)如下：5′AOX引物：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；3′AOX引物：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。得到2500bp，為陽性，下面用陽性菌株做實(shí)驗(yàn)。將空載體pPICZA電激導(dǎo)入野生型酵母X-33，得到轉(zhuǎn)空載體重組菌X-33/pPICZA。三、重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i1-重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i10生產(chǎn)水稻鞘醇1、重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i1生產(chǎn)水稻鞘醇A、培養(yǎng)在250ml培養(yǎng)瓶加入25ml的MGY培養(yǎng)基(1.34％酵母氮源，1％甘油，0.00004％生物素)，接種重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i1，28-30℃、250-300rpm振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到對(duì)數(shù)生長期(OD600＝2-6)，大約16-18小時(shí)。離心(1500-3000g、5min)收集細(xì)胞，棄上清，用MM培養(yǎng)基(1.34％酵母氮源，0.00004％生物素，0.5％甲醇)重懸到OD600＝1.0，大約100-200ml。把培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到1L的長頸培養(yǎng)瓶，用2層無菌紗布蓋住培養(yǎng)72小時(shí)，每24小時(shí)添加一次100％的甲醇，使其甲醇的終濃度保持0.5％。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，得到重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i1培養(yǎng)物。培養(yǎng)轉(zhuǎn)空載體重組菌X-33/pPICZA，操作同上，得到重組菌X-33/pPICZA培養(yǎng)物。B、水稻鞘醇的鑒定1)初步鑒定①裂解和提取酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞的培養(yǎng)物培養(yǎng)72小時(shí)后，分別稱取1g重組菌X-33/pPICZA培養(yǎng)物和重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i1培養(yǎng)物，加入裂解液(KOH10％，EtOH80％，ddH2O10％，20ugBetulin)30mL，70℃水浴2h；5000rpm，離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到另一玻璃管中，用等體積的正己烷萃取3次，將三次萃取液合并；用等體積的飽和鹽水將上一步得到的萃取液洗滌3次；將上步得到的正己烷相低壓旋轉(zhuǎn)蒸干，用少量等體積的正己烷或乙酸乙酯重新溶解，得到重組菌X-33/pPICZA裂解溶液和重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i1裂解溶液。②鑒定取1/5步驟①得到的裂解溶液，點(diǎn)到硅膠板上，在正己烷：乙酸乙酯的混合物(正己烷：乙酸乙酯＝6：1)中展開，在空氣中干燥，用5ml染色液噴霧(4.8ml冰乙酸，100μl濃硫酸，100μlp-anisaldehyde)，130℃烘烤顯色。結(jié)果見圖2，1：重組菌X-33/pPICZA培養(yǎng)物(pPICZA)，2：X-33/pPICZ-OsOSC7i1的培養(yǎng)物(OsOSC7i)；表明，在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)以后，與轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞的酵母細(xì)胞X-33/pPICZA相比，重組菌X-33/pPICZA-OsOSC7i1多了一條大小約為86KD的條帶，與預(yù)期相符。2)進(jìn)一步鑒定①裂解和提取酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞的培養(yǎng)物同上述步驟1)中的①，得到重組菌X-33/pPICZA裂解溶液和重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i1裂解溶液。②鑒定將1/2步驟①得到的裂解溶液，用氮?dú)獯蹈珊笥?00μlMSTFA溶解，在60℃衍生化半小時(shí)，取1μL用于GC-MS(Agilent6890GasChromatograph)分析(條件為載氣為He，流速為1.0mL/min。進(jìn)樣器溫度280℃。升溫程序?yàn)椋?0℃保持1min，10℃/min升溫至290℃，保持4min，20℃min-1升溫至340℃，保持1min。進(jìn)樣量1μL，分流比20:1。)，色譜柱為DB-5HT(30m×0.25mmi.d.，0.1-μmfilmthickness，Agilent)。結(jié)果見圖3，vector為重組菌X-33/pPICZA裂解溶液，2：X-33/pPICZ-OsOSC7i1的裂解溶液(OsOSC7i)；表明，攜帶水稻OsOSC7i的酵母細(xì)胞表達(dá)物比轉(zhuǎn)化空載體的酵母細(xì)胞在23.8min多了色譜峰。收集保留時(shí)間為23.8min的色譜峰的洗脫液，即為OsOSC7i1蛋白在酵母中的催化產(chǎn)物。將OsOSC7i1蛋白在70eV能量下，以30次/秒的速度掃描進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，掃描區(qū)間為30-700u，質(zhì)譜圖見圖4。3)核磁分析取上述2)中獲得的OsOSC7i1蛋白4mg產(chǎn)物，經(jīng)1H-NMR(800MHz)、13C-NMR((200MHz)、1H-1HCOSY、DEPT、1H-13CHSQC、1H-1HNOESY、1H-13CHMBC、1H-1HTOCSY和MS分析，確定OsOSC7i1蛋白為一種三萜類化合物，命名為水稻鞘醇(sheathenol)，結(jié)構(gòu)見圖5。催化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下表2所示：表2為產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)2、重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i2-重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i10生產(chǎn)水稻鞘醇與上述1的制備方法和檢測(cè)方法均相同，不同的僅是將重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i1分別替換為重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i2-重組菌X-33/pPICZ-OsOSC7i10，結(jié)果均得到圖5所示的水稻鞘醇。四、水稻鞘醇(sheathenol)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響1、實(shí)驗(yàn)材料：(1)將上述三獲得的水稻鞘醇sheathenol用二甲基亞砜(DMSO)配制成5mM的母液。(2)所用細(xì)胞：人正常胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；MDA-MB-436、SUM149PT均購自南京科佰生物科技有限公司；MCF-7購自上海迪奧生物科技有限公司。MRC-5細(xì)胞用含10％胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；MDA-MB-436細(xì)胞用含10％FBS的L-15/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；MCF-7使用添加了10μg/ml的牛胰島素(Insulin)含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；SUM149PT細(xì)胞使用添加了5μg/ml的牛胰島素(Insulin)和1μg/ml的氫化可的松(Hydrocortisone)的含5％FBS的Ham′sF-12培養(yǎng)液培養(yǎng)。(3)實(shí)驗(yàn)儀器：本實(shí)驗(yàn)全過程中所使用的Ham′sF-12、L-15、MEM和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液以及胎牛血清(FBS)均為GIBCO品牌，購自ThermoFisherScientific公司；牛胰島素(Insulin)購自上海勵(lì)瑞生物科技有限公司；氫化可的松(Hydrocortisone)購自阿拉丁試劑；三氯乙酸(TCA)購自AlfaAesar公司；磺酰羅丹明B(SRB)購自Sigma公司；多功能酶標(biāo)儀購自BioTek公司。2、實(shí)驗(yàn)方法：磺酰羅丹明B蛋白染色法(SRB法)：接種一定數(shù)量的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板。貼壁生長24小時(shí)后，加入不同量的水稻鞘醇sheathenol母液，使水稻鞘醇在孔中形成表2所示的不同濃度。待藥物作用96小時(shí)結(jié)束后，用50％三氯乙酸固定細(xì)胞。然后SRB溶液(4mg/ml)染色；最后加入10mMTris溶液溶解SRB，酶標(biāo)儀510nm波長下測(cè)定OD值，以下列公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：抑制率＝(OD值對(duì)照孔－OD值給藥孔)/OD值對(duì)照孔×100％根據(jù)各濃度抑制率，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，當(dāng)sheathenol濃度為27μM和30μM時(shí)，對(duì)MCF-7、MDA-MB-436、SUM149PT以及人正常胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5有明顯的抑制效果(抑制率>25％)。表3為sheathenol對(duì)各細(xì)胞的抑制率當(dāng)前第1頁1 2 3