交叉參考本申請要求2009年7月13日提交的美國專利申請第12/502,181號的權(quán)益，所述申請的全文以引用的方式并入本文。背景本發(fā)明涉及用于獲得梭菌(Clostridial)神經(jīng)毒素的系統(tǒng)和方法，用于由其制備藥物組合物的方法，和如此制備的藥物組合物的治療和美容用途。具體來說，本發(fā)明涉及用于獲得具有高效力、高純度和高產(chǎn)率的生物活性肉毒桿菌(botulinum)神經(jīng)毒素的快速且不含動物蛋白質(zhì)的色譜方法和系統(tǒng)。適于出于治療、診斷、研究和美容目的施用于人或動物的藥物組合物包含活性成分和一種或多種賦形劑、緩沖劑、載劑、穩(wěn)定劑、張力調(diào)節(jié)劑、防腐劑和/或增積劑。藥物組合物中的活性成分可以是生物制劑，如肉毒桿菌神經(jīng)毒素。用于獲得適用作藥物組合物中的活性成分的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的已知方法(如尚茨法(Schantzmethod))是使用動物來源的蛋白質(zhì)(如培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中所用的肉湯和酪蛋白)和動物來源的純化酶的多周培養(yǎng)、發(fā)酵和純化方法。將通過使用動物來源的產(chǎn)物制備的藥物組合物施用至患者可能招致施用病原體或感染原(如朊病毒)的風(fēng)險。另外，已知用于獲得肉毒桿菌毒素的不含動物蛋白質(zhì)的方法還是具有眾多上游(培養(yǎng)和發(fā)酵)和下游(純化)步驟的耗時過程(即，完成需要耗時超過一周)，并且仍然導(dǎo)致獲得具有可檢測得到的雜質(zhì)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。肉毒桿菌毒素梭菌屬具有超過127種物種，根據(jù)形態(tài)學(xué)及功能分成若干群組。厭氧的革蘭氏陽性細菌肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)產(chǎn)生一種有效的多肽神經(jīng)毒素肉毒桿菌毒素(同義詞“毒素”)，其在人和動物體內(nèi)引起稱為肉毒桿菌中毒的神經(jīng)麻痹性疾病。肉毒桿菌毒素中毒的癥狀可以從行走、吞咽和說話困難發(fā)展為呼吸肌麻痹和死亡。一個單位的肉毒桿菌毒素定義為向每只體重為約18-20克的雌性瑞士韋伯斯特小鼠(SwissWebstermice)腹膜內(nèi)注射后的LD50。一個單位的肉毒桿菌毒素是殺死一組雌性瑞士韋伯斯特小鼠中的50％的肉毒桿菌毒素的量。已經(jīng)表征了7種大體在免疫學(xué)上不同的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，它們分別是肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，各自通過用類型特異性抗體進行中和加以區(qū)分。肉毒桿菌毒素的不同血清型在其所影響的動物物種和其所引起的麻痹的嚴重程度和持續(xù)時間方面有所不同。肉毒桿菌毒素似乎以高親和力結(jié)合膽堿能運動神經(jīng)元，并且轉(zhuǎn)移至神經(jīng)元中并阻斷乙酰膽堿的突觸前釋放。肉毒桿菌毒素已在臨床環(huán)境中用于治療例如特征在于骨骼肌活性過高的神經(jīng)肌肉病癥。A型肉毒桿菌毒素已被美國食品藥品管理局(U.S.FoodandDrugAdministration；FDA)批準用于治療年齡超過12歲的患者的自發(fā)性眼瞼痙攣、斜視和半面痙攣、頸部張力障礙、眉間紋(面部)皺紋和用于治療多汗。FDA還批準了B型肉毒桿菌毒素用于治療頸部張力障礙。盡管所有的肉毒桿菌毒素血清型都明顯抑制神經(jīng)肌肉接點處神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放，但其是通過影響不同神經(jīng)分泌蛋白和/或在不同位點裂解這些蛋白質(zhì)來實施這種抑制。A型肉毒桿菌毒素是一種可以特異性水解細胞內(nèi)囊泡關(guān)聯(lián)蛋白(VAMP，也稱為突觸小泡蛋白(synaptobrevin))25千道爾頓(kDa)突觸體關(guān)聯(lián)蛋白(SNAP-25)的鋅內(nèi)肽酶。E型肉毒桿菌也裂解SNAP-25，但與A型肉毒桿菌毒素相比較，靶向此蛋白質(zhì)內(nèi)的不同氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒桿菌毒素作用于VAMP，其中各血清型在不同位點裂解所述蛋白質(zhì)。最后，C1型肉毒桿菌毒素顯示裂解突觸融合蛋白(syntaxin)和SNAP-25兩者。作用機制上的這些差異可能會影響各種肉毒桿菌毒素血清型作用的相對效力和/或持續(xù)時間。來自肉毒桿菌毒素復(fù)合物的活性肉毒桿菌毒素蛋白分子(也稱為“純毒素”或“神經(jīng)毒性組分”)的分子量對于所有七種已知的肉毒桿菌毒素血清型都是約150kDa。有趣的是，肉毒桿菌毒素由肉毒桿菌以包含神經(jīng)毒性組分連同一個或多個關(guān)聯(lián)非毒素蛋白的復(fù)合物形式釋放。因此，肉毒桿菌可以產(chǎn)生900kDa、500kDa和300kDa形式(近似分子量)的A型肉毒桿菌毒素復(fù)合物。B型和C1型肉毒桿菌毒素似乎僅產(chǎn)生為500kDa復(fù)合物。D型肉毒桿菌毒素產(chǎn)生為300kDa和500kDa復(fù)合物。最后，E型和F型肉毒桿菌毒素僅產(chǎn)生為約300kDa的復(fù)合物。復(fù)合物(即，分子量大于約150kDa)含有紅血球凝集素(HA)蛋白和非毒素非紅血球凝集素(NTNH)蛋白。因此，肉毒桿菌毒素復(fù)合物可以包含肉毒桿菌毒素分子(神經(jīng)毒性組分)和一個或多個HA蛋白和/或NTNH蛋白。這兩種類型的非毒素蛋白(其可以與肉毒桿菌毒素分子一起構(gòu)成相關(guān)神經(jīng)毒素復(fù)合物)可用于提供防止肉毒桿菌毒素分子變性的穩(wěn)定性和毒素被攝入時對抗消化酸的保護。另外，有可能較大(大于約150kDa分子量)肉毒桿菌毒素復(fù)合物可以導(dǎo)致肉毒桿菌毒素從肌肉內(nèi)注射肉毒桿菌毒素復(fù)合物的部位擴散開來的速率較慢。A型肉毒桿菌毒素治療多種臨床病狀的成功導(dǎo)致了對其他肉毒桿菌血清型的關(guān)注。因此，至少A型、B型、E型和F型肉毒桿菌毒素已在臨床上用于人。另外，神經(jīng)毒性組分(即，沒有關(guān)聯(lián)的非毒素蛋白)的制劑在歐洲以商品名XEOMIN銷售(MerzPharmaceuticals,Frankfurt,Germany)。已知A型肉毒桿菌毒素在pH4-6.8下可溶于稀水溶液中。在pH值高于約7時，起穩(wěn)定作用的非毒素蛋白從神經(jīng)毒素解離，特別是隨著pH值和溫度升高，導(dǎo)致毒性逐漸降低(SchantzE.J.等人,PreparationandcharacterizationofbotulinumtoxintypeAforhumantreatment(特別是第44-45頁),作為Jankovic,J.等人,TherapywithBotulinumToxin,MarcelDekker,Inc,1994的第3章)。與酶一樣，肉毒桿菌毒素(它是細胞內(nèi)的肽酶)通常至少部分取決于其三維構(gòu)象。將毫克量的毒素稀釋成每毫升含有若干納克的溶液存在明顯的困難，如毒素傾向于粘附于表面并因此減少可獲得毒素的量。因為毒素可能在配制含毒素藥物組合物的數(shù)月或數(shù)年后使用，所以用穩(wěn)定劑(如白蛋白、蔗糖、海藻糖和/或明膠)使毒素穩(wěn)定。含肉毒桿菌毒素的市售藥物組合物可以商標(A型肉毒桿菌毒素純化的神經(jīng)毒素復(fù)合物)從Allergan,Inc.(Irvine,California)購得。每100單位小瓶的由約5ng純A型肉毒桿菌毒素復(fù)合物、0.5mg人血清白蛋白和0.9mg氯化鈉組成，呈真空干燥形式并且意欲用不含防腐劑的無菌生理鹽水(0.9％氯化鈉注射液)復(fù)原。其它含肉毒桿菌毒素的市售藥物組合物包括(肉毒桿菌毒素藥物組合物中含A型肉毒梭菌毒素紅血球凝集素復(fù)合物與人血清白蛋白和乳糖，可以粉末形式從IpsenLimited,Berkshire,U.K.獲得，使用前用0.9％氯化鈉復(fù)原)和MyoBlocTM(包含B型肉毒桿菌毒素、人血清白蛋白、琥珀酸鈉和氯化鈉的注射溶液(約pH5.6)，可從SolsticeNeurosciences(SanDiego,California)獲得)。神經(jīng)毒性組分(150kDa毒素分子)和肉毒桿菌毒素復(fù)合物(300kDa至900kDa)可從以下來源獲得：例如ListBiologicalLaboratories,Inc.,Campbell,California；theCentreforAppliedMicrobiologyandResearch,PortonDown,U.K.；Wako(Osaka,Japan)；以及SigmaChemicals(StLouis,Missouri)。用于獲得肉毒桿菌神經(jīng)毒素的不含動物蛋白和/或色譜方法公開于美國專利7,445,914；7,452,697；7,354,740；7,160,699；7,148,041；和7,189,541中。以下美國專利申請中也有關(guān)注：2006年12月12日提交的11/609,449，名稱為“MediaforClostridiumBacterium”；2008年4月7日提交的12/098,896，名稱為“AnimalProductFreeMediaandProcessesforObtainingaBotulinumToxin”；2007年10月31日提交的11/932,689，名稱為“ChromatographicMethodandSystemforPurifyingaBotulinumToxin”；2007年10月31日提交的11/932,789，名稱為“ChromatographicMethodandSystemforPurifyingaBotulinumToxin”；和2008年9月19日提交的12/234,537，名稱為“AnimalProductFreeMediaAndProcessesForObtainingABotulinumToxin”。用于藥物組合物中的肉毒桿菌毒素可以使用熟知的尚茨法，通過對肉毒梭菌進行厭氧發(fā)酵來獲得(參見例如：SchantzE.J.等人,Propertiesanduseofbotulinumtoxinandothermicrobialneurotoxinsinmedicine,MicrobiolRev1992Mar；56(1):80-99；SchantzE.J.等人,PreparationandcharacterizationofbotulinumtoxintypeAforhumantreatment,JankovicJ編著的NeurologicalDiseaseandTherapy.Therapywithbotulinumtoxin(1994),NewYork,MarcelDekker；1994中的第3章,第41-49頁；和SchantzE.J.等人,UseofcrystallinetypeAbotulinumtoxininmedicalresearch,LewisGEJr編著的BiomedicalAspectsofBotulism(1981)NewYork,AcademicPress,第143-50頁)。用于獲得肉毒桿菌毒素的尚茨法利用動物產(chǎn)物例如作為試劑以及培養(yǎng)物和發(fā)酵培養(yǎng)基的部分。需要多個步驟來使梭菌毒素藥物組合物適于出于治療、診斷、研究或美容目的施用至人或動物。這些步驟可包括獲得純梭菌毒素并接著混配所述純梭菌毒素。第一步驟可為在有助于厭氧菌生長的環(huán)境中，如在溫暖厭氧氛圍中，通常在血液瓊脂平板上涂鋪和培養(yǎng)梭菌菌落。此步驟允許獲得具有所需形態(tài)和其它特征的梭菌菌落。在第二步驟中，可在第一適合培養(yǎng)基中發(fā)酵所選梭菌菌落，并且另外有必要時，在第二發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。經(jīng)過一定時間的發(fā)酵后，梭菌通常溶解并將梭菌毒素釋放至培養(yǎng)基中。第三，可純化所述培養(yǎng)基以便獲得毒素批料。獲得毒素批料的培養(yǎng)基純化一般使用動物來源的酶(如DNA酶和RNA酶，它們用來降解核酸和促進核酸的移除)和其它試劑進行。所得毒素批料可以是具有特定比活性的高純度毒素。在適合緩沖液中穩(wěn)定以后，可將所述毒素批料與一種或多種賦形劑混配以制造適合施用至人的梭菌毒素藥物組合物。梭菌毒素藥物組合物可以包含梭菌毒素作為活性藥物成分(API)。藥物組合物還可包括一種或多種賦形劑、緩沖劑、載劑、穩(wěn)定劑、防腐劑和/或增積劑。梭菌毒素發(fā)酵步驟可產(chǎn)生含有完整梭菌、溶解細菌、培養(yǎng)基營養(yǎng)物和發(fā)酵副產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基溶液。將此培養(yǎng)物溶液過濾以移除粗大成分，如完整和溶解細菌，將提供收集/澄清培養(yǎng)基。澄清培養(yǎng)基包含梭菌毒素和各種雜質(zhì)，并且進行處理以獲得稱為毒素批料的濃縮梭菌毒素。使用一種或多種動物來源的產(chǎn)物(如牛奶消化酪蛋白、DNA酶和RNA酶)獲得梭菌毒素批料的發(fā)酵和純化方法是已知的。用于獲得肉毒桿菌毒素復(fù)合物的所述已知非不含動物產(chǎn)物(“NAPF”)方法的一個實施例是尚茨法和其修改形式。尚茨法(從最初的涂鋪、細胞培養(yǎng)直到發(fā)酵和毒素純化)利用多種從動物來源獲得的產(chǎn)物，如培養(yǎng)瓶中的動物來源的細菌熟肉培養(yǎng)基(BactoCookedMeatmedium)、用于菌落生長和選擇的哥倫比亞血液瓊脂板(ColumbiaBloodAgarplates)，和發(fā)酵培養(yǎng)基中的酪蛋白。另外，尚茨毒素批料純化方法利用來自牛來源的DNA酶和RNA酶來水解含毒素發(fā)酵培養(yǎng)基中所存在的核酸。人們已經(jīng)表現(xiàn)出了對于當(dāng)在用于獲得API的方法和/或使用所述API制備(混配)藥物組合物的方法中使用動物產(chǎn)物時，遭受病毒和傳染性海綿狀腦病(TSE)(如牛海綿狀腦病(BSE))污染的可能性的擔(dān)憂。已知使用減少量的動物來源的產(chǎn)物獲得破傷風(fēng)類毒素的發(fā)酵方法(稱為不含動物產(chǎn)物或“APF”發(fā)酵方法；APF涵蓋不含動物蛋白質(zhì))，參見例如美國專利6,558,926。用于獲得梭菌毒素的APF發(fā)酵方法具有減少接下來的毒素批料受病毒、朊病毒或其它不當(dāng)成分污染的(已經(jīng)很低的)可能性的潛在優(yōu)勢，所述不當(dāng)成分接著可隨著活性藥物成分梭菌毒素被混配到用于施用至人的藥物組合物中而伴隨所述梭菌毒素?？梢允褂美缟V(如管柱色譜)在稱為分級分離或純化的過程中從蛋白質(zhì)、核酸、細胞碎片等的混合物中分離特定蛋白質(zhì)(如肉毒桿菌神經(jīng)毒素)。蛋白質(zhì)混合物一般通過含有例如固體(通常是多孔介質(zhì)，常稱為珠?；驑渲?的玻璃或塑膠管柱。不同蛋白質(zhì)或其它化合物基于其特定化學(xué)特征和這些特征引起其與所用特定色譜介質(zhì)相互作用的方式以不同速率通過基質(zhì)。介質(zhì)的選擇決定了蛋白質(zhì)借以進行分級分離的化學(xué)特征的類型。存在四種管柱色譜的基本類型：離子交換、凝膠過濾、親和力和疏水相互作用。離子交換色譜是基于表面靜電電荷使用以帶有正電荷或負電荷的小珠粒填充的管柱實現(xiàn)分級分離。在凝膠過濾色譜中，蛋白質(zhì)是基于其大小進行分級分離。在親和力色譜中，蛋白質(zhì)是基于其與連接至管柱基質(zhì)中的珠粒的特定化學(xué)基團(配基)結(jié)合的能力進行分離。配基對于靶蛋白可具有生物特異性。疏水相互作用色譜是基于表面疏水性實現(xiàn)分級分離。純化(分級分離)梭菌毒素的管柱色譜是熟知的。參見例如以下出版物：1.OzutsumiK.等人,Rapid,simplifiedmethodforproductionandpurificationoftetanustoxin,App&EnvironMicro,1985年4月,第939-943頁,第49卷,第4期(1985)公開使用高壓液相色譜(HPLC)凝膠過濾來純化破傷風(fēng)類毒素。2.SchmidtJ.J.等人,PurificationoftypeEbotulinumneurotoxinbyhigh-performanceionexchangechromatography,AnalBiochem1986年7月；156(1):213-219公開使用尺寸排阻色譜或離子交換色譜來純化E型肉毒桿菌毒素。還公開使用硫酸魚精蛋白替代核糖核酸酶(RNA酶)。3.SimpsonL.L.等人,IsolationandcharacterizationofthebotulinumneurotoxinsSimpsonLL；SchmidtJJ；MiddlebrookJL,HarsmanS編著MethodsinEnzymology.第165卷,MicrobialToxins:ToolsinEnzymologySanDiego,CA:AcademicPress；第165卷:第76-85頁(1988)公開使用重力流色譜、HPLC、使用親和力樹脂的捕捉步驟、尺寸排阻色譜和離子(陰離子和陽離子)交換色譜(包括使用兩種不同離子交換管柱)來純化肉毒桿菌神經(jīng)毒素。公開了各種Sephadex、Sephacel、Trisacryl、S和Q管柱。4.ZhouL.等人,ExpressionandpurificationofthelightchainofbotulinumneurotoxinA:AsinglemutationabolishesitscleavageofSNAP-25andneurotoxicityafterreconstitutionwiththeheavychain,Biochemistry1995；34(46):15175-81(1995)公開使用淀粉親和力管柱來純化肉毒桿菌神經(jīng)毒素輕鏈融合蛋白。5.KannanK.等人,MethodsdevelopmentforthebiochemicalassessmentofNeurobloc(botulinumtoxintypeB),MovDisord2000；15(Suppl2):20(2000)公開使用尺寸排阻色譜來測定B型肉毒桿菌毒素。6.WangY-c,ThepreparationandqualityofbotulinumtoxintypeAforinjection(BTXA)anditsclinicaluse,DermatolLasFaciCosmSurg2002；58(2002)公開離子交換色譜來純化A型肉毒桿菌毒素。此參考文獻公開沉淀與色譜技術(shù)的組合。7.JohnsonS.K.等人,Scale-upofthefermentationandpurificationoftherecombinationheavychainfragmentCofbotulinumneurotoxinserotypeF,expressedinPichiapastoris,ProteinExprandPurif2003；32:1-9(2003)公開使用離子交換和疏水相互作用管柱來純化F型肉毒桿菌毒素的重組重鏈片段。8.公布的美國專利申請20030008367A1(Oguma)公開使用離子交換和乳糖管柱來純化肉毒桿菌毒素。以上概述的純化方法涉及小規(guī)模純化肉毒桿菌毒素復(fù)合物的神經(jīng)毒性組分(即，約150kDa神經(jīng)毒性分子)或所述神經(jīng)毒性組分的特定組分，而與純化整個900kDa肉毒桿菌毒素復(fù)合物不同。此外，用于獲得適于混配到肉毒桿菌毒素藥物組合物中的肉毒桿菌毒素的現(xiàn)有方法(包括工業(yè)規(guī)模方法)一般包括一系列沉淀步驟以分離毒素復(fù)合物與來自發(fā)酵過程的伴隨肉毒桿菌毒素的雜質(zhì)。顯然，沉淀技術(shù)在生物醫(yī)藥工業(yè)中廣泛用于純化肉毒桿菌毒素。舉例來說，使用冷醇分級分離(科恩法(Cohn’smethod))或沉淀來移除血漿蛋白質(zhì)。不幸的是，先前用于純化肉毒桿菌毒素的沉淀技術(shù)具有低解析度、低生產(chǎn)力、難以操作、難以控制和/或驗證和/或難以進行規(guī)模的擴大或縮小的缺點。先前公布的美國專利申請No.11/452,570(2006年10月12日公布)公開各種不含動物蛋白質(zhì)和NAPF方法中所利用的多個步驟，如離心、酸沉淀、乙醇沉淀、酸化步驟和硫酸銨沉淀(關(guān)于詳細論述，請參見美國公開專利申請No.2006/0228780，其全文以引用的方式并入本文)。其中展示了用于獲得肉毒桿菌神經(jīng)毒素的非不含動物蛋白質(zhì)方法與不含動物蛋白質(zhì)方法之間的一些區(qū)別。因此需要用于獲得具有高純度且高度有效的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的快速、規(guī)模相對較小但產(chǎn)率高的系統(tǒng)和方法，所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素可用于研究目的和/或制造藥物組合物。概述本發(fā)明滿足此需要并且提供可通過快速、規(guī)模較小、商業(yè)上適用、產(chǎn)率高且不含動物蛋白質(zhì)的色譜系統(tǒng)和方法獲得的高純度且高度有效的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。所得肉毒桿菌神經(jīng)毒素適用于制造藥物組合物。通過實施本發(fā)明獲得梭菌毒素優(yōu)選為肉毒桿菌神經(jīng)毒素并且最優(yōu)選為約900kDa的A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物或其中的150kDa神經(jīng)毒性組分。本發(fā)明不需要NAPF試劑，如DNA酶和RNA酶。定義本文中使用的以下用詞和術(shù)語具有以下定義?！凹s”意謂所修飾的條目、參數(shù)或術(shù)語涵蓋在所述條目、參數(shù)或術(shù)語的值上方和下方加上或減去百分之十的范圍?！笆┯?Administration/toadminister)”意謂對受試者給予(即，施用)藥物組合物或活性成分的步驟。本文公開的藥物組合物是通過例如肌肉內(nèi)(i.m.)、皮內(nèi)、皮下施用、鞘內(nèi)施用、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)(i.p.)施用、局部外表(透皮)和植入(即，植入緩慢釋放裝置，如聚合植入物或微型滲透泵)施用途徑進行“局部施用”?！安缓瑒游锂a(chǎn)物”或“基本上不含動物產(chǎn)物”分別涵蓋“不含動物蛋白質(zhì)”或“基本上不含動物蛋白質(zhì)”并且意謂不存在或基本上不存在血液來源的、血液匯集的和其它動物來源的產(chǎn)物或化合物?！皠游铩币庵^哺乳動物(如人)、鳥、爬行動物、魚、昆蟲、蜘蛛或其它動物物種?！皠游铩辈话ㄎ⑸?，如細菌。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)的APF培養(yǎng)基或方法或基本上APF培養(yǎng)基或方法可包括肉毒桿菌毒素或肉毒桿菌細菌。舉例來說，APF方法或基本上APF方法意謂基本上不含或基本上不含或完全不含動物來源的蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白、肉消化產(chǎn)物、肉副產(chǎn)物和奶或乳制品或消化產(chǎn)物)的方法。“肉毒桿菌毒素”或“肉毒桿菌神經(jīng)毒素”意謂由肉毒梭菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，以及經(jīng)過修飾的、重組的、雜交的和嵌合的肉毒桿菌毒素。重組肉毒桿菌毒素可具有由非梭菌物種重組制造的輕鏈和/或重鏈。如本文所用的“肉毒桿菌毒素”涵蓋肉毒桿菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。如本文所用的“肉毒桿菌毒素”還涵蓋肉毒桿菌毒素復(fù)合物(即，300、600和900kDa復(fù)合物)以及純?nèi)舛緱U菌毒素(即，約150kDa神經(jīng)毒性分子)，它們均適用于實施本發(fā)明?！凹兓娜舛緱U菌毒素”意謂與在由培養(yǎng)物或發(fā)酵過程獲得肉毒桿菌毒素時可能伴隨肉毒桿菌毒素的其它蛋白質(zhì)和雜質(zhì)分離或基本上分離的純?nèi)舛緱U菌毒素或肉毒桿菌毒素復(fù)合物。因此，純化的肉毒桿菌毒素可以有至少90％，優(yōu)選大于95％，且最優(yōu)選大于99％的非肉毒桿菌毒素蛋白質(zhì)和雜質(zhì)被移除。肉毒桿菌C2和C3細胞毒素(不是神經(jīng)毒素)不包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?！八缶窠?jīng)毒素”意謂由梭菌細菌(如肉毒梭菌、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)或巴氏梭菌(Clostridiumberati))產(chǎn)生或所述梭菌細菌天然具有的神經(jīng)毒素，以及由非梭菌物種重組制造的梭菌神經(jīng)毒素。“完全不含”(“由……組成”術(shù)語)意謂在所用儀器或方法的檢測范圍內(nèi)，物質(zhì)不能被檢測到或不能確認其存在。“基本上不含”(或“基本上由……組成”)意謂僅可以檢測到微量物質(zhì)?！敖?jīng)過修飾的肉毒桿菌毒素”意謂與天然肉毒桿菌毒素相比，至少一個氨基酸被缺失、修飾或置換的肉毒桿菌毒素。另外，經(jīng)過修飾的肉毒桿菌毒素可以是重組產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，或重組制造的神經(jīng)毒素的衍生物或片段。修過修飾的肉毒桿菌毒素保留天然肉毒桿菌毒素的至少一種生物活性，如結(jié)合肉毒桿菌毒素受體的能力或抑制神經(jīng)遞質(zhì)從神經(jīng)元釋放的能力。經(jīng)過修飾的肉毒桿菌毒素的一個實施例是輕鏈是來自一種肉毒桿菌毒素血清型(如血清型A)而重鏈是來自一不同肉毒桿菌毒素血清型(如血清型B)的肉毒桿菌毒素。經(jīng)過修飾的肉毒桿菌毒素的另一實施例是與神經(jīng)遞質(zhì)(如物質(zhì)P)偶合的肉毒桿菌毒素。“藥物組合物”意謂活性成分可以是肉毒桿菌毒素的制劑。用詞“制劑“意謂在藥物組合物中，除肉毒桿菌神經(jīng)毒素活性成分外，還存在至少一種其它成分(如且不限于白蛋白[如人血清白蛋白或重組人白蛋白]和/或氯化鈉)。因此藥物組合物是適于在診斷、治療或美容上施用(例如通過肌肉內(nèi)或皮下注射或通過插入儲集器或植入物)于受試者(如人患者)的制劑。藥物組合物可以是：在凍干或真空干燥條件下是在用例如鹽水或水復(fù)原凍干或真空干燥的藥物組合物后形成的溶液；或者是不需要復(fù)原的溶液?；钚猿煞挚梢允侨舛緱U菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F或G或肉毒桿菌毒素之一，它們都可以由梭菌細菌天然產(chǎn)生。如所述，藥物組合物可以是例如真空干燥的液體或固體。配制肉毒桿菌毒素活性成分藥物組合物的示例性方法公開于2002年11月5日提交的公布的美國專利申請20030118598中，所述申請的全文以引用的方式并入本文?！盎旧喜缓币庵^在評估了物質(zhì)(如動物產(chǎn)物、動物蛋白質(zhì)或動物來源的產(chǎn)物或蛋白質(zhì))的重量百分比的培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、藥物組合物或其它材料中，存在水平少于所述材料重量的百分之一。“治療制劑”意謂制劑可用于治療并由此緩解病癥或疾病和/或其相關(guān)癥狀，如特征在于周邊肌肉或腺體(例如汗腺)機能亢進(例如痙攣狀態(tài))的病癥或疾病?！爸委熡行Я俊币庵^治療疾病、病癥或病狀而不引起顯著負面或不良副作用所需的藥劑(如肉毒桿菌毒素或包含肉毒桿菌毒素的藥物組合物)的水平、量或濃度。“治療(Treat/treating/treatment)”意謂減輕或減少(其包括部分減少、顯著減少、接近完全減少和完全減少)、解決或預(yù)防(暫時性或永久性)疾病、病癥或病狀(如臀部畸形)，以便達成所要治療或美容結(jié)果，如通過治愈損傷或損壞的組織，或通過改造、改變、增強、改良、改善和/或美化現(xiàn)有的或感覺到的疾病、病癥或病狀。治療效果(如通過施用肉毒桿菌神經(jīng)毒素獲得的減輕效果)例如在向患者施用肉毒桿菌神經(jīng)毒素后1天至7天之間在臨床上可能不明顯，并且取決于所治療的病狀和特定病例，可以具有約1個月至約1年或其間的任何時間范圍的效果持續(xù)時間。除非另外說明，否則百分比是基于每體積的重量。APF意謂不含動物產(chǎn)物/蛋白質(zhì)。CV意謂管柱體積。DF意謂滲濾。ELISA意謂酶聯(lián)免疫吸附測定。如在“IAPF系統(tǒng)”或“IAPF方法”中的IAPF意謂“改良的不含動物蛋白質(zhì)”的系統(tǒng)或方法。IAPF系統(tǒng)或方法包括使用兩種色譜介質(zhì)或三種色譜介質(zhì)來純化肉毒桿菌毒素或神經(jīng)毒素組分，如本文所具體詳細描述。色譜介質(zhì)包括本領(lǐng)域中已知的色譜樹脂。通過使用兩種色譜介質(zhì)獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素批料在本文中稱為IAPF。如在“FAPF系統(tǒng)”或“FAPF方法”中的FAPF意謂“進一步改良的不含動物蛋白質(zhì)”的系統(tǒng)或方法。因此，F(xiàn)APF是IAPF方法，并且FAPF系統(tǒng)或方法意謂使用三種色譜介質(zhì)來純化肉毒桿菌毒素或神經(jīng)毒素組分。通過使用三種色譜介質(zhì)獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素批料在本文中稱為FAPF。NAPF意謂非不含動物蛋白質(zhì)。SDS-PAGE意謂十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。SEC-HPLC意謂尺寸排阻高效液相色譜。UF意謂超濾。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF色譜方法，所述方法包括以下步驟：(a)提供基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基；(b)在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵肉毒梭菌細菌；和(c)通過使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與陰離子交換色譜接觸，接著使來自所述陰離子交換色譜介質(zhì)的洗提液與陽離子交換色譜介質(zhì)接觸從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素，由此從所述基本上APF色譜方法獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在具體實施方案中，所述方法可提供包含少于一個百萬分率(ppm)殘余核酸的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，即，每毫克所得肉毒桿菌神經(jīng)毒素包含1納克或更少的殘余核酸。在另一方面，所述方法是在一周或短于一周內(nèi)完成。在一個實施例中，具有3:1:1比率的培養(yǎng)基意謂含有3％HySoy、1％HyYeast和1％葡萄糖的肉毒桿菌毒素培養(yǎng)/發(fā)酵培養(yǎng)基。HySoy(Quest產(chǎn)品編號5X59022)是通過對大豆進行酶促水解制造的肽源。HyYeast(HyYest，Quest產(chǎn)品編號5Z10102或5Z10313)是面包酵母提取物。在另一個實施例中，具有5:1:1比率的培養(yǎng)基意謂含有5％HySoy、1％HyYeast和1％葡萄糖的肉毒桿菌毒素培養(yǎng)/發(fā)酵培養(yǎng)基。另一個實施方案提供用于獲得生物活性A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物的基本上APF色譜方法，所述方法按序包括以下步驟：在基本上APF培養(yǎng)基中培養(yǎng)基肉毒梭菌細菌；在約2L至約75L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基中，更優(yōu)選在約2L至約50L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基中，甚至更優(yōu)選在約2L至約30L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵來自所述培養(yǎng)基的肉毒梭菌細菌(具體實施方案具有包括植物蛋白和/或植物蛋白衍生物(例如水解植物蛋白)的培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的至少一者)；通過使用過濾或離心移除存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的細胞碎片收集發(fā)酵培養(yǎng)基；通過過濾，如通過超濾濃縮所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基；通過添加緩沖液稀釋所濃縮的發(fā)酵培養(yǎng)基。用緩沖液稀釋后，進行第一接觸步驟，其中使經(jīng)過稀釋的所收集發(fā)酵培養(yǎng)基與陰離子交換介質(zhì)接觸以便使生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素被陰離子交換介質(zhì)捕捉；接著從所述陰離子交換介質(zhì)洗提所捕捉的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，由此獲得含有肉毒桿菌毒素的第一洗提液；進行第二接觸步驟，其中使第一洗提液與陽離子交換介質(zhì)接觸以從第一洗提液移除雜質(zhì)，由此獲得含有肉毒桿菌毒素的第二洗提液；接著通過滲濾(DF)處理第二洗提液；和過濾處理過的第二洗提液，由此使用基本上APF色譜方法獲得生物活性A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物。所獲得的A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物可具有每毫克A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物約2.0×107個單位至約6.0×107個單位的效力。在具體實施例中，可獲得例如具有每毫克約2.4×107個單位至每毫克約5.9×107個單位之間的效力的A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物。在一個具體實施方案中，所述方法利用包含不超過約5％w/v植物來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、不超過約2％w/v酵母提取物和不超過約2％w/v葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，并且其中在發(fā)酵步驟開始時發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值水平為約6.5至約pH8.0，更優(yōu)選為約pH6.8至約pH7.6。在一個具體實施方案中，進行培養(yǎng)步驟直至培養(yǎng)基在約540納米(nm)下的光學(xué)密度在約0.8個吸光度單位(AU)與約4.5AU之間。優(yōu)選通過將肉毒梭菌APF工作細胞庫內(nèi)含物引入培養(yǎng)基中起始培養(yǎng)步驟，其中所述工作細胞庫內(nèi)含物包含每毫升工作細胞庫至少約1×104個菌落形成單位，優(yōu)選約1×104個至約5×107個菌落形成單位的肉毒梭菌，并且其中所述工作細胞庫中的肉毒梭菌細菌具有基本上均一的形態(tài)。在另一實施方案中，發(fā)酵步驟進行約60小時至80小時并且直至發(fā)酵培養(yǎng)基在約890nm下的光學(xué)密度降至約0.05AU至約0.7AU之間。在一方面，通過基本上APF色譜方法獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素包含少于1ppm殘余核酸并且所述方法在一周或短于一周內(nèi)完成。在另一個實施方案中，提供用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的利用色譜的APF方法，所述方法按序包括以下步驟：(a)將來自APF工作細胞庫的肉毒梭菌細菌添加至APF培養(yǎng)基中；(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉毒梭菌細菌；(c)在APF發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵來自步驟(b)的肉毒梭菌細菌直至發(fā)生肉毒梭菌細胞溶解；(d)收集發(fā)酵培養(yǎng)物以提供收集的發(fā)酵培養(yǎng)基；(e)通過過濾對所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基進行濃縮；(f)通過添加緩沖液稀釋經(jīng)過過濾的發(fā)酵培養(yǎng)基以獲得經(jīng)過稀釋的發(fā)酵培養(yǎng)基；(g)第一接觸步驟，其中使經(jīng)過稀釋的發(fā)酵培養(yǎng)基與捕獲色譜介質(zhì)接觸，其中所述捕獲色譜介質(zhì)是陰離子交換介質(zhì)；(h)第二接觸步驟，其中使來自第一接觸步驟的洗提液與精制色譜介質(zhì)接觸，其中所述精制色譜介質(zhì)是陽離子交換介質(zhì)；和(i)過濾來自第二接觸步驟的洗提液，由此通過改良的APF方法獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素，其中所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素包含1ppm的殘余核酸或少于1ppm的殘余核酸并且所述方法在一周或短于一周內(nèi)完成。在一方面，提供用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上不含動物產(chǎn)物(APF)的色譜系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基，用于在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵的肉毒梭菌細菌，用于從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的陰離子交換色譜介質(zhì)，和用于從來自陰離子交換色譜介質(zhì)的洗提液進一步回收生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的陽離子交換色譜介質(zhì)，由此從基本上APF色譜方法獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在特定配置中，所述系統(tǒng)可進一步包括用于在基本上APF培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)肉毒梭菌細菌的第一裝置，并且可進一步包括用于在基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵肉毒梭菌細菌的第二裝置，其中所述肉毒梭菌細菌是從第一裝置獲得。為進行澄清，所述系統(tǒng)可包括用于從獲自第二裝置的發(fā)酵培養(yǎng)基移除細胞碎片的收集裝置，由此提供收集的發(fā)酵培養(yǎng)基?？墒顾占陌l(fā)酵培養(yǎng)基通過濃縮和稀釋裝置以濃縮并隨后稀釋所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基。在一個具體實施例中，所述系統(tǒng)還可包括用于從來自陽離子交換色譜介質(zhì)的洗提液回收經(jīng)過進一步純化的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的疏水相互作用介質(zhì)。另外，還可用用于降低所獲得的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素中的生物負載量的過濾裝置補充所述系統(tǒng)，以便降低利用兩種或三種色譜介質(zhì)獲得的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的生物負載量。在一個具體實施例中，可利用在工作空間中具有整合高效微?？諝膺^濾器的用于在基本上APF培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉毒梭菌細菌的厭氧培養(yǎng)室。示例性系統(tǒng)可提供效力為每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素至少約2.0×107個單位的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，并且所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素在每毫克所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素中包含1納克或少于1納克的殘余核酸。在具體實施方案中，所提供基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基的量是約2L至約75L；并且利用約200mL至約1L的基本上APF培養(yǎng)基。在本發(fā)明的另一方面，提供用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的使用色譜的基本上APF系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括用于培養(yǎng)肉毒梭菌細菌的第一裝置，所述第一裝置能夠容納基本上APF培養(yǎng)基；用于發(fā)酵已在第一裝置中培養(yǎng)的肉毒梭菌細菌的第二裝置，所述第二裝置能夠容納基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基；用于收集發(fā)酵培養(yǎng)基的第三裝置；用于濃縮所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基和稀釋經(jīng)過過濾的發(fā)酵培養(yǎng)基的第四裝置；用于從所收集的培養(yǎng)基進行肉毒桿菌神經(jīng)毒素的第一次純化的第五裝置，其中所述第五裝置包括陰離子交換色譜介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第一次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素；和用于進行肉毒桿菌神經(jīng)毒素的第二次純化的第六裝置，其中所述第六裝置包括陽離子交換色譜介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第二次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，其中所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素具有每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素至少約2.0×107個單位至每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素至少約5.9×107個單位的效力，所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素在每毫克所獲得肉毒桿菌神經(jīng)毒素中包含1納克或少于1納克的殘余核酸，并且所述方法在一周或短于一周內(nèi)完成。在具體實施方案中，所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素可具有每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素至少4.4×107個單位的效力。在所述系統(tǒng)的一個具體實施方案中，所述系統(tǒng)可進一步包括用于對從第六裝置獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行進一步純化的第七裝置，其中所述第七裝置包括疏水相互作用介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第三次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在另一實施方案中，所述系統(tǒng)可進一步包括第八裝置，其包括用于過濾來自第七裝置的洗提液的膜。本發(fā)明的另一方面包括用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF色譜系統(tǒng)，其包括用于厭氧培養(yǎng)肉毒梭菌細菌的第一裝置，所述第一裝置能夠容納約200mL至約1L基本上APF培養(yǎng)基；在能夠容納所述第一裝置的培養(yǎng)室內(nèi)具有整合高效微粒空氣過濾器的厭氧培養(yǎng)室的第二裝置；用于厭氧發(fā)酵已在所述第一裝置中培養(yǎng)的肉毒梭菌細菌的第三裝置，所述第三裝置能夠容納約2L至約75L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)選約2L至約30L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基且包括至少一個選自由還原氧化探測器、pH值探測器和濁度探測器組成的群組的一次性探測器；用于收集發(fā)酵培養(yǎng)基的第四裝置；用于濃縮所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基和稀釋經(jīng)過過濾的發(fā)酵培養(yǎng)基的第五裝置；用于對從所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行第一次純化的第六裝置，所述第六裝置包括陰離子交換色譜介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第一次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素；用于對肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行第二次純化的第七裝置，所述第七裝置包括陽離子交換色譜介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第二次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素；用于對經(jīng)過第二次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行第三次純化的第八裝置，所述第八裝置包括疏水相互作用介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第三次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素；和用于過濾經(jīng)過第三次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的第九裝置，所述第九裝置包括過濾膜，其中所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素具有每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約2.4×107個單位至每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約5.9×107個單位的效力，所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素在每毫克所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素中包含1納克或少于1納克殘余核酸并且所述方法在一周或短于一周內(nèi)完成。根據(jù)所述方法，由此獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素，并且在具體實施例中，所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素具有每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素至少約4.4×107個單位的效力。根據(jù)本文中公開的方法和系統(tǒng)，由此獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在具體實施方案中，通過本文中公開的方法和系統(tǒng)獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素具有約900kDa的分子量。本發(fā)明進一步包括用于制備活性成分為生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF藥物組合物的方法，所述方法包括以下步驟：(a)通過以下步驟獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素：(i)提供基本上不含動物產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基；(ii)在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵肉毒梭菌細菌；和(iii)使用陰離子交換色譜介質(zhì)接著使用陽離子交換色譜介質(zhì)從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素，其中所回收的肉毒桿菌神經(jīng)毒素具有每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素至少約2.0x107個單位，優(yōu)選每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約2.4×107個單位至每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約5.9×107個單位，在一些實施方案中每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素至少約4.4×107個單位的效力，所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素在每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素中包含1納克或少于1納克的殘余核酸，并且步驟(i)至(iii)在一周或短于一周內(nèi)完成；和(b)混配所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素與至少一種適合賦形劑，由此制備基本上APF藥物組合物。在一個具體實施方案中，混配步驟包括通過選自由冷凍干燥、凍干和真空干燥組成的方法群組的方法干燥肉毒桿菌神經(jīng)毒素的步驟，并且其中所述適合賦形劑選自由白蛋白、人血清白蛋白、重組人血清白蛋白、明膠、蔗糖、海藻糖、羥乙基淀粉、膠原蛋白、乳糖、蔗糖氯化鈉、多糖、辛酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮和鈉組成的群組。因此，本發(fā)明的一個方面還提供通過混配由本文中公開的方法和系統(tǒng)獲得的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素制備的基本上APF藥物組合物。另外，本發(fā)明還提供用于治療患者的病狀的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的通過用于制備活性成分為由本文中公開的APF方法(即，IAPF和FAPF方法)獲得的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF藥物組合物的方法制備的藥物組合物的步驟。所欲治療的病狀的實施例選自由以下組成的群組：例如頭痛、偏頭痛、緊張性頭痛、竇性頭痛、頸源性頭痛、出汗病癥、腋窩多汗癥、手掌多汗癥、足底多汗癥、弗雷氏綜合征(Frey’ssyndrome)、皮紋過動癥、面部皺紋、眉間紋、烏鴉足、木偶紋、鼻唇溝、皮膚病癥、失弛緩癥、斜視、慢性肛裂、眼瞼痙攣、肌肉骨骼疼痛、纖維肌痛、胰腺炎、心動過速、前列腺腫大、前列腺炎、尿潴留、尿失禁、膀胱過動癥、半面痙攣、震顫、肌陣攣、胃腸病癥、糖尿病、流涎癥、逼尿肌-括約肌協(xié)同失調(diào)、中風(fēng)后痙攣、創(chuàng)傷愈合、青少年大腦性癱瘓、平滑肌痙攣、再狹窄、局限性肌張力障礙、癲癇、頸部張力障礙、甲狀腺病癥、高鈣血癥、強迫癥、關(guān)節(jié)炎性疼痛、雷諾氏綜合征(Raynaud’ssyndrome)、萎縮紋、腹膜粘連、血管痙攣、鼻漏、肌肉攣縮、肌肉受損、喉肌痙攣、書寫痙攣和腕隧道綜合征。在一個實施方案中，用于治療患者的病狀的方法，所述方法包括向所述患者局部施用有效量的基本上APF藥物組合物的步驟，所述基本上APF藥物組合物是通過包括以下步驟的方法制造：(a)通過以下方式獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素：(i)提供基本上不含動物產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基；(ii)在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵肉毒梭菌細菌；和(iii)使用陰離子交換色譜介質(zhì)，接著使用陽離子交換色譜介質(zhì)從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素，其中所回收的肉毒桿菌神經(jīng)毒素具有每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素至少約2.0×107個單位的效力，所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素在每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素中包含1納克或少于1納克的殘余核酸，并且步驟(i)至(iii)在一周或短于一周內(nèi)完成；和(b)混配所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素與至少一種適合賦形劑，由此制備基本上APF藥物組合物，借以局部施用所述基本上APF藥物組合物治療所述病狀。局部施用治療有效量的包含通過本文中公開的IAPF工藝/系統(tǒng)/方法提供的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的藥物組合物可以例如約2個月至約6個月的時間間隔或以約2個月至約3個月的時間間隔重復(fù)。局部施用至患者的治療有效量的根據(jù)本發(fā)明制備的基本上APF藥物組合物的示例性適用劑量可具有約0.01個單位與約10,000個單位之間的肉毒桿菌神經(jīng)毒素單位量。在特定情況下，肉毒桿菌神經(jīng)毒素以約0.01個單位與約3000個單位之間的量施用。在具體實施例中，作為藥物組合物中的活性藥物成分的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素是例如A型或B型肉毒桿菌神經(jīng)毒素。本發(fā)明包括用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的利用色譜的基本上APF方法。所述方法可按序包括以下步驟：提供基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基，接著在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵肉毒梭菌細菌，和使用陰離子交換色譜介質(zhì)并接著使用陽離子交換色譜介質(zhì)從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素，由此由所述基本上APF色譜方法獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素?；厥詹襟E還可在使用陽離子交換色譜介質(zhì)后包括使用疏水相互作用介質(zhì)。所獲得的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素可以是肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物或由其分離的具有約150kDa分子量且不含肉毒桿菌毒素復(fù)合物的復(fù)合蛋白質(zhì)的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分?？墒褂肁PF方法(利用2個管柱(IAPF)，例如相繼進行陰離子與陽離子色譜；或3個管柱(FAPF)，例如相繼進行陰離子和陽離子和疏水相互作用色譜)獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素，如A、B、C1、D、E、F和G型肉毒桿菌神經(jīng)毒素。所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素優(yōu)選為A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物。在本發(fā)明的一個方面，所用發(fā)酵培養(yǎng)基的量可包括約2L至約75L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)選約2L至約30L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基。舉例來說，由所述方法獲得約100mg至約5克，優(yōu)選約100mg至約3克，更優(yōu)選約100mg至約1克生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素。舉例來說，每升所用發(fā)酵培養(yǎng)基可獲得約20mg至約100mg或約20mg至約80mg生物活性神經(jīng)毒素。發(fā)酵培養(yǎng)基可包含例如植物來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、酵母提取物和葡萄糖。舉例來說，發(fā)酵培養(yǎng)基包含約5％w/v或更少的植物來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在另一實施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基包含約2％w/v或更少的酵母提取物。在另一實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基包含約2％w/v或更少的葡萄糖。在一個具體實施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基包含約5％w/v或更少的植物來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、約2％w/v或更少的酵母提取物和約2％w/v或更少的葡萄糖，所述植物來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、酵母提取物和葡萄糖根據(jù)所引述的w/v百分比量呈任何比率。在一些實施方案中，發(fā)酵步驟進行約60小時至約80小時之間的時間。在一個實施方案中，提供用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的利用色譜的基本上APF方法，所述方法按序包括以下步驟，其中在基本上APF培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉毒梭菌細菌；接著在約2L至約75L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基中，更優(yōu)選在約2L至約30L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵來自所述培養(yǎng)基的肉毒梭菌細菌，其中所述基本上APF培養(yǎng)基和基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基中的至少一者包含植物蛋白；隨后通過移除發(fā)酵培養(yǎng)基中存在的細胞碎片收集發(fā)酵培養(yǎng)基并通過過濾濃縮所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基，并且通過添加緩沖液稀釋經(jīng)過濃縮的發(fā)酵培養(yǎng)基。緩沖后，進行第一接觸步驟，其中使經(jīng)過稀釋的所收集發(fā)酵培養(yǎng)基與陰離子交換介質(zhì)接觸，以便使生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素與陰離子交換介質(zhì)結(jié)合，接著從陰離子交換介質(zhì)洗提所捕捉的肉毒桿菌神經(jīng)毒素由此獲得第一洗提液，接著進行第二接觸步驟，其中使第一洗提液與陽離子交換介質(zhì)接觸以從第一洗提液移除雜質(zhì)，由此獲得第二洗提液；接著通過UF和/或DF對其進行處理；并且接著過濾經(jīng)過處理的第二洗提液，由此使用利用色譜的基本上APF方法獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素。舉例來說，從培養(yǎng)細菌到獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素完成所述方法的時間例如可在約50小時至約150小時之間，更優(yōu)選為約80小時至約120小時。在具體實施方案中，培養(yǎng)基包含不超過約4％w/v植物來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在另一實施方案中，培養(yǎng)基包含不超過約2％w/v酵母提取物，并且在另一實施方案中，培養(yǎng)基包含不超過約2％w/v葡萄糖。培養(yǎng)基可包含根據(jù)所引述的w/v百分比量任何比率的植物來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、酵母提取物和葡萄糖。在一個具體實施例中，培養(yǎng)基的pH值水平在培養(yǎng)步驟開始時可為約pH6.5至約pH8.0，優(yōu)選為約pH6.8至約pH7.6，更優(yōu)選為pH7.3。培養(yǎng)步驟可在厭氧培養(yǎng)室中在約33℃至約37℃的溫度下，優(yōu)選在約34.5℃下進行約8小時與約14小時之間、約10小時至12小時，優(yōu)選約11小時的時間。在一個具體實施例中，厭氧培養(yǎng)室可在其進行培養(yǎng)的工作空間中含有整合高效微粒過濾器。發(fā)酵步驟可在約33℃至約37℃的溫度下，優(yōu)選在35℃下進行約60小時與約80小時之間，優(yōu)選約72小時的時間。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，收集步驟可移除發(fā)酵培養(yǎng)基中所含的RNA和DNA的至少約80％，且陰離子交換介質(zhì)可移除所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基中所有可測量出來的剩余DNA和RNA(低于檢測極限)。在另一方面，收集步驟可進行約1小時與約3小時之間，優(yōu)選約2.5小時的時間。在具體實施例中，可進行收集步驟直至原始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的75％已被收集。在一實施方案的一個方面，濃縮步驟可進行約30分鐘與約2小時之間，優(yōu)選約0.75小時的時間。在另一方面，稀釋步驟將所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基再稀釋到收集步驟開始時發(fā)酵培養(yǎng)基的初始重量。第一接觸步驟可進行例如約4小時與約5小時之間的時間。在一個實施例中，在分光光度計讀數(shù)達到約150mAU或更大時從陰離子交換樹脂收集第一洗提液，直至280nm下的分光光度計讀數(shù)從峰頂降回至約150mAU。第二接觸步驟可進行約1小時與約3小時之間，優(yōu)選約2小時的時間。可在分光光度計讀數(shù)為約100mAU或更大時從陽離子交換樹脂收集此第二洗提液，直至例如分光光度計讀數(shù)從峰頂降回至約100mAU。通過濃縮和滲濾處理此第二洗提液的步驟可進行約1小時與約2小時之間，優(yōu)選約1.5小時的時間。在一個具體實施方案中，過濾步驟包括通過使第二洗提液通過生物負載降低過濾器使生物負載量降低。生物負載降低過濾器可具有約0.1μm至約0.3μm，優(yōu)選0.2μm的孔徑。在具體實施方案中，所述方法可在第二接觸步驟后進一步包括第三接觸步驟，其中使第二洗提液與疏水相互作用介質(zhì)接觸以便進一步從第二洗提液移除雜質(zhì)并由此獲得第三洗提液。此第三接觸步驟可進行約1小時與約3小時之間，優(yōu)選約2小時的時間?？稍诜止夤舛扔嬜x數(shù)為約50mAU或更大時從疏水相互作用介質(zhì)收集第三洗提液，直至例如分光光度計讀數(shù)從峰頂降回至約50mAU。在存在第三接觸步驟的情況下，對第三洗提液應(yīng)用濃縮和滲濾處理步驟并且進行約2小時與約4小時之間的時間。可相應(yīng)地通過使經(jīng)過濃縮和滲濾的洗提液(來自所利用的2個管柱或3個管柱方法)通過生物負載降低過濾使生物負載量降低。在具體實施方案中，所述方法進一步包括冷凍所獲得的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的步驟。在具體實施方案中，基本上APF培養(yǎng)基包括約100mL與約500mL之間的體積。特定培養(yǎng)步驟通過將約100μL與約500μL之間的含肉毒梭菌的APF工作細胞庫培養(yǎng)基引入基本上APF培養(yǎng)基中來起始。培養(yǎng)步驟接著可在厭氧培養(yǎng)室中例如在約34.5℃±1℃的溫度下進行至少約8小時，優(yōu)選約11小時。在一個實施例中，工作細胞庫培養(yǎng)基可具有每毫升工作細胞庫培養(yǎng)基至少約1×104個菌落形成單位，例如每毫升工作細胞庫培養(yǎng)基約1×105至約5×107個菌落形成單位的活細胞計數(shù)測定值，并且工作細胞庫中的肉毒梭菌細菌已進行選擇以便具有基本上均一的形態(tài)。在一個實施方案中，工作細胞庫培養(yǎng)基包含例如約20體積％甘油，如無菌甘油。工作細胞庫培養(yǎng)基可通過以下步驟來制備：(a)使肉毒梭菌細菌在含有約2％w/v大豆蛋白胨、約1％w/v酵母提取物和約1％w/v葡萄糖的APF培養(yǎng)基中在厭氧培養(yǎng)室中在約34.5℃±1℃的溫度下生長，直至在約540nm的波長下所測得培養(yǎng)基等份試樣的光學(xué)密度為約2.5±1.0AU；和添加甘油以獲得培養(yǎng)基中約20％的甘油濃度，由此獲得工作細胞庫?？赏ㄟ^例如在低于約-135℃下冷凍工作細胞庫來制備工作細胞庫的儲存形式。用于本發(fā)明的示例性方法中的工作細胞庫的儲存形式可在環(huán)境溫度下解凍并用于引發(fā)培養(yǎng)步驟。培養(yǎng)步驟可在厭氧培養(yǎng)室中，如優(yōu)選在工作空間中具有整合高效微?？諝?HEPA)過濾器的厭氧培養(yǎng)室/培養(yǎng)櫥中，在約33℃至約37℃的溫度下，優(yōu)選在約34.5℃下進行約8小時與約14小時之間，優(yōu)選約11小時的時間。發(fā)酵步驟可在約33℃至約37℃的溫度下，優(yōu)選在35℃下進行約20小時與約80小時之間，優(yōu)選約60小時至約80小時，更優(yōu)選約72小時的時間。所述方法可例如且在培養(yǎng)步驟前進一步包括通過使基本上APF培養(yǎng)基暴露于厭氧培養(yǎng)室的氛圍使所述培養(yǎng)基發(fā)生氧化還原的步驟。所述方法還可在發(fā)酵步驟前包括通過也使基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基暴露于厭氧培養(yǎng)室的氛圍使所述發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)生氧化還原的步驟。舉例來說，使基本上APF培養(yǎng)基發(fā)生氧化還原的步驟可在厭氧培養(yǎng)室中進行約10小時與約14小時之間的時間。類似地，使基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中發(fā)生氧化還原的步驟可在發(fā)酵步驟開始之前進行約10小時與約14小時之間的時間。在一個實施方案中，公開用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的包括色譜的APF方法，其按序包括以下步驟：將來自APF工作細胞庫的肉毒梭菌細菌添加至APF培養(yǎng)基中；在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述肉毒梭菌細菌；在APF發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵來自培養(yǎng)步驟的肉毒梭菌細菌直至發(fā)生肉毒梭菌細胞溶解；收集APF發(fā)酵培養(yǎng)基以提供收集的發(fā)酵培養(yǎng)基；通過過濾對所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基進行濃縮；通過添加緩沖液稀釋經(jīng)過過濾的發(fā)酵培養(yǎng)基以獲得經(jīng)過稀釋的發(fā)酵培養(yǎng)基；第一接觸步驟，其中使經(jīng)過稀釋的發(fā)酵培養(yǎng)基與捕獲色譜介質(zhì)接觸，其中所述捕獲色譜介質(zhì)是陰離子交換介質(zhì)；第二接觸步驟，其中使來自第一接觸的步驟的洗提液與精制色譜介質(zhì)接觸，其中所述精制色譜介質(zhì)是陽離子交換介質(zhì)，和過濾來自第二接觸步驟的洗提液，由此通過改良的APF方法獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在具體實施方案中，所述方法可進一步包括在第二接觸步驟之后且在過濾步驟之前進行第三接觸步驟的步驟，其中使來自第二接觸步驟的洗提液與疏水相互作用介質(zhì)接觸。肉毒梭菌溶解期可在發(fā)酵步驟開始后例如在約35小時與約70小時之間出現(xiàn)。發(fā)酵培養(yǎng)基可具有例如約2L與約75L之間，約2L與約30L之間，或約2L與20L之間的體積的發(fā)酵培養(yǎng)基。所述方法整體可進行約50小時至約150小時之間，更優(yōu)選約80小時至約120小時的時間。利用所述方法如此獲得的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素具有例如每毫克生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素約2.4×107至約5.9×107個單位的效力。根據(jù)一個方面，在發(fā)酵結(jié)束時，每升發(fā)酵培養(yǎng)基可獲得約40mg至約85mg肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在處理(過濾/色譜/過濾操作)的各種階段之后，每升發(fā)酵培養(yǎng)基可獲得約30mg至約60mg肉毒桿菌神經(jīng)毒素；每升發(fā)酵培養(yǎng)基可獲得約5mg至約25mg肉毒桿菌神經(jīng)毒素；每升發(fā)酵培養(yǎng)基可獲得約6mg至約20mg肉毒桿菌神經(jīng)毒素。作為一個實施方案，在發(fā)酵步驟開始時，可將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至約pH6.0與約pH8之間，優(yōu)選約pH6.8與約pH7.6之間，更優(yōu)選約pH7.3。作為另一實施例，還提供用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF色譜方法，所述方法包括以下步驟：獲得含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基；使所述培養(yǎng)基與陰離子交換色譜樹脂接觸以提供經(jīng)過純化的含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的洗提液；使所述洗提液與陽離子交換色譜樹脂接觸由此獲得經(jīng)過進一步純化的洗提液，和過濾所述經(jīng)過進一步純化的洗提液由此獲得從基本上APF色譜方法純化的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在特定配置中，可利用含有約600mL至約800mL陰離子交換色譜樹脂的陰離子色譜管柱。陰離子色譜管柱可具有例如約8cm至約10cm的直徑和管柱內(nèi)約9cm至約16cm的陰離子交換色譜樹脂床高度。發(fā)酵培養(yǎng)基流過陰離子交換色譜樹脂的流動速率可為例如每小時約140cm至每小時約250cm，或每小時約150cm至每小時約160cm。在另一方面，所述方法中可利用色譜管柱內(nèi)約150mL至約300mL的陽離子交換色譜樹脂，其中所述陽離子色譜管柱例如具有約5cm至約8cm的直徑和約5cm至約11cm的陽離子交換色譜樹脂床高度。所述方法可包括滲濾步驟和/或生物負載降低步驟中的至少一者。生物負載降低步驟可利用膠囊式過濾器。經(jīng)過純化的洗提液的滲濾優(yōu)選在生物負載降低步驟之前進行。在一個實施例中，在對經(jīng)過進一步純化的洗提液進行滲濾步驟之前或之后調(diào)整經(jīng)過滲濾的經(jīng)過進一步純化的洗提液的濃度，并使?jié)舛冉?jīng)過調(diào)整的經(jīng)過滲濾的經(jīng)過進一步純化的洗提液通過生物負載降低過濾器。所述方法可提供如利用小鼠LD50生物測定法所測定，效力為每毫克肉毒桿菌毒素至少約2.0×107個單位，如每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約2.4×107至約6.0×107個單位的所得肉毒桿菌神經(jīng)毒素。所述方法結(jié)束時每升發(fā)酵培養(yǎng)基可回收例如約4mg至約25mg肉毒桿菌毒素的示例性回收率。在另一個實施方案中，用于純化生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF方法可包括以下步驟：獲得約2L至約30L包含肉毒桿菌神經(jīng)毒素的APF發(fā)酵培養(yǎng)基；收集APF發(fā)酵培養(yǎng)基步驟以提供收集的APF發(fā)酵培養(yǎng)基；收集APF發(fā)酵培養(yǎng)基后進行陰離子交換色譜由此提供第一洗提液；使來自陰離子交換色譜的洗提液與陽離子交換色譜介質(zhì)接觸以進行陽離子交換色譜由此提供第二洗提液；和過濾來自陽離子交換色譜介質(zhì)的第二洗提液，由此獲得經(jīng)過純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，其中所獲得的經(jīng)過純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素具有每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約2.4×107至約5.9×107個單位的效力且獲得量可在每升所用APF發(fā)酵培養(yǎng)基約4mg至約25mg之間。本發(fā)明還包括用于制備活性成分是生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF藥物組合物的混配方法，其包括以下步驟：通過以下方式獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素：(i)提供基本上不含動物產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基；(ii)在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵肉毒梭菌細菌，和(iii)使用陰離子交換色譜介質(zhì)接著使用陽離子交換色譜介質(zhì)從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素；和接著混配所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素與至少一種適合賦形劑，由此制備基本上APF藥物組合物。在一個實施例中，所述方法包括通過冷凍干燥或凍干或真空干燥對所混配的肉毒桿菌神經(jīng)毒素與至少一種適合賦形劑進行干燥以獲得適用于運輸或儲存的形式的步驟，其中活性成分是生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素，其中發(fā)酵培養(yǎng)基包含從植物獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)物?？捎脕慝@得蛋白質(zhì)產(chǎn)物的植物可為大豆、玉米或麥芽、洋羽扇豆(Lupinuscampestris)的去苦味種子或其水解產(chǎn)物。所獲得肉毒桿菌神經(jīng)毒素可具有每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約2.0×107個單位至每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約6.0×107個單位之間的效力。肉毒桿菌神經(jīng)毒素選自由A、B、C1、D、E、F和G型肉毒桿菌神經(jīng)毒素組成的群組，優(yōu)選是A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在特定情況下，肉毒桿菌神經(jīng)毒素是以分子量為約150kDa且不含肉毒桿菌毒素復(fù)合物的復(fù)合蛋白質(zhì)的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分形式獲得。在具體實施方案中，適合賦形劑選自由以下組成的群組：白蛋白、人血清白蛋白、重組人血清白蛋白、明膠、蔗糖、海藻糖、羥乙基淀粉、膠原蛋白、乳糖、蔗糖、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、多糖、辛酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮和檸檬酸鉀。獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素可進一步包括使用疏水相互作用介質(zhì)接著使用陽離子交換介質(zhì)的步驟。在具體實施例中，在約20℃至約25℃的溫度下進行真空干燥。在一些實施方案中，在例如約70mmHg至約90mmHg的壓力下進行真空干燥。真空干燥的時間可為例如約4小時至約5小時。本發(fā)明的具體方面涉及提供可包含例如生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物的藥物組合物，且賦形劑選自由白蛋白、人血清白蛋白、重組人血清白蛋白、明膠、蔗糖、海藻糖、羥乙基淀粉、膠原蛋白、乳糖和蔗糖組成的群組，其中所述藥物組合物基本上不含核酸。在具體實施例中，提供包含生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素和至少一種賦形劑的藥物組合物，其中所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素具有每毫克生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素約2.0×107至約6.0x107個單位之間的效力，其中所述組合物在每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物中包含少于約12ppm核酸，優(yōu)選少于1ppm核酸。在一個具體實施方案中，用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF色譜方法按序包括以下步驟：在基本上APF培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉毒梭菌細菌持續(xù)約10小時與約12小時之間的時間，或直至培養(yǎng)基的生物量測量值達到在約540納米(nm)波長下的光學(xué)密度在約0.8AU與約4.5AU之間；在基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵來自所述培養(yǎng)基的肉毒梭菌細菌持續(xù)約65小時至約75小時之間的時間或直至在發(fā)酵結(jié)束時通過在約890nm的波長下使用在線生物量探測器測量發(fā)酵培養(yǎng)基的光學(xué)密度獲得的生物量測量值在約0.05AU與約0.7AU之間；收集所述發(fā)酵培養(yǎng)基持續(xù)約2.5小時，其中移除發(fā)酵培養(yǎng)基中的細胞碎片并且使發(fā)酵培養(yǎng)基的重量減至發(fā)酵步驟開始時其起始重量的約四分之三；通過切線流過濾將所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基濃縮至收集步驟開始時其起始體積的約四分之一；通過添加緩沖液稀釋經(jīng)過濃縮的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述濃縮和稀釋步驟進行約0.5小時至約2小時之間的時間，其中在濃縮期間使發(fā)酵培養(yǎng)基縮減至收集步驟開始時其起始重量的約四分之一，且接著通過添加緩沖液再稀釋至收集步驟開始時的其最初起始重量；使經(jīng)過稀釋的發(fā)酵培養(yǎng)基與用于捕捉生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的捕獲色譜介質(zhì)接觸約4至約5小時的時期；使來自所述捕獲色譜介質(zhì)的洗提液與用于進行第一次精制操作以從其中移除雜質(zhì)的第一精制色譜介質(zhì)接觸約1.5小時至約2.5小時的時期；通過使來自所述精制色譜介質(zhì)的洗提液流過疏水相互作用介質(zhì)持續(xù)約1.5小時至約2.5小時的時期進行第二次精制操作；通過滲濾處理來自所述疏水相互作用介質(zhì)的洗提液持續(xù)約1小時至約4小時的時期；和利用生物負載降低過濾器過濾所述經(jīng)過處理的洗提液持續(xù)約0.5小時，由此獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在另一方面，公開用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF色譜系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：用于培養(yǎng)肉毒梭菌細菌的第一裝置，所述第一裝置能夠容納基本上APF培養(yǎng)基；用于發(fā)酵已在第一裝置中培養(yǎng)的肉毒梭菌細菌的第二裝置，所述第二裝置能夠容納基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基；用于收集發(fā)酵培養(yǎng)基的第三裝置；用于對來自第三裝置的所收集培養(yǎng)基進行濃縮和稀釋的第四裝置；所述第四裝置包括切線流過濾(TFF)；用于對來自經(jīng)過濃縮和稀釋的培養(yǎng)基進行第一次純化的第五裝置，所述第五裝置包括陰離子交換色譜介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第一次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素；和用于對經(jīng)過第一次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行第二次純化的第六裝置，所述第六裝置包括陽離子交換色譜介質(zhì)，并且由此獲得經(jīng)過第二次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在一個具體實施方案中，所述系統(tǒng)可進一步包括用于通過對從第六裝置獲得的經(jīng)過第二次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行純化而進行進一步純化的第七裝置，其中所述第七裝置包括疏水相互作用介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第三次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。所述系統(tǒng)還可進一步包括具有過濾膜用于過濾來自第六或第七裝置的洗提液的第八裝置。在另一個實施方案中，直徑在約8cm與約15cm之間的色譜管柱含有陰離子交換色譜介質(zhì)并且所述陰離子交換色譜介質(zhì)例如在管柱中可具有約8cm與約15cm之間的床高度。在另一實施例中，所述系統(tǒng)的第四裝置包括在每小時約125cm與每小時約200cm之間的流動速率下操作的色譜管柱，并且所述管柱可具有約500mL與約1L之間的管柱體積。在一個方面，第五裝置可具有例如約50mL與約500mL的管柱體積和約8cm與約15cm的床高度。在一些實施例中，第五裝置的色譜管柱具有例如約2cm與約10cm的管柱直徑。第五裝置的色譜管柱可具有每小時約100cm與約200cm之間的示例性流動速率。所述系統(tǒng)的第七裝置可包括過濾膜。在另一個實施方案中，所述系統(tǒng)可進一步包括第九裝置，所述第九裝置包括用于提供厭氧氛圍的厭氧培養(yǎng)室，其中用于培養(yǎng)肉毒梭菌細菌的第一裝置容納于所述厭氧培養(yǎng)室中。此第九裝置優(yōu)選包括定位于其培養(yǎng)室/工作區(qū)內(nèi)的整合高效微粒空氣(HEPA)過濾器。所述系統(tǒng)的第二裝置(用于發(fā)酵)可包括至少一個用于探測氧化-還原電位或pH值或光學(xué)密度的探測器。在一個具體實施例中，至少一個一次性探測器選自由還原-氧化探測器、pH值探測器和濁度探測器組成的群組。所述系統(tǒng)的第八裝置可包括用于濃縮和緩沖液交換的切線流過濾裝置。在另一實施方案中，所述系統(tǒng)可包括第十裝置，所述第十裝置包括用于降低生物負載量的生物負載降低裝置。在一個實施例中，生物負載降低裝置包括孔徑大致在約0.1μm與0.3μm之間，優(yōu)選為0.2μm的過濾器。所述系統(tǒng)還可包括用于在獲得經(jīng)過第二次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素后用于儲存所述經(jīng)過純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的第十一裝置。在一個實施例中，此儲存裝置提供約-25℃至約-80℃之間的儲存溫度。在另一方面，通過具有以下步驟的APF方法提供生物活性肉毒桿菌毒素：提供基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基；在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵肉毒梭菌細菌；使用陰離子交換色譜介質(zhì)接著使用陽離子交換色譜介質(zhì)從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素，其中所獲得的生物活性肉毒桿菌毒素具有每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約2.0×107個單位至每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素約6.0×107個單位之間的效力。在一個實施方案中，所述方法進一步包括通過使用疏水相互作用介質(zhì)接著使用陽離子交換介質(zhì)進一步純化所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素的步驟。根據(jù)另一方面，提供利用包含根據(jù)本文中公開的方法獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的藥物組合物治療患者的病狀的方法。病狀可包括疾病、失調(diào)、疾患或美容畸形或外貌。在一個實施例中，治療患者的病狀的方法包括向所述患者施用治療有效量的包含肉毒桿菌神經(jīng)毒素和至少一種適合賦形劑的藥物組合物的步驟，其中所述肉毒桿菌毒素具有約1個單位≥約0.02皮克的效力，由此治療所述的患者的病狀。在一個具體實施例中，用于治療所述病狀的肉毒桿菌神經(jīng)毒素可通過以下方法獲得：在基本上APF培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉毒梭菌細菌；獲得含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基；使所述培養(yǎng)基與陰離子交換色譜介質(zhì)接觸以提供含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的經(jīng)過純化的洗提液；使所述洗提液與陽離子交換色譜介質(zhì)接觸由此獲得經(jīng)過進一步純化的洗提液，和過濾所述經(jīng)過進一步純化的洗提液由此獲得從基本上APF色譜方法純化的生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在一個實施方案中，包括用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基本上APF色譜系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括用于厭氧培養(yǎng)肉毒梭菌細菌的第一裝置，所述第一裝置能夠容納約200mL至約1L基本上APF培養(yǎng)基；用于厭氧發(fā)酵已在第一裝置中培養(yǎng)的肉毒梭菌細菌的第二裝置，所述第二裝置能夠容納約5L至約75L，或約2L至約75L，或約2L至約30L基本上APF發(fā)酵培養(yǎng)基并且包括至少一個選自由還原-氧化探測器、pH值探測器和濁度探測器組成的群組的一次性探測器；用于提供厭氧氛圍并且能夠容納第一裝置的第九裝置，所述第九裝置包括在培養(yǎng)室內(nèi)具有整合高效微粒空氣過濾器的厭氧培養(yǎng)室，其中所述培養(yǎng)室可容納用于厭氧培養(yǎng)肉毒梭菌細菌的第一裝置；用于收集發(fā)酵培養(yǎng)基的第三裝置；用于進行所收集培養(yǎng)基的濃縮和稀釋的第四裝置，用于對從第四裝置獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行第一次純化的第五裝置，所述第五裝置包括陰離子交換色譜介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第一次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素；用于對經(jīng)過第一次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行第二次純化的第六裝置，所述第六裝置包括陽離子交換色譜介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第二次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素；用于對經(jīng)過第二次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行第三次純化的第七裝置，所述第七裝置包括疏水相互作用介質(zhì)，由此獲得經(jīng)過第三次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素；和用于對經(jīng)過第三次純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素進行濃縮和緩沖液交換的第八裝置，所述第八裝置包括TFF膜。在具體實施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基包含不超過約5％w/v植物來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、不超過約2％w/v酵母提取物和不超過約2％w/v葡萄糖，并且其中在約72小時發(fā)酵步驟開始時發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值水平例如為約pH6.8至約pH7.6，優(yōu)選為約pH7.3。在一個實施方案中，所述方法可進一步包括使經(jīng)過進一步純化的洗提液與疏水相互作用介質(zhì)接觸以獲得含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的經(jīng)過甚至更進一步純化的洗提液的步驟。在一個具體實施例中，治療病狀的方法可使用作為分子量為約150kDa且不含肉毒桿菌毒素復(fù)合物的復(fù)合蛋白質(zhì)的肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。示例性施用步驟可選自由以下組成的施用途徑群組：肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腺內(nèi)、鞘內(nèi)、直腸、口服和透皮施用，并且肉毒桿菌神經(jīng)毒素選自由A、B、C1、D、E、F或G型肉毒桿菌毒素組成的群組。肉毒桿菌神經(jīng)毒素優(yōu)選是A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在一些實施例中，所述系統(tǒng)可促進可借以獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法，所述生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素可用作每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物包含少于約12ng核酸、優(yōu)選每毫克肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物包含低于約1ng核酸、更優(yōu)選具有不可測量出來的核酸(例如低于檢測極限)的藥物組合物的一部分。附圖圖1A是展示實施例1NAPF方法中的主要步驟的流程圖。圖1B是展示實施例2IAPF方法中的主要步驟的流程圖，其中捕捉和精制色譜步驟可利用2個管柱(陰離子交換接著為陽離子交換)或3個管柱(FAPF)(陰離子交換接著為陽離子交換接著為疏水相互作用管柱)。描述本發(fā)明是基于可通過使用簡單、快速并且經(jīng)濟的APF色譜系統(tǒng)和方法獲得高效力、高純度的生物活性梭菌神經(jīng)毒素(如肉毒桿菌神經(jīng)毒素)的發(fā)現(xiàn)。重要的是，使用我們的系統(tǒng)和方法可產(chǎn)生每1mg所獲得的經(jīng)過純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素包含1ng(或少于1ng)核酸(RNA和DNA)雜質(zhì)，甚至沒有動物來源的酶(如RNA酶和DNA酶)的經(jīng)過純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。舉例來說，使用我們的系統(tǒng)和方法可產(chǎn)生每毫克所獲得的經(jīng)過純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素包含少于約0.6ng核酸(RNA和DNA)雜質(zhì)的經(jīng)過純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素可以是A型肉毒桿菌毒素復(fù)合物，如300kDa、500kDa或900kDa(近似分子量)復(fù)合物或其混合物。所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素還可以是分子量為約150kDa的肉毒桿菌毒素型神經(jīng)毒性組分(即，沒有復(fù)合蛋白質(zhì))。肉毒桿菌神經(jīng)毒素可以是血清型A、B、C、D、E、F或G中的任一者或其混合物。另外，所述改良的系統(tǒng)和方法可與重組、雜交、嵌合或經(jīng)過修飾的肉毒桿菌毒素(輕鏈、重鏈或兩條鏈一起)結(jié)合實施。本發(fā)明的一個重要方面是使用陰離子交換(捕捉)介質(zhì)色譜，接著使用陽離子交換(精制)介質(zhì)色譜從已在其中發(fā)酵了肉毒梭菌細菌的APF發(fā)酵培養(yǎng)基純化肉毒桿菌神經(jīng)毒素。我們發(fā)現(xiàn)使用陰離子交換接著使用陽離子交換色譜介質(zhì)提供用于獲得高純度、高產(chǎn)率肉毒桿菌神經(jīng)毒素的有效且快速的方法。在先前認為使用陰離子交換色譜會對肉毒桿菌神經(jīng)毒素的凝膠顯帶型態(tài)具有不利影響，因此在肉毒桿菌神經(jīng)毒素的純化中不主張使用陰離子交換色譜。參見例如美國專利7,452,697第55欄第53-57行。本發(fā)明的另一重要方面在于如上所述其產(chǎn)生高純度肉毒桿菌神經(jīng)毒素(即，每毫克所獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素含≤1ng核酸)。本發(fā)明的另一重要方面在于，盡管已知的尚茨法需要若干周(即，通常為約18天至約22天)來培養(yǎng)、發(fā)酵和純化肉毒桿菌神經(jīng)毒素，但本發(fā)明范圍內(nèi)的系統(tǒng)和方法允許所有培養(yǎng)、發(fā)酵和純化步驟在一周或短于一周內(nèi)完成。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，所有培養(yǎng)、發(fā)酵和純化步驟可在六天或短于六天內(nèi)完成。在本發(fā)明的一更優(yōu)選實施方案中，所有培養(yǎng)、發(fā)酵和純化步驟可在約四天或短于四天內(nèi)(例如約80小時至約144小時內(nèi)或其間的時間/范圍內(nèi))完成。我們通過發(fā)展一種八步驟或九步驟方法(和用于實現(xiàn)所述方法的系統(tǒng))并且發(fā)現(xiàn)在一個具體實施方案中這八個或九個步驟各自可在下文所述的時期內(nèi)完成而發(fā)明了本發(fā)明的這種更優(yōu)選的快速實施方案：約8小時至約14小時進行培養(yǎng)；約60小時至約80小時進行發(fā)酵；約2.5小時進行收集；約2小時至約4小時進行濃縮和稀釋；約4小時至約6小時進行陰離子交換色譜(其包括用于洗提所捕捉的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的時間)；約2小時進行陽離子交換色譜；約2小時進行可選的第三次色譜步驟(即，疏水相互作用色譜)；約2小時至約4小時進行濃縮和滲濾；和約1/2小時進行進一步過濾。因此，完成本發(fā)明的8步驟或9步驟更優(yōu)選快速實施方案所需要的總時間為約75小時至約150小時。本發(fā)明更有效并且節(jié)省時間。在一個方面，我們的新方法利用預(yù)先選擇和確認的細胞系，并且因此去掉先前技術(shù)尚茨法中涂鋪和生長細胞、選擇和收集菌落以及對所收集的菌落進行逐步細胞系擴增(在細胞培養(yǎng)和發(fā)酵步驟之前)的步驟，所述擴增步驟需要培養(yǎng)和接著接種發(fā)酵培養(yǎng)基。在一個方面，本發(fā)明直接以培養(yǎng)預(yù)先選擇用于接種APF培養(yǎng)基的細胞開始，因此節(jié)省時間的方法步驟。通過實驗，我們發(fā)展出兩個色譜管柱(“IAPF”)和三管柱(“FAPF”/“FIAPF”)色譜系統(tǒng)和方法用于純化發(fā)酵培養(yǎng)基中所存在的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由肉毒梭菌細菌的APF發(fā)酵產(chǎn)生。重要的是，盡管APF發(fā)酵方法可以減少或消除來自用于培養(yǎng)和發(fā)酵梭菌細菌的培養(yǎng)基中作為養(yǎng)分的動物來源的產(chǎn)物(如酪蛋白和肉湯)，但已知的APF發(fā)酵方法之后通常進行一個或多個純化步驟，所述純化步驟會利用動物來源的產(chǎn)物，如酶DNA酶和RNA酶。我們用于純化APF發(fā)酵培養(yǎng)基中所存在的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的系統(tǒng)和方法不使用動物來源的酶。本發(fā)明可涵蓋將所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基(例如通過過濾進行澄清)加載到陰離子交換管柱(如來自AppliedBiosystems的50HQ陰離子交換色譜樹脂)上。在一個方面，可使用具有聚苯乙烯/二乙烯基苯基礎(chǔ)基質(zhì)和約50μm粒子直徑和約60-70的動態(tài)容量(BSAmg/ml)的強陰離子交換介質(zhì)。陰離子交換管柱捕捉梭菌神經(jīng)毒素(如肉毒桿菌毒素復(fù)合物)并且降低雜質(zhì)含量。發(fā)現(xiàn)陰離子交換管柱從所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基有效捕捉肉毒桿菌毒素復(fù)合物并且保留肉毒桿菌毒素復(fù)合物的生物活性，同時還分離與肉毒桿菌毒素一起存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的許多雜質(zhì)。使用適合緩沖液從陰離子交換管柱洗提所捕捉(結(jié)合)的梭菌神經(jīng)毒素。在本發(fā)明的一個兩管柱實施方案中，將來自陰離子交換管柱的洗提液(含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素)加載至陽離子交換管柱上以從雜質(zhì)進一步純化肉毒桿菌神經(jīng)毒素。陽離子交換管柱可以是來自AppliedBiosystems的20HS陽離子交換樹脂。在一個方面，可使用具有聚苯乙烯/二乙烯基苯基礎(chǔ)基質(zhì)和約20μm粒子直徑和約>75的動態(tài)結(jié)合容量(溶菌酶mg/ml)的強陽離子交換介質(zhì)。在本發(fā)明的一個三管柱實施方案(FAPF)中，將來自陽離子交換管柱的洗提液加載至疏水相互作用管柱(如來自GEHealthcare的PhenylSepharoseHP樹脂)上以進一步純化肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在一個方面，可使用粒度為約34μm的高度交聯(lián)瓊脂糖珠?；|(zhì)，其已經(jīng)用苯基進行衍生化并且具有約45的動態(tài)結(jié)合容量(胰凝乳蛋白酶原mg/ml)。在兩管柱或三管柱方法后，可進一步處理來自最后所用管柱的洗提液以獲得經(jīng)過高度純化的主體肉毒桿菌毒素復(fù)合物。色譜后處理步驟可包括通過超濾和滲濾進行濃縮和緩沖液交換、無菌過濾和制備經(jīng)過純化的肉毒桿菌毒素復(fù)合物的溶液而不是懸浮液(先前技術(shù))，所述溶液優(yōu)選是在檸檬酸鉀中，并且在一個實施例中，檸檬酸鉀的濃度是10mM并且pH值為約6.5。在某些優(yōu)選實施方案中，用于生長(厭氧培養(yǎng)和厭氧發(fā)酵)肉毒梭菌和制備肉毒桿菌毒素的培養(yǎng)基可包含基于大豆的產(chǎn)物來置換動物來源的產(chǎn)物，以便所用培養(yǎng)基基本上或完全不含動物來源的產(chǎn)物。培養(yǎng)步驟增加用于后續(xù)發(fā)酵的微生物的量。培養(yǎng)允許先前冷凍的休眠細菌重新恢復(fù)為活躍生長的培養(yǎng)物。另外，用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基的活微生物的體積和量對于從活躍生長的培養(yǎng)物獲得比從所儲存的非繁殖肉毒梭菌細胞庫獲得來說可以得到更精確的控制。因此，將APF培養(yǎng)基中的工作細胞庫的樣品解凍并且置于所選APF培養(yǎng)基中。獲得適合水平的細菌生長后，將培養(yǎng)基用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基。作為一個實施例，使用來自生長期的約1％至約5％或其間的量的具有肉毒梭菌的培養(yǎng)基接種發(fā)酵培養(yǎng)基。在大規(guī)模厭氧環(huán)境中進行發(fā)酵以產(chǎn)生最大量的微生物細胞(Ljungdahl等人,Manualofindustrialmicrobiologyandbiotechnology(1986),由Demain等人編著,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.第84頁)。或者，可通過將工作細胞庫的樣品直接添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中在發(fā)酵培養(yǎng)基中進行肉毒梭菌的生長。在先前技術(shù)中，肉毒梭菌在培養(yǎng)基中的生長通常以兩個階段進行，第一階段是細胞涂鋪、細胞群落生長、選擇和生長，接著的第二階段為接種培養(yǎng)基(通常是兩階段逐步擴增培養(yǎng)物)和接種發(fā)酵培養(yǎng)基和肉毒桿菌毒素制備。優(yōu)選培養(yǎng)基中任何階段的生長都不在用培養(yǎng)基中的最終生長物接種發(fā)酵培養(yǎng)基之前導(dǎo)致細胞溶解。因此，在本發(fā)明之前，在開始發(fā)酵步驟前采用約四天來培養(yǎng)肉毒梭菌細菌。根據(jù)本發(fā)明，我們能夠在僅8至14小時內(nèi)就完成所有培養(yǎng)，這是因為無需先前利用的涂鋪細胞的步驟、后續(xù)等待菌落在血液瓊脂板上生長的時間、從板選擇用于以小體積培養(yǎng)物(例如8-9mL)生長的菌落，所述培養(yǎng)物接著提供用于培養(yǎng)基的接種物。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，預(yù)先選擇的細胞直接用于接種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基用于接種借以最終純化肉毒桿菌毒素的全規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)基，因此去除了涂鋪、菌落形成、選擇和逐步擴增步驟，這些步驟先前用來生長用于接種培養(yǎng)基的細胞，所述培養(yǎng)基本身接著用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基?；趧游?非APF或“NAPF”)的培養(yǎng)基通常包括腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、細菌蛋白胨、NaCl和葡萄糖。本發(fā)明范圍內(nèi)的培養(yǎng)基是APF培養(yǎng)基。例如，可使用基于大豆的產(chǎn)物替代培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的BHI和細菌蛋白胨。優(yōu)選基于大豆的產(chǎn)物可溶于水并且包含水解大豆，不過肉毒梭菌可在含有不溶性大豆的培養(yǎng)基中生長。根據(jù)本發(fā)明可使用基于大豆的產(chǎn)物的任何來源。優(yōu)選大豆是水解大豆并且水解是使用非動物酶進行的。水解大豆或可溶性大豆的來源包括Hy-Soy(QuestInternational)、Soypeptone(Gibco)Bac-soytone(Difco)、AMISOY(Quest)NZsoy(Quest)、NZsoyBL4、NZsoyBL7、SE50M(DMVInternationalNutritionals)和SE50MK(DMV)。實施例以下實施例說明本發(fā)明的具體實施方案并且不欲限制本發(fā)明的范圍。除非在實施例中另外說明，否則“毒素”或“肉毒桿菌毒素”意謂分子量為約900kDa的A型肉毒桿菌毒素復(fù)合物。本文中公開用于純化分子量為約900kDa的A型肉毒桿菌毒素復(fù)合物的系統(tǒng)和方法完全適用于純化約150kDa、約300kDa、約500kDa以及其它分子量毒素、復(fù)合物、肉毒桿菌毒素血清型和肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分。實施例1用于獲得肉毒桿菌毒素的非APF(尚茨)法本實施例闡述用于獲得肉毒桿菌神經(jīng)毒素的先前技術(shù)尚茨法。所述方法為使用動物來源的培養(yǎng)基和試劑(即，牛血液瓊脂板用于培養(yǎng)、酪蛋白用于發(fā)酵培養(yǎng)基中和使用RNA酶和DNA酶進行肉毒桿菌神經(jīng)毒素純化)的非APF方法。圖1A是展示尚茨法的主要步驟的流程圖。尚茨法具有約16至20個主要步驟，對于生產(chǎn)規(guī)模工作來說使用115L發(fā)酵罐并且完成需要耗時約3周。尚茨法開始于將非APF肉毒梭菌母細胞庫(MCB)小瓶解凍至室溫，隨后進行四個培養(yǎng)步驟。首先選擇具有適合形態(tài)的菌落，將來自解凍MCB小瓶的等份試樣在預(yù)先還原的哥倫比亞血液瓊脂(CBA)板上劃線并在34℃±1℃下厭氧孵育30-48小時。其次，將所選菌落接種至含有酪蛋白生長培養(yǎng)基的9mL試管中在34℃保持6-12小時。具有最快速生長和最高密度的9mL試管的內(nèi)含物(生長選擇步驟)接著通過兩次逐步擴增厭氧孵育(第三和第四培養(yǎng)步驟)進一步培養(yǎng)，所述兩次逐步擴增厭氧孵育為在34℃下在600mL中孵育12-30小時至1L菌種培養(yǎng)瓶，接著在35℃下在含有酪蛋白生長培養(yǎng)基的15L至25L菌種發(fā)酵罐中培養(yǎng)6-16小時。這兩個逐步擴增培養(yǎng)在于水中含有2％酪蛋白水解產(chǎn)物(酪蛋白[奶蛋白質(zhì)]消化產(chǎn)物、1％酵母提取物和1％葡萄糖(右旋糖)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中在pH7.3下進行。逐步擴增培養(yǎng)之后在商業(yè)規(guī)模(即115L)生產(chǎn)發(fā)酵罐中在含酪蛋白培養(yǎng)基中在受控厭氧氛圍下在35℃下進一步孵育60-96小時。細菌的生長通常在24至36小時之后完成，并且在發(fā)酵步驟進行的約65至約72小時期間大部分細胞發(fā)生溶解并釋放肉毒桿菌神經(jīng)毒素。相信毒素因細胞溶解而釋放并且由培養(yǎng)基中存在的蛋白酶活化?？墒褂脝螌由疃冗^濾器制備培養(yǎng)基的濾液以移除總雜質(zhì)(即完整和破裂的細胞)，由此獲得清澈溶液，稱為經(jīng)過澄清的培養(yǎng)物。由經(jīng)過澄清的培養(yǎng)物收集肉毒桿菌神經(jīng)毒素通過在20℃下用3M硫酸使經(jīng)過澄清的培養(yǎng)物的pH值降至pH3.5以使原始毒素沉淀(酸化沉淀)來完成。接著通過超微過濾(微過濾)(稱為MF或UF)隨后進行滲濾(DF)濃縮原始肉毒桿菌神經(jīng)毒素(以達成體積減小)。微過濾步驟使用0.1μm過濾器。所收集的粗毒素或原始毒素接著轉(zhuǎn)移至消化容器中并且通過添加蛋白酶抑制劑苯甲脒鹽酸鹽使其穩(wěn)定。添加DNA酶和RNA酶來消化(水解)核酸。經(jīng)過水解的核酸和低分子量雜質(zhì)接著通過進一步UF和DF步驟加以移除。接著用pH6.0磷酸鹽緩沖液提取毒素，并且通過澄清移除細胞碎片。接下來按序進行三個沉淀步驟(冷乙醇、鹽酸和硫酸銨沉淀)。經(jīng)過純化的肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物(毒素批料)以磷酸鈉/硫酸銨緩沖液中的懸浮液形式在2℃至8℃下儲存。本實施例1尚茨(非APF)方法(包括收集和純化步驟)的完成耗時約兩周至三周。所得肉毒桿菌神經(jīng)毒素批料是由肉毒梭菌HallA菌株制得的900kDaA型肉毒桿菌毒素復(fù)合物的高品質(zhì)懸浮液，其比效力為2×107U/mg，A260/A278小于0.6且在凝膠電泳時具有獨特顯帶型態(tài)，并且適用于混配肉毒桿菌毒素藥物組合物。肉毒桿菌神經(jīng)毒素還可由美國專利7,452,697的實施例7中所述的APF非色譜方法獲得，所述完整APF非色譜方法(從培養(yǎng)開始至所有純化和處理步驟結(jié)束)的完成耗時約兩周至三周。獲得，肉毒桿菌神經(jīng)毒素還可由美國專利7,452,697的實施例16中所述的APF色譜方法獲得，所述APF色譜方法(從培養(yǎng)開始至所有純化和處理步驟結(jié)束)的完成耗時一周或更長的時間。實施例2用于獲得肉毒桿菌神經(jīng)毒素的APF兩管柱和三管柱色譜系統(tǒng)和方法我們開發(fā)了用于獲得高產(chǎn)率高純度肉毒桿菌神經(jīng)毒素的基于陰離子-陽離子色譜的快速APF系統(tǒng)和方法。本實施例2的方法僅具有8-10個主要步驟，出于生產(chǎn)目的(即，獲得克量的最終肉毒桿菌神經(jīng)毒素)使用20L發(fā)酵容器，并且完成所述方法的所有步驟(從起始培養(yǎng)至完成最終純化和毒素儲存)僅耗時4-7天，優(yōu)選約4至約6天。本文公開的系統(tǒng)中所用的裝置在下文論述。開發(fā)了兩種色譜介質(zhì)方法和三種色譜介質(zhì)方法并且在本文中闡述。兩種介質(zhì)方法相繼使用陰離子交換色譜和陽離子交換色譜。三種介質(zhì)方法相繼使用陰離子交換色譜和陽離子交換色譜和疏水相互作用色譜(HIC)。HIC移除其它雜質(zhì)，如49kDa雜質(zhì)(它證明是宿主細胞磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，如下文所論述)。制備工作細胞庫我們開發(fā)了一種新型的肉毒梭菌細胞庫(用于起始培養(yǎng)步驟)，其不使用哥倫比亞血液瓊脂板并且去除在培養(yǎng)前進行菌落選擇的需要，并且還消除了進行尚茨法逐步擴增試管培養(yǎng)和多次接種(培養(yǎng))步驟的需要。出于此目的，使用先前已建立的尚茨母細胞庫(MCB)來產(chǎn)生APF研究細胞庫(RCB)，從所述APF研究細胞庫產(chǎn)生新型APF母細胞庫(MCB)和后續(xù)工作細胞庫(WCB)。研究細胞庫(RCB)是從來自尚茨(NAPF)MCB的菌落制備。為從MCB小瓶去除動物來源的蛋白質(zhì)，將細胞在含有2％w/vSPTII(II型大豆蛋白胨)、1％w/v酵母提取物和1％w/v葡萄糖的APF培養(yǎng)基中洗滌兩次。將細胞在嚴格厭氧條件下使用模塊化氛圍控制系統(tǒng)(MACS)厭氧培養(yǎng)室涂鋪在APF培養(yǎng)基上。進一步擴增分離的菌落并且在含有約20％甘油的APF培養(yǎng)基中在-135℃下儲存。通過在無氧APF培養(yǎng)基(200mL，在厭氧培養(yǎng)室中還原最少12小時)中擴增RCB在GMP條件下制備APF-MCB，并且在MACS厭氧培養(yǎng)室中在34.5℃±1℃下(在60rpm下攪拌)培養(yǎng)直至培養(yǎng)物的OD540達到2.5±1.0AU。添加無菌甘油至所得培養(yǎng)物中至約20％的最終濃度，其后將混合物以每小瓶1毫升轉(zhuǎn)移至冷凍小瓶中(APF-MCB小瓶)。小瓶在液氮中速凍，并接著在低于-135℃下儲存。通過如上所述進行擴增在GMP條件下制備APF-WCB。表征所得APF細胞庫的特性、純度、活力和遺傳穩(wěn)定性。上游步驟(培養(yǎng)和發(fā)酵)本實施例2方法具有兩個大致階段：上游階段和下游階段。上游階段包括擴增起始細胞系(肉毒梭菌細菌在基本上APF培養(yǎng)基中生長和繁殖)、發(fā)酵、收集(移除細胞碎片)以提供經(jīng)過澄清的所收集的培養(yǎng)物，接著對其進行濃縮和稀釋。因此，在本實施例中，我們的兩管柱方法的九個步驟是培養(yǎng)、發(fā)酵、收集過濾、濃縮、捕捉(陰離子)色譜、精制(陽離子)色譜、緩沖液交換、生物負載降低和小瓶填充。上游階段包括在1L瓶中使用含有400mL經(jīng)過還原(在厭氧培養(yǎng)室中)的菌種APF培養(yǎng)基(2％w/vSPTII、1％w/v酵母提取物(高壓滅菌前用1N氫氧化鈉和/或1N鹽酸調(diào)整至pH7.3)、1％w/v無菌葡萄糖(在對培養(yǎng)基進行高壓滅菌后添加))的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基(菌種培養(yǎng)基)用400μL解凍的肉毒梭菌WCB接種。孵育/培養(yǎng)在34.5℃±1.0℃下在150rpm攪拌下在厭氧培養(yǎng)室中進行。當(dāng)培養(yǎng)基在540nm下的光學(xué)密度達到1.8±1.0AU時，將1L瓶的整個內(nèi)容物(約400mL)轉(zhuǎn)移至含有以1N氫氧化鈉和/或1N鹽酸在蒸汽滅菌后調(diào)整至pH7.3的APF發(fā)酵培養(yǎng)基的20L生產(chǎn)發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基由3.25％w/vSPTII、1.2％w/v酵母提取物、1.5％w/v無菌葡萄糖(滅菌后添加，例如在約122℃下滅菌0.5小時)構(gòu)成。溫度和攪拌分別控制為35℃±1℃和70rpm。氮氣層設(shè)定為12slpm并且頂空壓力設(shè)定為5psig以維持用于細胞生長的厭氧環(huán)境。發(fā)酵pH值和細胞密度分別利用pH值和在線濁度探測器監(jiān)測。生產(chǎn)發(fā)酵的三個期包括指數(shù)生長期、靜止期和自溶期。據(jù)觀察，將活性BoNT/A復(fù)合物釋放至培養(yǎng)基中細胞自溶總是在35小時與發(fā)酵結(jié)束之間的時間發(fā)生。在發(fā)酵結(jié)束時，將培養(yǎng)物冷卻至25℃以便進行收集。一旦將發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻到25℃，就通過深度過濾使細胞碎片與A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物分離，首先過濾通過5-0.9μm標稱滯留分級梯度預(yù)過濾器以移除細胞碎片，并且接著過濾通過帶正電荷的0.8-0.2μm標稱滯留分級梯度以移除DNA(移除多達約80％)。兩個過濾器在使用前都用20L注射用水(WFI)一起沖洗。進一步處理需要至少15L濾液，并且在處理中取樣完成后去除任何過量材料。如果不立即利用超濾進行處理，那么濾液在4℃下儲存。在生物安全柜(BSC)內(nèi)，使用來自GEHealthcare的中空纖維切線流過濾(TFF)膜將來自收集步驟的濾液從15L濃縮至5±0.5L。經(jīng)過超濾的材料接著用10mM磷酸鈉(pH6.5)緩沖液稀釋至20L的最終體積。此材料通過使用兩個管柱(陰離子接著陽離子)或三個色譜管柱(陰離子、陽離子并且接著疏水相互作用)進行純化。如果不立即進行純化處理，那么經(jīng)過稀釋并且經(jīng)過超濾的收集材料在4℃下儲存。在尚茨法中，基于培養(yǎng)物生長的時間和可見觀察結(jié)果結(jié)束培養(yǎng)步驟和開始發(fā)酵步驟。相比之下，在本實施例2方法中，培養(yǎng)步驟結(jié)束時間的確定是基于對培養(yǎng)物流體光學(xué)密度的分析，此確保培養(yǎng)物在發(fā)酵步驟開始時是處于對數(shù)生長期，并且允許將培養(yǎng)步驟的持續(xù)時間減至約8小時至約14小時。我們根據(jù)OD參數(shù)終止培養(yǎng)步驟使得所培養(yǎng)細胞的健康程度達到最強并且促進由發(fā)酵步驟產(chǎn)生穩(wěn)固并且豐富的肉毒桿菌毒素。培養(yǎng)基在培養(yǎng)結(jié)束時的平均光學(xué)密度(在540nm下)為1.8AU。發(fā)酵步驟的平均持續(xù)時間為72小時，并且發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵步驟結(jié)束時的平均最終濁度(A890)為0.15AU。發(fā)酵步驟結(jié)束時20L發(fā)酵培養(yǎng)基(全肉湯)中所存在的A型肉毒桿菌毒素復(fù)合物的平均量(如利用ELISA所確定)為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基約64μgA型肉毒桿菌毒素復(fù)合物。收集步驟使用深度過濾以移除細胞碎片和核酸，接著進行超濾和稀釋來制備用于所述方法中的下一步驟的發(fā)酵培養(yǎng)基。此收集/細胞碎片清除在根本上不同于尚茨收集方法，所述尚茨收集方法使用酸化沉淀，接著進行微過濾和滲濾以濃縮和交換制劑中的緩沖液以供進行進一步處理。下游步驟(純化)下游步驟包括將肉毒桿菌神經(jīng)毒素捕捉于陰離子交換管柱上，從所述管柱洗提和通過在陽離子交換管柱上精制進一步與雜質(zhì)分離，并且優(yōu)選(在三管柱方法中)使含有所要肉毒桿菌神經(jīng)毒素的洗提液通過第三管柱(優(yōu)選疏水相互作用管柱，例如色譜)，接著使用切線流過濾(TFF)進行濃縮和緩沖液交換，和進行生物負載降低(例如通過使用0.2μm過濾器進一步過濾)制成針對冷儲存(優(yōu)選冷凍)優(yōu)化的最終A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物，和最終混配成A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物藥物組合物。色譜和過濾階段的順序意欲移除與產(chǎn)物和方法有關(guān)的雜質(zhì)、移除潛在外源因子和控制最終A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素的A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物濃度和緩沖基質(zhì)以便提供更穩(wěn)定的藥品。所進行的三管柱下游處理的更詳細實施方案如下。使經(jīng)過澄清(稀釋)的超濾材料(20L，如上文所公開)通過50HQ陰離子交換色譜樹脂，從陰離子交換管柱洗提所捕捉的肉毒桿菌神經(jīng)毒素并接著流經(jīng)20HS陽離子交換色譜樹脂，使來自所述陽離子交換色譜樹脂的洗提液流經(jīng)PhenylSepharoseHP色譜樹脂。來自HIC管柱的洗提液進行100kDa切線流過濾，接著進行0.2μm過濾。將所得A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物冷凍以供儲存。在本實施例中，我們在下游處理的第一色譜步驟中使用填充至內(nèi)徑為約8cm且管柱高度為約15cm的管柱中的50HQ陰離子交換色譜樹脂。整個50HQ管柱操作在環(huán)境溫度下完成，并且流動是按向下方向。使用pH值步進變化從陰離子管柱洗提A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物，其中帶較多負電荷的組分(如核酸，例如DNA和RNA)和其它宿主細胞蛋白質(zhì)保持結(jié)合于陰離子交換管柱。陰離子交換步驟的詳情為：使用50HQ管柱，使用0.1N氫氧化鈉持續(xù)30分鐘的最短接觸時間(至少約3個管柱體積，每小時230cm)。管柱接著用50mM磷酸鈉(pH6.5)緩沖液(至少5個管柱體積)平衡。接下來將經(jīng)過澄清的經(jīng)過超濾和稀釋的材料(即，經(jīng)過處理的溶解產(chǎn)物APF發(fā)酵材料)以每小時230cm加載至50HQ陰離子交換管柱上，隨后以至少約20管柱體積的50mM磷酸鈉(pH6.5)以每小時230cm洗滌直至管柱洗提液在280nm下的吸光度降至0.10AU，接著以50mM乙酸鈉(pH4.8)以每小時230cm洗提。當(dāng)280nm下的吸光度(A280)升至至少約0.15AU并且通過峰最大值直至在拖尾邊緣上等于或小于約0.2AU時，將產(chǎn)物池收集到含有1個管柱體積的50mM乙酸鈉(pH4.8)的容器中。此洗提池在約2℃至約8℃下儲存至多48小時。本實施例2的下游處理中的第二色譜步驟使用填充至內(nèi)徑為8cm且管柱高度為5cm的管柱中的20HS陽離子交換色譜樹脂。整個20HS管柱操作在環(huán)境溫度下完成，并且流動是按向下方向。A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物與20HS管柱樹脂結(jié)合。接著使用鹽步進變化從所述管柱洗提A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物。與產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)用洗滌緩沖液和去污溶液洗提。陽離子交換步驟的詳情為：使用20HS管柱，使用0.1N氫氧化鈉溶液持續(xù)30分鐘的最短接觸時間(至少約3個管柱體積，每小時230cm)。管柱接著用50mM乙酸鈉(pH4.8)緩沖液(至少約5個管柱體積)平衡。接下來將50HQ產(chǎn)物池(如上所述收集，新鮮或經(jīng)過冷藏)加載至20HS管柱上。管柱接著用50mM乙酸鈉(pH4.8)緩沖液(至少約3個管柱體積)洗滌并接著用50mM乙酸鈉、150mM氯化鈉(pH4.8)緩沖液再次洗滌。用50mM乙酸鈉、250mM氯化鈉(pH4.8)緩沖液以200mL/min從20HS管柱洗提A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物，當(dāng)A280升至約≥0.1AU通過峰最大值直至洗提峰拖尾邊緣的A280降至拖尾邊緣值≤0.1AU時，將洗提液轉(zhuǎn)移至生物處理收集袋(含有1個管柱體積的50mMNaH3C2O2，pH4.8)中。20HS產(chǎn)物池在環(huán)境溫度下在收集袋中儲存至多約6小時。在本實施例2的三管柱色譜介質(zhì)方法中，使來自第二(陽離子交換)管柱的洗提液通過HIC管柱。所用HIC管柱為填充至內(nèi)徑為約8cm且管柱高度為約5cm的管柱中的PhenylSepharoseHP疏水相互作用色譜樹脂。整個PhenylSepharoseHP管柱操作在環(huán)境溫度下完成，并且流動是按向下方向。接著使用遞減鹽步進變化從所述管柱洗提A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物。雜質(zhì)在加載期間用洗滌緩沖液和去污溶液洗提。疏水相互作用色譜步驟的詳情為：PhenylSepharoseHP管柱最初用0.1N氫氧化鈉溶液凈化30分鐘的最短接觸時間(用至少約3個管柱體積的0.1N氫氧化鈉溶液，以每小時200cm)。管柱接著用至少約5個管柱體積的50mM乙酸鈉、0.4M硫酸銨(pH4.8)緩沖液平衡。接下來將20HS(陽離子交換管柱)產(chǎn)物池(如上所述)按1:1與50mM乙酸鈉、0.8M硫酸銨(pH4.8)緩沖液合并并且加載至PhenylSepharoseHP管柱上。管柱首先用至少約3個管柱體積的50mM乙酸鈉、0.4M硫酸銨(pH4.8)緩沖液洗滌，并接著用50mM磷酸鈉、0.4M硫酸銨(pH6.5)緩沖液洗滌。用10mM磷酸鈉、0.14M硫酸銨(pH6.5)緩沖液從所述管柱洗提A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物。當(dāng)A280升至≥0.05AU時，將洗提液轉(zhuǎn)移至生物處理收集袋中。收集洗提液直至洗提峰拖尾邊緣的A280降至值≤0.05AU。PhenylSepharoseHP產(chǎn)物池在環(huán)境溫度下在收集袋中儲存至多約6小時。使用切線流過濾系統(tǒng)將PhenylSepharoseHP色譜步驟產(chǎn)物池濃縮并滲濾至藥品制劑緩沖液中。濃縮和滲濾步驟使用具有100kDa分子量截止膜的FiltronMinimate卡匣。經(jīng)過配制的材料接著通過PallMini0.2μm過濾器以降低潛在生物負載量。如先前所述，UF/DF步驟將PhenylSepharoseHP產(chǎn)物池(HIC管柱的洗提液)濃縮至0.7g/L的BoNT/A復(fù)合物濃度并用10mM檸檬酸鉀(pH6.5)緩沖液滲濾經(jīng)過濃縮的材料。所用超濾/滲濾方法的詳情如下。UF/DF單元和Pall100kDa聚醚砜膜最初用至少5L注射用水(WFI)沖洗以移除填充溶液并且用至少200mL1N氫氧化鈉溶液在再循環(huán)條件下凈化至少10分鐘，優(yōu)選至少30分鐘，以凈化UF/DF單元。接下來將膜和UF/DF系統(tǒng)用足夠體積的10mM檸檬酸鉀(pH6.5)配制緩沖液平衡直至滲透物和滯留物pH值為pH6.5。其后將PhenylSepharoseHP產(chǎn)物池加載至切線流過濾卡匣上并將HIC洗提液濃縮至0.7g/L。濃縮步驟后，滯留物池以至少5個滲濾體積的藥品配制緩沖液(10mM檸檬酸鉀，pH6.5)在7.5psig(磅/平方英寸表壓)的跨膜壓力下滲濾。接著封閉滲透物出口且UF/DF系統(tǒng)運行至少2分鐘，并且系統(tǒng)用50mL的10mM檸檬酸鉀(pH6.5)配制緩沖液沖洗。沖洗后，通過測量離線A278并且基于A278讀數(shù)測定滯留物池中BoNT/A復(fù)合物的濃度，用10mM檸檬酸鉀(pH6.5)緩沖液將滯留物池的濃度調(diào)整至0.5g/L。濃度經(jīng)過調(diào)整的滯留物池接著過濾通過PallMiniKleenpak0.2μm過濾器以降低潛在生物負載量。經(jīng)過過濾的濃度經(jīng)過調(diào)整的滯留物池在2℃-8℃下在收集袋中儲存至多2天。最終所獲得的經(jīng)過純化的A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物按每個小瓶700μL填充至1mL冷凍小瓶中并冷凍儲存。填充操作在100級生物安全柜中在環(huán)境溫度下進行。下游處理(包括使用2個或3個色譜管柱)僅在1至3天內(nèi)完成且所獲得的A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物在檸檬酸鉀(pH6.5)緩沖液中以0.5g/L的濃度作為溶液冷凍儲存。相比之下，先前技術(shù)尚茨下游(毒素純化)處理使用多個過濾、沉淀、提取和離心步驟來純化A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物并且需要1-2周來完成僅下游步驟，而且所得藥品(回收的肉毒桿菌神經(jīng)毒素)作為硫酸銨懸浮液以約2.7g/L的濃度冷凍儲存。使用色譜替代沉淀和處理時間減少得到顯著改良的一致下游處理，如本文所公開。根據(jù)一個方面，基于植物的產(chǎn)物(如基于大豆的產(chǎn)物)的濃度可以是培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的II型大豆蛋白胨或SE50MK(一種猶太人食用的大豆蛋白胨)。菌種培養(yǎng)基中的可在10-200g/L之間的范圍內(nèi)。菌種培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選在15-150g/L之間的范圍內(nèi)。菌種培養(yǎng)基中的濃度最優(yōu)選大致在約20-30g/L之間或為其間的量。菌種培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度可在0.1g/L與20g/L之間的范圍內(nèi)。葡萄糖的濃度優(yōu)選在0.5-15g/L之間的范圍內(nèi)。培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度最優(yōu)選為約10g/L。酵母提取物的量可為約5-20g/L，更優(yōu)選為約10-15g/L或其間的量。舉例來說，肉毒梭菌生長前培養(yǎng)基的pH值可為約pH7.0-7.5，或其間的值，優(yōu)選為pH7.3。舉例來說，生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的量可在10-200g/L之間的范圍內(nèi)。發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選在15-150g/L之間的范圍內(nèi)。發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度最優(yōu)選大致在約20-40g/L之間或為其間的量。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度可在0.1g/L與20g/L之間的范圍內(nèi)。葡萄糖的濃度優(yōu)選在0.5-15g/L之間的范圍內(nèi)或為其間的量。并非必然但如上所述，葡萄糖可連同發(fā)酵培養(yǎng)基的其它組分一起進行高壓滅菌。生長前發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值水平可為pH7.0-7.8，優(yōu)選為約7.0-7.5或其間的值，更優(yōu)選為pH7.3。如圖1的右手側(cè)所示，本實施例2中用于獲得生物活性肉毒桿菌神經(jīng)毒素的兩管柱APF方法包括以下步驟：(a)在菌種/培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細菌，如來自APFWCB小瓶的肉毒梭菌細菌，(b)接著在具有APF發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(毒素生產(chǎn)發(fā)酵罐)中發(fā)酵肉毒梭菌細菌以擴增細胞系，進行發(fā)酵和肉毒桿菌毒素生產(chǎn)直至達到所要細胞溶解期。接著，(c)收集(例如通過過濾進行澄清)APF發(fā)酵培養(yǎng)基以獲得收集的發(fā)酵培養(yǎng)基，(d)進行濃縮和稀釋獲得經(jīng)過稀釋的所收集的發(fā)酵培養(yǎng)基，使其(e)流經(jīng)捕捉管柱以移除雜質(zhì)，(f)使來自捕捉管柱的洗提液與精制管柱接觸以進一步移除雜質(zhì)，且任選與第二精制管柱接觸，(g)對精制管柱洗提液進行濃縮和緩沖液交換，(h)接著進行生物負載降低過濾和(i)填充小瓶。在一個實施例中，發(fā)酵體積是20L，所有步驟的總處理時間僅為4至6天，且獲得高肉毒桿菌神經(jīng)毒素產(chǎn)率。以下提供本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實施方案的更多細節(jié)。發(fā)酵步驟是在APF培養(yǎng)基中使用30L不銹鋼發(fā)酵罐進行。在以下本實施例中，使用少得多的發(fā)酵培養(yǎng)基體積，而仍以高產(chǎn)率獲得高效力A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物。通過使用以下方案，僅需要例如20L或更少的APF發(fā)酵培養(yǎng)基，而非先前對于獲得肉毒桿菌神經(jīng)毒素來說產(chǎn)生商業(yè)上適用量所需要的通常較大體積(例如115L)的發(fā)酵培養(yǎng)基。具有氣閘的MACS厭氧工作區(qū)(DonWhitley)提供用于操作厭氧生物體的缺氧環(huán)境。通過包括內(nèi)門和外門的舷窗系統(tǒng)進入和退出培養(yǎng)室。單元受到溫度控制以在培養(yǎng)室內(nèi)維持使用者的設(shè)置。恒濕控制冷凝板確保有效移除培養(yǎng)室內(nèi)的過量水分。培養(yǎng)室被照亮以便操作者使用和警示：低氣壓、連續(xù)氣流和缺少電力條件。培養(yǎng)室配備有HEPA過濾器以降低厭氧培養(yǎng)室中的有生命和無生命顆粒水平。厭氧條件利用“Anotox”和鈀去氧“D”催化劑氛圍洗滌系統(tǒng)維持。收集來自冷凝板的冷凝水并用管道輸送到外部儲集器，在外部儲集器中將其移除。如上文所公開，制備APFWCB使用APF方法，其中細胞庫小瓶在低于-135℃下儲存。在培養(yǎng)基接種前APFWCB細胞庫小瓶在室溫下解凍約15分鐘，隨后如上文所公開進行單一培養(yǎng)步驟以建立“菌種”培養(yǎng)物。此舉在模塊化氛圍控制系統(tǒng)中始終利用無菌技術(shù)進行以便使生物負載量最低。模塊化氛圍控制系統(tǒng)在用APFWCB小瓶內(nèi)容物接種完成的菌種培養(yǎng)物之間加以清潔。使用1N鹽酸和1N氫氧化鈉(用于調(diào)整pH值)、無水D(+)葡萄糖(MallinckrodtBaker，目錄號7730，4.00g)、II型大豆蛋白胨(SPTII)(Marcor，目錄號1130，8.00g)、400.0mL注射用水(WFI)和酵母提取物(YE)(BD目錄號212730，4.00g)制備培養(yǎng)基。用500mL量筒測出300mLWFI制備II型大豆蛋白胨和酵母提取物溶液并且傾入菌種培養(yǎng)瓶中。菌種培養(yǎng)瓶置于攪拌器上并啟動攪拌器。添加8.00gSPTII和4.00g酵母提取物至菌種培養(yǎng)瓶中并進行混合直至溶解。如果混合后溶解未完全，那么在較低溫度設(shè)置下加熱混合物。測量pH值并調(diào)整至約7.30±0.05。用WFI將培養(yǎng)基溶液體積調(diào)整至約360mL。菌種培養(yǎng)瓶充分通氣以使蒸汽和氣體轉(zhuǎn)移。用100mL量筒測出約30mLWFI來制備10％葡萄糖溶液(w/v)并置于預(yù)先組裝好的葡萄糖添加瓶中，將所述添加瓶置于攪拌器上并啟動攪拌器。添加約4.00g葡萄糖至葡萄糖添加瓶中并進行混合直至溶解(必要時使用低溫加熱以便溶解)并且用WFI將葡萄糖溶液補足(quantitysufficient；qs)至40mL。接著用通氣蓋松散地蓋上所述葡萄糖添加瓶。葡萄糖和菌種培養(yǎng)瓶均在123℃高壓滅菌30分鐘以便滅菌。滅菌后，兩個物品均從高壓釜移出并放置在生物安全柜中進行冷卻。無菌冷卻后，將葡萄糖溶液的10％轉(zhuǎn)移至含有酵母提取物和大豆蛋白胨II溶液的菌種培養(yǎng)瓶中并進行混合，由此提供完成的菌種培養(yǎng)瓶。將此完成的菌種培養(yǎng)瓶放置于預(yù)先清潔的MACS中(其中放置準備好的厭氧指示器)。松開完成的菌種培養(yǎng)瓶的蓋子。接著將完成的菌種培養(yǎng)瓶置于MACS內(nèi)的攪拌板上(攪拌板啟動至約150rpm)并且完成的菌種培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基在約34.5℃+/-1℃下在MACS內(nèi)還原至少12小時，其后取出1mL培養(yǎng)基空白作為樣品用于光學(xué)密度測量(用于在540nm下測定生物量)。然后，接種MACS(厭氧)中的完成的菌種培養(yǎng)瓶。APFWCB培養(yǎng)小瓶是從冷凍細胞庫獲得并帶進MACS中。小瓶解凍約10-15分鐘，隨后將約400μL小瓶內(nèi)容物直接置于完成的菌種培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基中。完全松開完成菌種培養(yǎng)瓶上的蓋子并將所述蓋子擱置在所述瓶子的頂部且將攪拌速度設(shè)置為150rpm。在MACS孵育至少約11小時之后，如下文所述進行發(fā)酵生產(chǎn)。檢查和校準發(fā)酵罐(如30L不銹鋼發(fā)酵罐)的探測器(例如氧化還原探測器、pH值探測器、濁度探測器，例如來自BroadleyJames和Optek)，并插入其相應(yīng)發(fā)酵罐端口并適當(dāng)緊固。例如，發(fā)酵罐可以是由30L容積發(fā)酵罐容器、攪拌器驅(qū)動系統(tǒng)、用于設(shè)施連接的管道總成(CIP、清潔蒸汽、CDA、氮氣、氧氣、處理冷卻水、生物廢料和廠蒸汽)、儀器(pH值、溫度、壓力、氧化還原、光學(xué)密度和質(zhì)量流量)和四個蠕動泵組成的ABEC30L(VT)發(fā)酵罐系統(tǒng)?？墒褂肁llen-Bradley可變頻率驅(qū)動器(VFD)控制底部安裝的攪拌器的速度。系統(tǒng)的半自動和自動控制由Allen-BradleyControlLogixPLC根據(jù)編程操作。系統(tǒng)設(shè)計成在發(fā)酵操作期間提供培養(yǎng)物溫度、壓力、pH值和氧化還原作用的閉環(huán)PID(比例-積分-微分)控制。利用Allen-Bradley(開放式裝置級網(wǎng)絡(luò))進行控制和在滑軌上與裝置和感應(yīng)器通訊。對于無菌保持、平衡、運行和收集模式，利用以下設(shè)定點操作攪拌、溫度、壓力和氮氣層。對于無菌保持和平衡模式：控制參數(shù)設(shè)定點和范圍攪拌100rpm±10氮氣層12SLPM±2發(fā)酵罐壓力5psig±1發(fā)酵罐溫度35±1℃氧化還原-390至-150mV對于運行模式：對于收集模式：控制參數(shù)設(shè)定點和范圍攪拌150rpm±10氮氣層10SLPM±2初始發(fā)酵罐壓力0psig發(fā)酵罐溫度25±1℃為制備發(fā)酵培養(yǎng)基，需要的材料包括無水D(+)葡萄糖(MallinckrodtBaker，目錄號7730，300.0g)、II型大豆蛋白胨(SPTII)(Marcor，目錄號1130，650.0g)、注射用水(WFI，13L)和酵母提取物(YE)(BD目錄號212730，240.0g)以及標準天平、大玻璃瓶(例如20L)、玻璃瓶(5L)、量筒、攪拌棒和攪拌器。將約10LWFI連同攪拌棒添加至大玻璃瓶中。將大玻璃瓶置于攪拌器上并啟動攪拌器，其后添加約650.0gII型大豆蛋白胨以及約240.00gYE。用WFI將發(fā)酵培養(yǎng)基補足(quantitysufficient；q.s.)至13L并蓋上大玻璃瓶。接著通過添加約2LWFI至5L玻璃瓶(其中具有攪拌棒)中來制備10％葡萄糖溶液(w/v)。放置在攪拌器上并讓棒旋轉(zhuǎn)，將約300.00g葡萄糖添加至瓶中，并進行混合直至溶解。用WFI將葡萄糖溶液補足至3L并蓋上瓶子，由此提供10％葡萄糖溶液。將大玻璃瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基添加至發(fā)酵罐中并記錄蒸汽滅菌前的發(fā)酵罐體積，并將操作順序推進至發(fā)酵。在SIP(蒸汽滅菌(steaminplace))(122℃，+/-1℃)結(jié)束時，記下SIP后的發(fā)酵罐體積。將包括有管伸出的容器與串聯(lián)0.2μm過濾器(PALLCorp.)和蠕動泵的葡萄糖添加總成連接至發(fā)酵罐并對管線進行SIP并讓其冷卻。打開添加閥端口并添加約3L葡萄糖(過濾滅菌)，且向葡萄糖添加瓶中添加適量WFI(過濾滅菌)以將總發(fā)酵罐體積補足至20L且通過相同葡萄糖過濾器管線泵入發(fā)酵罐中。關(guān)閉添加閥端口。其后用無菌1N氫氧化鈉或1N鹽酸將生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至約pH7.3+/-0.05，需要時對添加管線進行SIP。此后，設(shè)定用于無菌保持的參數(shù)并保持約12小時，隨后進行接種。使用代謝物分析儀測量培養(yǎng)基的起始葡萄糖濃度并記錄葡萄糖濃度。如上所述，在菌種培養(yǎng)物孵育結(jié)束時(約11±1小時)，取1mL樣品用于進行光學(xué)密度(OD)測量。OD使用分光光度計在540nm下離線測量，并且如果記錄到OD值在適當(dāng)范圍內(nèi)，那么就將培養(yǎng)物用于發(fā)酵。相應(yīng)地將發(fā)酵罐濁度探測器歸零。將菌種接種物瓶從厭氧培養(yǎng)室?guī)е涟l(fā)酵罐和菌種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移總成(一種其中具有APF培養(yǎng)基的菌種容器，所述容器具有培養(yǎng)物接種物轉(zhuǎn)移管線以及可從PALLCorp.或Millipore獲得的無菌KleenpakTM連接器總成替代發(fā)酵罐的閥門)，并且固定連接至泵1的管道。使發(fā)酵罐壓力降至2psig并將菌種接種物瓶的整個體積泵至發(fā)酵罐中。在接種結(jié)束時，記錄來自發(fā)酵罐的在線吸光度單位(AU)，將發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)定為運行模式并記錄時間。接著進行發(fā)酵(發(fā)酵操作可進行約60小時至約80小時，優(yōu)選約68小時至約76小時，最優(yōu)選約72小時)，同時在例如24小時和48小時從發(fā)酵罐取樣，同時維持無菌條件。對至少一個在發(fā)酵期間取得的樣品進行的測試可包括(但不限于)例如離線光學(xué)密度測量、葡萄糖測量、ELISA、SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡。發(fā)酵結(jié)束時(結(jié)束時發(fā)酵肉湯體積為例如約18-19L)，可獲取樣品(用于進行測試，例如離線光學(xué)密度測量、葡萄糖測量、ELISA、SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡和DNA/RNA定量)。在發(fā)酵結(jié)束時，記錄在線光學(xué)密度、EFT(所消耗的發(fā)酵時間)和發(fā)酵結(jié)束時間，以及攪拌(rpm)、溫度(℃)、壓力(psig)和氮氣層(slpm)和氧化還原(mV)。接著，對生產(chǎn)發(fā)酵肉湯進行收集，即，生產(chǎn)發(fā)酵肉湯通過過濾進行澄清，由此例如收集到約15L濾液。發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為收集并準備用于澄清的過濾器總成(CUNO，3M過濾)，所述總成包括預(yù)過濾器、深度過濾器和至少一個壓力表。預(yù)過濾器和深度過濾器用約20L注射用水沖洗。沖洗后，將過濾總成連接至發(fā)酵罐的收集/排液端口。使發(fā)酵罐溫度降至約25℃，隨后開始發(fā)酵肉湯的澄清(記錄澄清起始時間、初始在線OD、初始pH值、初始溫度和初始發(fā)酵罐體積)。發(fā)酵罐中的壓力在過濾期間以約每10分鐘約1psi(磅/平方英寸)的速率升高，直至達到約6psi的壓力，此時保持壓力直至收集結(jié)束。此過濾器移除APF發(fā)酵培養(yǎng)基中約80％的RNA/DNA(其余基本上在稍后的色譜步驟期間移除，如下文所論述)，因此不再像從前依賴/使用RNA酶和/或DNA酶來從發(fā)酵肉湯移除移除所述組分。每收集2L濾液時監(jiān)測處理參數(shù)(如預(yù)過濾器入口壓力、深度過濾器入口壓力、發(fā)酵罐壓力、攪拌和濾液體積)，結(jié)束時記錄澄清結(jié)束時間和所收集濾液的體積。完成收集步驟后，對系統(tǒng)進行去污和清潔。濾液大玻璃瓶帶至BSC進行取樣，從其中取得約≤10mL濾液樣品用于進行離線OD測量和其它分析(例如ELISA、SDS-PAGE、DNA/RNA和蛋白質(zhì)印跡)。濾液接著進行超濾/稀釋。組裝切線流過濾器(TFF)單元總成。TFF單元用WFI以每分鐘約2L的優(yōu)選速率沖洗約90分鐘，且接著TFF單元通過以0.1N氫氧化鈉(再循環(huán))流過約60分鐘進行凈化，此后以1L10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)流過，接著以WFI沖洗約30分鐘。接著使來自收集步驟的濾液(約15L)通過TFF(此舉在生物安全柜中進行)，從而使濾液濃縮至約5L+/-0.5L(濃縮步驟以每分鐘約2L且在約5psig的跨膜壓力下進行)。可獲取滲透物的樣品并進行例如ELISA、dsDNA、SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡測試。濃縮至約5L+/-0.5L后，接著即用約15L經(jīng)過TFF以每分鐘約2L的速率無菌過濾的10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)將滯留物池稀釋至約20L。接著可再次獲取樣品并進行例如ELISA、DNA/RNA、SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡測試。超濾/稀釋材料(滯留物)在4℃下儲存。使用后，所有系統(tǒng)均使用1N氫氧化鈉或滅菌(蒸汽)溫度進行去污并進行清潔。使用以下材料、裝備和程序制備下文闡述用于示例性方法的溶液、緩沖液等，即用于純化從實施例2方法獲得的發(fā)酵培養(yǎng)基以便獲得經(jīng)過純化的A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物。所用示例性緩沖液(經(jīng)過0.2微米真空過濾器過濾并且其導(dǎo)電性以mS/cm測量用于記錄儲存)包括：10mM磷酸鈉，pH6.5；50mM磷酸鈉，pH6.5；50mM乙酸鈉，pH4.8；50mM乙酸鈉、170mM氯化鈉，pH4.8；50mM乙酸鈉、250mM氯化鈉，pH4.8；50mM乙酸鈉、1M氯化鈉，pH4.8；50mM乙酸鈉，pH4.0；和10mM檸檬酸鹽，pH6.5。以下為用于從實施例2方法純化和獲得A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素的操作的實施例。所有產(chǎn)物接觸部分設(shè)計和構(gòu)造成確保其不具反應(yīng)性和不具吸收性。另外，所有裝備設(shè)計成允許利用單次使用一次性系統(tǒng)或設(shè)計和構(gòu)造成便于按證明有效的方法進行凈化、清潔和去污。系統(tǒng)和滑軌設(shè)計成不與產(chǎn)物接觸，而流徑設(shè)計成為單次使用一次性的，包括色譜管柱和所有相關(guān)管道。色譜組件從AlphaBio獲得并且UF/DF組件從ScilogInc.獲得。所用色譜設(shè)置包括用于以可變速度驅(qū)動遞送溶液的蠕動泵、具有5個入口的入口閥歧管、具有一組3個自動閥的管柱閥歧管、具有3個出口的出口閥歧管、管柱流出物監(jiān)測(包括pH值、導(dǎo)電性和UV)、基于UV吸光度的峰收集和完成純化操作所需要的儀器和控制?？刂葡到y(tǒng)具有設(shè)計用于控制純化過程的軟件和硬件。指令和數(shù)據(jù)通過HMI(人機界面)終端輸入。操作者通過在HMI輸入指令起始所有自動處理功能并且監(jiān)測和調(diào)整處理參數(shù)(如進料流速率、壓力、導(dǎo)電性、pH值、UV吸光度和個別閥門位置)。UF/DF系統(tǒng)包括一個再循環(huán)泵、滲濾泵、2個天平和一個切線流過濾器(TFF)支架。再循環(huán)泵與3個一次性壓力感應(yīng)器和一個天平(定位于滲透物儲集器下方)接合以控制流動速率以便基于滲透物儲集器重量維持規(guī)定跨膜壓力和停止。滲濾泵與第二天平(定位于滯留物儲集器下方)接合以便基于維持滯留物儲集器的恒定重量來起始和停止。濃縮和稀釋來自收集步驟(收集不含動物蛋白質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基)的滯留物材料后，將所述材料加載至陰離子交換管柱上。以下為用于填充和測試適用于實施例2兩管柱方法中的陰離子交換管柱的程序。所有三個色譜步驟使用預(yù)填充管柱。首先，使進料材料(已進行超濾/稀釋的所收集的APF培養(yǎng)基)通過陰離子交換管柱(來自ABI的Poros50HQ，如上所述)。利用至少5個管柱體積(CV)的50mM磷酸鈉(pH6.5)來平衡陰離子交換管柱(在本實施例中為捕捉管柱)。平衡后，進行加載步驟，其中將進料材料(收集步驟后收集的發(fā)酵肉湯，例如約20L)以例如約200cm/hr的速率加載至陰離子交換管柱上。0.5管柱體積的所加載材料已通過陰離子交換管柱后，將流過(FT)池收集至容器(如聚醚砜容器)中，同時使毒素復(fù)合物結(jié)合于陰離子交換管柱材料。此步驟后接著為洗滌步驟，其中使至少約15個管柱體積的洗滌緩沖液(例如pH值為6.5的50mM磷酸鈉)通過陰離子交換管柱。當(dāng)在管柱出口處實時測得的UV降至低于或等于約80mAU時停止洗滌步驟。記錄洗滌緩沖液體積和流過/洗滌池體積，且取1mL的流過/洗滌池樣品并測試例如毒素濃度、核酸含量、全細胞蛋白質(zhì)、SDS-PAGE、qPCR、2DLC和ELISA。下一步驟為洗提步驟，其中將洗提緩沖液(例如50mM乙酸鈉，pH4.8)泵至陰離子交換管柱上。當(dāng)管柱出口處的實時UV讀數(shù)升至約150mAU或更高時，開始將洗提液收集至預(yù)填充有1CV洗提緩沖液(50mM乙酸鈉，pH4.8)的容器中。當(dāng)UV讀數(shù)降至小于或等于200mAU時(此時所收集的體積在約1至約2CV之間)，停止洗提液池的收集。接著使用1N氫氧化鈉對色譜系統(tǒng)進行去污和清潔。來自陰離子交換管柱的洗提液池接著準備用于添加至陽離子交換管柱上。記錄陰離子交換洗提液體積、pH值、導(dǎo)電性和進料溫度并用1CV的50mM乙酸鈉(pH4.8)稀釋來自陰離子交換管柱的洗提液池。流過陰離子交換管柱后，進行陽離子交換色譜操作。陽離子交換管柱(例如20HS)用至少5CV的平衡緩沖液(50mM乙酸鈉，pH4.8)平衡。平衡后，將經(jīng)過稀釋的來自陰離子交換管柱的洗提液池加載至陽離子交換管柱上并記錄總加載體積。在0.5管柱體積的所加載稀釋洗提液池已通過陽離子交換管柱后，收集流過(FT)池。進行陽離子交換管柱的第一次洗滌，其中使約3-5CV的50mM乙酸鈉(pH4.8)通過陽離子交換管柱(記錄所用第一洗滌緩沖液的體積)。進行第二次洗滌，其中抽吸約3CV的170mM氯化鈉、50mM乙酸鈉(pH4.8)通過管柱，將此洗提液收集至標記“洗滌2峰”的新容器中。當(dāng)UV讀數(shù)升至大于或等于50mAU時開始收集。收集1CV并記錄所用第二洗滌緩沖液體積。利用洗提緩沖液(例如含250mM氯化鈉的50mM乙酸鈉(pH4.8))從陽離子交換管柱洗提毒素復(fù)合物批料，所述緩沖液泵至陽離子交換管柱上。當(dāng)洗提的UV讀數(shù)達到至少約100mAU時，開始將洗提液收集至預(yù)填充有稀釋緩沖液(40mL的100mM磷酸鉀(pH6.8)和60mL的10mM檸檬酸鉀(pH6.5))的容器中。繼續(xù)從陽離子交換管柱收集洗提液直至UV讀數(shù)降至約100mAU或更低。記錄稀釋后洗提液的總體積。接著對陽離子交換色譜系統(tǒng)進行去污和清潔。從陽離子交換管柱洗提后，洗提液進行過濾。利用使用三個100KMWCO膜(SartoriusAG,Goettingen,Germany)彼此上下堆疊的切線流過濾(TFF)系統(tǒng)。記錄陽離子交換洗提液池初始體積，在滲濾/平衡和凈化溶液描述中也進行同樣的記錄。例如，滲濾溶液可為10mM檸檬酸鉀(pH6.5)并且凈化溶液可為0.1N氫氧化鈉。給系統(tǒng)設(shè)置連接上來自含有來自陽離子管柱(IAPF)或管柱(FAPF)的洗提液的儲集器的一個管，所述洗提液含有肉毒桿菌毒素，通過超濾泵頭部進入切線流過濾膜的入口。來自切線流過濾膜的滲透物出口的第二管連接至超濾(UF)滲透物容器。來自切線流過濾膜的滯留物出口的管緊固于滯留物儲集器，并且來自滲濾(DF)緩沖液通過滲濾泵頭部并且進入滯留物儲集器的第四管也加以緊固。通過用至少約720mL注射用水(WFI)沖洗膜對系統(tǒng)的儲存緩沖液進行沖洗，同樣對膜進行沖洗，其中滯留物作為廢料導(dǎo)出，其后膜用至少約4200mL注射用水進一步?jīng)_洗，其中滯留物再循環(huán)至儲集器。此后，通過用至少約200mL的1N氫氧化鈉沖洗膜來進行膜凈化(如果必要的話)，其中滯留物作為廢料導(dǎo)出，接著用至少約200mL的1NNaOH沖洗膜，其中滯留物再循環(huán)至儲集器，持續(xù)至少30分鐘。接著通過用平衡緩沖液(pH值為6.5的10mM檸檬酸鉀)沖洗膜進行平衡，其中滯留物作為廢料導(dǎo)出，直至滯留物和滲透物pH值在平衡緩沖液pH值的+/-0.2個單位以內(nèi)(例如在pH6.5的+/-0.2個單位以內(nèi))。測定材料(來自陽離子交換管柱的洗提液(產(chǎn)物池))的濃度，以了解稀釋度或濃度(示例性加工)是否適當(dāng)(示例性目標濃度可為約0.7mg/mL)。利用10mM檸檬酸鉀(pH6.5)完成稀釋。確定0.7mg/mL產(chǎn)物濃度的目標體積(目標體積＝(起始濃度/起始體積)/0.7mg/mL)。將產(chǎn)物池(來自陽離子交換管柱的洗提液(經(jīng)過相應(yīng)處理或未處理))加載至膜上并使系統(tǒng)(TFF系統(tǒng))在無背壓下再循環(huán)(其中滲透物出口封閉)至少2分鐘，其后緩慢打開滲透物閥，同時將滯留物背壓閥調(diào)整至約7psig的目標跨膜壓力。對于稀釋，添加10mM檸檬酸鉀(pH6.5)至目標體積，并移動至滲濾上而不進行超濾；濃縮時，開始超濾。對于滲濾：將滲透物收集至新容器中(目標滲濾體積為5×滲濾體積)并用至少5倍滲濾體積的10mM檸檬酸鉀(pH6.5)進行滲濾。以至少10分鐘的時間間隔收集滲濾處理數(shù)據(jù)(滲透物重量g/體積mL、入口壓力(psig)、滯留物壓力(psig)、滲透物壓力(psig)和跨膜壓力(psig))。對于再循環(huán)/和沖洗：在滲透物出口過濾器關(guān)閉下，系統(tǒng)在無背壓下再循環(huán)/操作至少2分鐘，并且系統(tǒng)用至少20mL的10mM檸檬酸鉀(pH6.5)沖洗。產(chǎn)物池包括滯留物和沖洗液。可從產(chǎn)物池獲得樣品并進行驗證分析，包括例如278nm下的UV、SDS-Page、LcHPLC。SE-HPLC、qPCR、RP-HPLC、Native-Page、AUC、鱟變形細胞溶解產(chǎn)物、蛋白質(zhì)印跡和ELISA測試。對于使用后清潔，將系統(tǒng)用1N氫氧化鈉沖洗，再循環(huán)至少10分鐘，此后系統(tǒng)用0.1N氫氧化鈉沖洗并在其中儲存0.1N氫氧化鈉。接著進行無菌過濾和填充以便儲存和等分神經(jīng)毒素批料。使用10mM檸檬酸鉀(pH6.5)進行濃度調(diào)整以根據(jù)沖洗后樣品將毒素濃度調(diào)整至約0.5mg/mL。如果毒素濃度低于約0.5mg/mL，那么無需進行濃度調(diào)整。使用無菌移液管，于各無菌15mL/1.5mL樣品管中制備10mL/0.75mL等份試樣。產(chǎn)物容器用手輕緩攪拌并將所需量的溶液(含有藥品批料，即肉毒桿菌毒素批料)轉(zhuǎn)移至各小瓶中。樣品在2℃-8℃冰箱中儲存最多5天或者將0.75mL濾液產(chǎn)物池轉(zhuǎn)移至冷凍小瓶中。冷凍小瓶在-70℃+/-5℃下儲存。實施例3混配方法適于施用于患者的藥物組合物可通過將從實施例2方法獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素與一種或多種賦形劑混配來制備。賦形劑可用于使肉毒桿菌神經(jīng)毒素在混配過程中和在使用前的后續(xù)儲存時期中穩(wěn)定。賦形劑還可充當(dāng)增積劑和/或用于向藥物組合物提供特定張力?；炫湫枰獜膶嵤├?方法獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的多倍稀釋，與一種或多種賦形劑(如白蛋白[如人血清白蛋白或重組人白蛋白]和氯化鈉)混合由此形成毒素組合物，和制備毒素組合物的儲存和運輸穩(wěn)定形式，如通過凍干、冷凍干燥或真空干燥組合物來制備。因此，將約1.5至1.9ng實施例2獲得的A型肉毒桿菌毒素復(fù)合物與0.5毫克重組人白蛋白(DeltaBiotechnologies)和約0.9毫克氯化鈉通過將這三種成分混合到一起隨后進行真空干燥來加以混配。真空干燥可在約20℃至約25℃下、在約80mmHg的壓力下進行約5小時，此時將用于進行此等組分的真空干燥的小瓶在真空下密封并加蓋，由此獲得具有約100個單位的A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物的小瓶。所得固體(粉狀)真空干燥產(chǎn)物在使用時用生理鹽水(0.9％)復(fù)原并用于治療具有各種適應(yīng)癥(如頸部張力障礙和多汗癥)的患者。凍干、真空和冷凍干燥制備所混配肉毒桿菌神經(jīng)毒素的儲存和運輸穩(wěn)定形式。在另一個實施例中，將約1.5-1.9ng的A型肉毒桿菌毒素批料與約0.5毫克人血清白蛋白(Baxter/Immuno、Octapharma和Pharmacia&Upjohn)和約0.9毫克氯化鈉通過將這三種成分混合在一起隨后進行真空干燥加以混配。示例性真空干燥可在約20℃至約25℃下、在約80μmHg的壓力下進行約5小時，此時將用于進行此等組分的真空干燥的小瓶在真空下密封并加蓋，由此獲得具有約100個單位的肉毒桿菌毒素的小瓶。所得固體(粉狀)真空干燥產(chǎn)物在使用時用生理鹽水(0.9％)復(fù)原并用于治療具有各種適應(yīng)癥(如頸部張力障礙和多汗癥)的患者。另外，肉毒桿菌毒素藥物組合物可含有例如人血清白蛋白和/或乳糖。在一個實施例中，可將約1.5-1.9ng的A型肉毒桿菌毒素批料與約125微克人血清白蛋白和2.5毫克乳糖混配并進行真空干燥、凍干或冷凍干燥以獲得例如儲存穩(wěn)定性。在另一實施例中，可將約1.5-1.9ng通過本文公開的方法獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素與約10mg海藻糖和約0.5mg血清白蛋白(如天然或重組人血清白蛋白)和任選約1毫克甲硫氨酸組合以提供約100個單位的肉毒桿菌毒素干燥產(chǎn)物。此組合物可進行凍干并在稍后在使用前用例如約1mL蒸餾水或無菌無防腐劑鹽水(0.9％注射用氯化鈉)復(fù)原。在具體實施例中，肉毒桿菌毒素藥物組合物可包括蔗糖，如在示例性制劑中具有約1.5-1.9ng通過本文公開的方法獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素與20％人血清白蛋白和蔗糖組合，所述組合物也可凍干以提供約100個單位的A型肉毒桿菌毒素，并且稍后用無防腐劑鹽水(體積為例如0.5mL至約8.0mL)復(fù)原。在一個具體實施例中，可將200個單位的肉毒桿菌神經(jīng)毒素與每毫升約10mg蔗糖和2mg人血清白蛋白組合，并且將所得組合物置于小瓶中并冷凍干燥，稍后在使用前用生理鹽水復(fù)原。另外，混配還可利用可通過本文公開的IAPF方法獲得的A型肉毒桿菌毒素復(fù)合物的神經(jīng)毒性組分(即，A型肉毒桿菌毒素復(fù)合物的約150kDa組分，不含復(fù)合蛋白質(zhì))。在從相關(guān)非毒性蛋白質(zhì)(例如HA、NTNH)純化約150kDa神經(jīng)毒性組分的一種方法中，通過Tse等(1982)(Goodnough,M.C.,1994,Thesis,UW,Wis.)的方法的修改形式從復(fù)合物的相關(guān)非毒性蛋白質(zhì)純化A型神經(jīng)毒素。通過我們的IAPF方法(其利用2管柱陰離子-陽離子或3管柱陰離子-陽離子-HIC步驟，如上文所論述)獲得肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物從DEAE-SephadexA50(SigmaChemicalCo.,St.Louis,Mo.)pH5.5管柱回收并通過每100mL添加39g固體硫酸銨使其沉淀。沉淀的毒素復(fù)合物通過離心進行收集，以25mM磷酸鈉(pH7.9)進行透析，并施加至用相同緩沖液平衡的DEAE-SephadexA50管柱上。使神經(jīng)毒性組分與復(fù)合物的非毒性蛋白質(zhì)分離，并用線性0-0.5M氯化鈉梯度從管柱洗提。經(jīng)過部分純化的神經(jīng)毒素組分在pH7.9下從DEAE-SephadexA50管柱回收，并以25mM磷酸鈉(pH7.0)透析。經(jīng)過透析的毒素于25mM磷酸鈉(pH7.0)中施加至SP-SephadexC50(SigmaChemicalCo.)上。污染材料在所述條件下不與管柱結(jié)合。純神經(jīng)毒素(約150kDa組分)用線性0-0.25M氯化鈉梯度洗提。約150-kDa純神經(jīng)毒素可通過金屬親和色譜、凝膠過濾或蛋白質(zhì)色譜的其它方法進行進一步純化。如上所述，此純神經(jīng)毒素(肉毒桿菌毒素復(fù)合物的約150kDa神經(jīng)毒性組分)可與上文所論述的各種賦形劑(例如血清白蛋白、蔗糖、乳糖、氯化鈉、海藻糖等)一起凍干、真空或冷凍干燥。通過我們的IAPF方法獲得的肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物批料可以眾多方式混配。公開各種肉毒桿菌毒素制劑的示例性專利，如美國專利No.6,087,327(公開用明膠配制的A型和B型肉毒桿菌毒素的組合物)；美國專利No.5,512,547(Johnson等)的名稱為"PharmaceuticalCompositionofBotulinumNeurotoxinandMethodofPreparation"于1996年4月30日頒予，并且要求包含白蛋白和海藻糖并且在37℃儲存穩(wěn)定的純A型肉毒桿菌制劑；美國專利No.5,756,468(Johnson等)在1998年5月26日頒予("PharmaceuticalCompositionsofBotulinumToxinorBotulinumNeurotoxinandMethodofPreparation")，并且要求包含硫烷基、白蛋白和海藻糖并且可以在25℃與42℃之間儲存穩(wěn)定的凍干肉毒桿菌毒素制劑；美國專利No.5,696,077(Johnson等)的名稱為"PharmaceuticalCompositionContainingBotulinumBComplex"于1997年12月9日頒予，并且要求包含B型復(fù)合物與蛋白質(zhì)賦形劑的冷凍干燥無氯化鈉B型肉毒桿菌復(fù)合物制劑；和美國專利申請公布第20030118598號(Hunt)公開使用各種賦形劑(如重組白蛋白、膠原蛋白或淀粉)來穩(wěn)定肉毒桿菌毒素(所有所述公布的美國專利申請或美國專利的全文以引用的方式并入本文)，均提供可用于混配由我們的IAPF方法提供的肉毒桿菌神經(jīng)毒素批料的各種適用制劑/賦形劑的實施例并且提供藥物組合物。所獲得的肉毒桿菌毒素復(fù)合物可在pH7-8緩沖液中以使非毒素復(fù)合物蛋白質(zhì)與肉毒桿菌毒素分子解離從離子交換管柱洗提，由此提供(取決于所發(fā)酵的肉毒梭菌細菌的類型)具有約150kDa分子量和1-2×108LD50U/mg或更高比效力的A型肉毒桿菌毒素神經(jīng)毒性組分；或具有約156kDa分子量和1-2×108LD50U/mg或更高比效力的經(jīng)過純化的B型肉毒桿菌毒素；或具有約155kDa分子量和1-2×107LD50U/mg或更高比效力的經(jīng)過純化的F型肉毒桿菌毒素。本發(fā)明提供許多益處。首先，實施例2的兩管柱和三管柱方法不再使用動物來源試劑和介質(zhì)(例如酪蛋白水解產(chǎn)物和哥倫比亞血液瓊脂板)，因此顯著降低患者暴露于朊病毒樣病原體或其它感染原的理論風(fēng)險。其次，實施例2的兩管柱和三管柱色譜方法(和相關(guān)系統(tǒng)和裝置)高度可再現(xiàn)，如由極佳批料間一致性所證明。此改良在需要用含肉毒桿菌毒素的市售化合物重復(fù)治療若干年的患者中轉(zhuǎn)變成更一致的臨床特征。對來自本文公開的IAPF方法(2管柱或3管柱)的藥品(肉毒桿菌神經(jīng)毒素)進行的分析研究揭示較低的蛋白質(zhì)和核酸雜質(zhì)負載量。此較低蛋白質(zhì)雜質(zhì)負載量轉(zhuǎn)變成較低免疫原性(抗體產(chǎn)生)風(fēng)險。另外，IPAF方法的純度提高轉(zhuǎn)變成通常與生物藥物有關(guān)的非特異性癥狀(例如鼻咽炎、上呼吸道癥狀、肌肉骨骼癥狀、頭痛等)的發(fā)生率較低。此外，此方法的規(guī)模縮小方面的改良降低實驗室和制造設(shè)施員工的BoNT/A暴露風(fēng)險。本發(fā)明的示例性優(yōu)勢包括例如：1.因為方法中沒有使用從動物來源(例如人或動物)獲得的組分或物質(zhì)，消除了DNA酶和RNA酶、哥倫比亞血液瓊脂板、酪蛋白的使用(例如在澄清/收集步驟期間替換為帶電過濾和現(xiàn)代色譜技術(shù)；直接用來自工作細胞庫的細胞接種培養(yǎng)基，即預(yù)先選擇細胞并在APF培養(yǎng)基中繁殖/維持；和培養(yǎng)瓶和發(fā)酵培養(yǎng)基替換為II型大豆蛋白胨作為蛋白胨源。)，因此安全性得到提高。2.每10L發(fā)酵培養(yǎng)基可獲得約50mg至約200mg之間的高品質(zhì)A型肉毒桿菌毒素。3.經(jīng)過純化的毒素批料是從穩(wěn)固、一致、可縮放、可驗證并且符合cGMP的方法獲得。穩(wěn)固意謂所述方法即使在一個或多個處理參數(shù)變化約±10％時也能夠再現(xiàn)。可再現(xiàn)意謂所述方法可再現(xiàn)地提供經(jīng)過純化的毒素的一致產(chǎn)率。符合cGMP意謂所述方法可容易地轉(zhuǎn)化成符合FDA所要求的當(dāng)前良好操作規(guī)范的制造方法。4.最終純化的肉毒桿菌毒素復(fù)合物的效力滿足或超過從尚茨法或經(jīng)過修改的尚茨法獲得的經(jīng)過純化的肉毒桿菌毒素復(fù)合物的效力(例如通過MLD50測定所測得)。5.用色譜步驟替換任何沉淀步驟來純化肉毒桿菌毒素復(fù)合物批料，此舉改良純化方法的特異性。6.經(jīng)過改良的新方法有利于減小規(guī)模，從而導(dǎo)致改良的操縱和達成大于95％的操作成功率(例如從利用110L-120L發(fā)酵培養(yǎng)基的典型體積縮減至約10L至約50L，甚至縮減至約2L至約30L發(fā)酵培養(yǎng)基或其間的量)。藥品批料的典型當(dāng)前生產(chǎn)規(guī)模是115L非APF發(fā)酵培養(yǎng)基，并且作為本發(fā)明的一個方面已縮減至20L發(fā)酵培養(yǎng)基。此規(guī)模縮減是因BoNT/A復(fù)合物的合成和細胞釋放以及整個純化步驟的總體產(chǎn)率得到優(yōu)化而成為可能，從而獲得與需要例如5×或甚至更多發(fā)酵體積(例如115L)的先前方法所獲得類似量的最終肉毒桿菌毒素批料(藥品)。此縮減的規(guī)模有利于更容易地管理發(fā)酵工作體積并因此使操作者暴露于BoNT/A復(fù)合物的潛在風(fēng)險降至最低，此為一個重要的操作和安全性優(yōu)勢。7.由于BoNT/A復(fù)合物的潛在致死性質(zhì)，因此在本文所公開的整個制造過程中實施封閉系統(tǒng)。不同于先前技術(shù)方法，根據(jù)本發(fā)明的方面生產(chǎn)的藥品材料在單元操作之間轉(zhuǎn)移期間不會暴露于環(huán)境；所有操作都完全封閉。8.本文公開的肉毒桿菌毒素批料制造方法的所有步驟都得到簡化而沒有犧牲制造期間藥品的特性、品質(zhì)、純度或效力。非APF方法中所用的多個步驟在經(jīng)過重新設(shè)計的IAPF方法中被去除，由此將生產(chǎn)時間從例如21天縮減至6天或更短的時間。9.呈冷凍溶液形式的肉毒桿菌毒素的儲存條件極大地提高藥品穩(wěn)定性。各種出版物、專利和/或參考文獻已在本文中引用，所述文獻內(nèi)容的全文以引用的方式并入本文。本文公開的本發(fā)明的各組替代要素或?qū)嵤┓桨覆粦?yīng)解釋為具限制性。各組成員可個別地提及和主張，或與所述組的其它成員或本文中發(fā)現(xiàn)的其它要素組合提及和主張。預(yù)期一個組的一個或多個成員可出于便利性和/或?qū)＠缘脑蚨ㄓ谝粋€組中或從一個組中刪除。此外，除非本文另外說明或上下文另外明顯沖突，否則本發(fā)明涵蓋上述要素的所有可能變化的任何組合。盡管本發(fā)明已關(guān)于某些優(yōu)選方法進行了詳細描述，但本發(fā)明范圍內(nèi)的其它實施方案、型式和修改是可能的。因此，上文權(quán)利要求書的精神和范圍應(yīng)不限于上文所述實施方案的具體描述。當(dāng)前第1頁1 2 3