本發(fā)明涉及一種親水結(jié)構(gòu)域蛋白基因，以及該基因編碼的蛋白，本發(fā)明還涉及所述基因和蛋白在保護(hù)酶活性及減少酶發(fā)生聚集中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：干旱、鹽堿、冷凍和氧化等逆境是制約生物生長(zhǎng)和發(fā)育的非生物脅迫因素。高度親水性蛋白作為極端響應(yīng)逆境脅迫的一個(gè)重要組成部分已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，該蛋白可能作為分子伴侶保護(hù)逆境脅迫下的細(xì)胞。然而，有關(guān)親水蛋白的抗逆保護(hù)機(jī)制仍不清楚。耐輻射異常球菌(DeinococcusradioduransR1)基因組中含有一類(lèi)親水蛋白，其中有一個(gè)編碼干燥脅迫相關(guān)的基因，但目前未見(jiàn)該基因在保護(hù)酶活和減少酶發(fā)生聚合方面的功能的研究報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是從DeinococcusradioduransR1基因組中發(fā)現(xiàn)具有酶保護(hù)作用的親水結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，耐輻射異常球菌DeinococcusradioduransR1中的Dhp蛋白(DR1172,登錄號(hào)：Q9RV58)的親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件下可保護(hù)酶的活性，并能減少酶發(fā)生聚集和阻止酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本發(fā)明表達(dá)了含有完整親水結(jié)構(gòu)域的核心蛋白((本發(fā)明命名為HD，8個(gè)保守基序)，并研究了HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件(液氮反復(fù)凍融和H2O2沖擊)下對(duì)酶的保護(hù)作用。本發(fā)明通過(guò)以下研究得到上述結(jié)果：1、Dhp蛋白HD親水結(jié)構(gòu)域分析：圍繞Dhp蛋白的抗逆保護(hù)功能，本研究對(duì)該蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：Dhp蛋白由298個(gè)氨基酸組成，分子量為30.9kDa，富含親水性氨基酸，親水氨基酸含量為61％，是一類(lèi)親水蛋白。與其它典型的親水蛋白質(zhì)比較，Dhp蛋白顯著的特點(diǎn)是含有一個(gè)親水結(jié)構(gòu)域(HD)，該結(jié)構(gòu)域親水氨基酸含量為63.9％，HD親水結(jié)構(gòu)域含有8個(gè)由11個(gè)氨基酸殘基組成的保守基序(motif)，兩個(gè)基序之間含有7aa或11aa的連接肽，預(yù)測(cè)該結(jié)構(gòu)域可能是Dhp蛋白發(fā)揮功能的核心區(qū)域。2、HD親水結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建：1)以本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pET28a-dhp為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的基因(hd)；2)將hd基因連接于pET28a表達(dá)載體上，構(gòu)建完整x基因重組質(zhì)粒pET28a-hd；3)將導(dǎo)入hd基因的重組質(zhì)粒pET28a-hd轉(zhuǎn)入受體大腸桿菌BL21中，獲得工程菌株BL-hd(見(jiàn)實(shí)施例2)。3、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與純化:實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在IPTG濃度為0.5mM、誘導(dǎo)溫度為16℃的條件下，可溶性目的蛋白條帶最清晰，蛋白表達(dá)量最大。用不同濃度咪唑洗脫液對(duì)樹(shù)脂上的融合蛋白進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，確定最合適的咪唑濃度洗脫液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HD蛋白在50mM咪唑處獲得較純的蛋白(見(jiàn)實(shí)施例3)。4、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件下對(duì)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)的保護(hù)作用：1)未加入待測(cè)樣品的MDH和LDH酶溶液為對(duì)照組，分別進(jìn)行脅迫處理(液氮反復(fù)凍融和H2O2沖擊)，測(cè)定MDH和LDH酶的活性；2)分別取10μL脅迫處理后的樣品，分別加入到600μL的反應(yīng)液中反應(yīng)1min，測(cè)定A340的吸收，根據(jù)A340吸收值的變化計(jì)算酶活變化率；此實(shí)驗(yàn)表明：HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件下能夠保護(hù)MDH和LDH酶活，減少酶活損失(見(jiàn)實(shí)施例4)。5、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融脅迫條件下可減少乳酸脫氫酶(LDH)發(fā)生聚集。1)未加入待測(cè)樣品的LDH酶溶液為對(duì)照組，分別經(jīng)反復(fù)凍融處理1、2、3次，測(cè)定LDH的聚合度；2)取200μL脅迫處理后的樣品，測(cè)定A340的吸收，根據(jù)A340吸收值的變化計(jì)算LDH的聚合度；此實(shí)驗(yàn)表明：HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融條件下能減少LDH發(fā)生聚集(見(jiàn)實(shí)施例4)。6、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融脅迫條件下可防止乳酸脫氫酶(LDH)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。1)未加入待測(cè)樣品為對(duì)照組，樣品依次反復(fù)凍融1次、2次和3次。2)樣品處理完后，立即加入終濃度為5μM的熒光探針ANS。使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品在410nm到590nm之間的熒光發(fā)射光譜(見(jiàn)實(shí)施例4)。本發(fā)明的效果體外酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在脅迫條件下均能夠保護(hù)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性。此外，通過(guò)測(cè)定蛋白聚合度及ANS熒光分析實(shí)驗(yàn)表明，在反復(fù)凍融處理?xiàng)l件下，HD蛋白可阻止LDH發(fā)生聚集，防止LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。表明：由11個(gè)氨基酸殘基組成的基序與其對(duì)酶保護(hù)能力有關(guān)。附圖說(shuō)明：圖1是HD親水結(jié)構(gòu)域和8個(gè)基序在Dhp蛋白中的位置；圖2是HD結(jié)構(gòu)域及序列比對(duì)示意圖，其中：a為Dhp蛋白HD結(jié)構(gòu)域簡(jiǎn)圖，其中第104-263位氨基酸殘基為HD結(jié)構(gòu)域；b為HD親水結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)，左邊方框內(nèi)為HD結(jié)構(gòu)域的8個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的基序，右邊方框內(nèi)為7個(gè)連接肽。對(duì)于基序序列分析發(fā)現(xiàn)，位于第3、4、6、7、8、10以及第11位置上的氨基酸為親水性氨基酸(黑色加粗表示)，親水氨基酸含量為61.36％，其他位置上的氨基酸為疏水性氨基酸。對(duì)于11個(gè)氨基酸組成的連接肽分析發(fā)現(xiàn)，位于第3、4、6、10以及11位置上的氨基酸為親水性氨基酸(黑色加粗表示)。圖3是HD親水結(jié)構(gòu)域示意圖：全長(zhǎng)HD蛋白(第104-263位氨基酸殘基序列)；圖4是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護(hù)液氮反復(fù)凍融條件下蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)的活性；圖5是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護(hù)不同濃度H2O2條件下蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)的活性；圖6是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護(hù)液氮反復(fù)凍融條件下乳酸脫氫酶(LDH)的活性；圖7是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白保護(hù)不同濃度H2O2條件下乳酸脫氫酶(LDH)的活性；圖8是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可防止液氮反復(fù)凍融條件下LDH發(fā)生聚集；圖9是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可阻止液氮反復(fù)凍融下LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。序列表說(shuō)明序列號(hào)在dr1172基因中的位置SEQIDNO.1hd基因第310-789位堿基SEQIDNO.2HD蛋白第104-263位氨基酸具體實(shí)施方式實(shí)施例1Dhp蛋白HD親水結(jié)構(gòu)域分析Dhp蛋白顯著的特點(diǎn)是含有一個(gè)親水結(jié)構(gòu)域(HD)，該結(jié)構(gòu)域親水氨基酸含量為63.9％，HD結(jié)構(gòu)域含有8個(gè)由11個(gè)氨基酸殘基組成的基序，在兩個(gè)基序之間含有連接肽，共7個(gè)連接肽，分別含有4個(gè)由11個(gè)氨基酸殘基組成和3個(gè)由7個(gè)氨基酸殘基組成。如圖1所示，對(duì)11個(gè)氨基酸殘基組成的基序分析發(fā)現(xiàn)，位于第3、4、6、7、8、10以及第11位置上的氨基酸為親水性氨基酸(親水氨基酸含量為61.36％)，其他位置上的氨基酸為疏水性氨基酸?；蛐蛄刑攸c(diǎn)為[ΦΦE/QXΦKE/QKΦXE/D/Q]，其中Φ為疏水氨基酸。對(duì)于11個(gè)氨基酸組成的連接肽分析發(fā)現(xiàn)(親水氨基酸含量為55.38％)，如圖2所示，位于第3、4、6、10以及11位置上的氨基酸為親水性氨基酸，對(duì)于7個(gè)氨基酸組成的連接肽分析發(fā)現(xiàn)，第2、4、6和第7位氨基酸為親水氨基酸。通過(guò)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)連接肽中保守氨基酸為纈氨酸(V)，推測(cè)該位點(diǎn)在連接肽中可能起著重要作用。實(shí)施例2HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建為了研究HD親水結(jié)構(gòu)域的保護(hù)功能，本研究對(duì)HD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行重組并分別構(gòu)建表達(dá)載體，根據(jù)8個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的基序在Dhp蛋白中的位置，我們將Dhp蛋白分為如圖3所示的結(jié)構(gòu)：核心蛋白HD(第104-263位氨基酸殘基序列)、以及重組蛋白2HD(含有兩倍的核心蛋白HD氨基酸序列)。以本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pET28a-dhp為模板，加入PCR特異性引物，擴(kuò)增完整的核苷酸序列：PCR反應(yīng)條件：98℃5min，[98℃30sec，64℃30sec，72℃1min]33個(gè)循環(huán)，72℃10min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。使用EcoRI/NdeI雙酶切DNA產(chǎn)物和pET28a載體，于4℃或16℃連接過(guò)夜。取10μL連接產(chǎn)物加到已經(jīng)化凍的50μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。輕輕混勻，置于冰上放置30min；42℃水浴熱擊60s后立即冰浴2min；加入600μL新鮮LB培養(yǎng)基，混勻后，37℃，200rpm培養(yǎng)1h。取200μL菌液涂于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，測(cè)序驗(yàn)證正確，將該重組質(zhì)粒分別命名為BL-hd。實(shí)施例3HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與純化(一)實(shí)驗(yàn)方法1、IPTG誘導(dǎo)HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)1)將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒BL-hd和BL-2hd菌株劃線活化。挑取單菌落于新鮮的(含卡那霉素50mg/mL)3mL的LB培養(yǎng)基中，37℃220rmp振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2)次日將種子液按1：100轉(zhuǎn)接于含Km(50mg/mL)20mL的LB培養(yǎng)基中，于37℃220rmp振蕩培養(yǎng)，OD600約0.6～0.8。3)加入終濃度分別為0.5、1.0、1.5mM的IPTG于16℃過(guò)夜(同時(shí)未加IPTG的作為空白對(duì)照)，誘導(dǎo)大腸桿菌進(jìn)行外源表達(dá)。4)分別取誘導(dǎo)后的菌液2mL，5,000rmp離心5min，收集菌體。將收集的細(xì)胞用NTA-0緩沖液進(jìn)行震蕩懸浮(1/20培養(yǎng)體積)，混勻，冰浴30min。5)加入終濃度為0.05％的TritonX-100，混勻，置于冰上15min。6)利用超聲波對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎。超聲波破碎時(shí)間為15min，破碎細(xì)胞頻率為每間隔2s，破碎3s。破碎后，置于冷凍離心機(jī)，12000rpm離心10min。7)吸取上清液進(jìn)行純化。2、His-HD親水結(jié)構(gòu)域融合蛋白的純化8)提前制備層析柱，加入2-3mLNTA樹(shù)脂于層析柱中，用10倍NTA體積的NTA-0Buffer進(jìn)行洗脫。9)將破碎后的細(xì)胞總蛋白加入到層析柱中，流速為每小時(shí)15mL，收集穿透部分。為增加純化效率，反復(fù)上樣3次。流出部分進(jìn)行SDS-PAGE分析。10)加入NTA-0緩沖液進(jìn)行洗脫，用量為5倍樹(shù)脂體積。收集液體用于檢測(cè)蛋白與樹(shù)脂的結(jié)合情況。11)分別加入5倍體積的NTA-20，NTA-50，NTA-100，NTA-200，NTA-500緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為每小時(shí)15mL。分別收集洗脫緩沖液，用于SDS-PAGE分析確定目標(biāo)蛋白在不同洗脫緩沖液中的分布情況。12)取少量分別加入5×蛋白上樣緩沖液混勻后于沸水浴中煮沸10min，12000rpm，10min。取10μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定最終洗脫濃度。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)對(duì)HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，最終確定最優(yōu)條件為IPTG終濃度0.5mM，16℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。HD蛋白在50mM咪唑處獲得較純的蛋白。實(shí)施例4HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白的功能研究實(shí)驗(yàn)(一)在逆境脅迫條件下對(duì)酶的保護(hù)作用1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白是否在逆境脅迫條件下對(duì)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中，所述逆境具體是液氮反復(fù)凍融、并用不同濃度H2O2處理。2.實(shí)驗(yàn)材料和方法樣品準(zhǔn)備：MDH(來(lái)自于豬心臟)、NADH和LDH(來(lái)自于兔肌肉)均購(gòu)自SIGMA公司；BSA為限制性?xún)?nèi)切酶中BSA(購(gòu)自NEB公司)。酶活測(cè)定所用溶液：(1)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)酶活測(cè)定所用溶液配制：MDH酶溶解液的配制(50mM磷酸鉀緩沖液)：取7.17mL1mol/LK2HPO4和2.83mL1mol/LKH2PO4混合后，加滅菌水定容至200mL，調(diào)pH至7.2。MDH酶反應(yīng)液的配制：稱(chēng)取0.00264g草酰乙酸和0.0142gNADH，加入150mM磷酸鉀緩沖液定容至100mL，配制成終濃度為0.2mM的草酰乙酸和0.2mM的NADH的磷酸鉀緩沖液。(2)乳酸脫氫酶(LDH)酶活測(cè)定所用溶液配制：LDH酶溶解液的配制：25mMTris-HCl，加滅菌水定容至500mL，調(diào)pH至7.5。LDH酶反應(yīng)液的配制：分別稱(chēng)取1.489g的氯化鉀，0.044g的丙酮酸鈉，0.02127g的NADH，加入25mMTris-HCl定容至200ml，配制成終濃度為100mM氯化鉀，2mM丙酮酸鈉和0.15mM的NADH，調(diào)pH至7.5。(3)酶活性的測(cè)定方法取10μl待測(cè)溶液加入到600μL底物中。紫外分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)體系在1min內(nèi)340nm處吸光值的減少。每個(gè)反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)3次。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4—7和表1-表4所示。在未處理時(shí)，MDH和LDH沒(méi)有受到影響，在經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融和H2O2處理后，MDH和LDH活性均有不同程度的降低，而加入HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白后保護(hù)MDH和LDH酶的活性。BSA是一種蛋白穩(wěn)定劑，對(duì)MDH和LDH也有一定的保護(hù)作用，但其保護(hù)作用遠(yuǎn)低于HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白對(duì)MDH和LDH酶的保護(hù)作用。從表1-4中MDH和LDH酶的活性，可看出HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融和H2O2條件下對(duì)MDH和LDH的保護(hù)作用。表1HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護(hù)液氮反復(fù)凍融條件下MDH的活性表2HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護(hù)不同濃度H2O2條件下MDH的活性表3HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護(hù)液氮反復(fù)凍融條件下LDH的活性表4HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護(hù)不同濃度H2O2條件下LDH的活性4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論：HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件下能夠保護(hù)MDH和LDH的活性。實(shí)驗(yàn)(二)HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在反復(fù)凍融條件下減少發(fā)生聚集的觀察1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白能否在液氮反復(fù)凍融條件下減少LDH發(fā)生聚集。2.實(shí)驗(yàn)方法LDH聚合度是使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品在340nm處的吸光值。170μL的LDH酶溶液，終濃度配成200μg/mL的測(cè)試溶液。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，LDH與蛋白的摩爾比為1：5。將酶溶液放入液氮中速凍1min，室溫復(fù)性，依次反復(fù)凍融1次、2次和3次，測(cè)定酶溶液在A340處的吸光值。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8和表5所示，在經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融處理后，LDH迅速發(fā)生了聚集，隨著凍融次數(shù)增加，LDH發(fā)生聚集的程度越高，而加入HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可顯著減少LDH發(fā)生聚集。BSA雖然也減少LDH發(fā)生一定程度的聚集，但保護(hù)能力比HD結(jié)構(gòu)域蛋白弱。表明HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可減少反復(fù)凍融處理下LDH酶發(fā)生聚集。表5HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融條件下減少LDH發(fā)生聚集4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論：Dhp蛋白HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融條件下能夠減少LDH發(fā)生聚集。實(shí)驗(yàn)(三)HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融脅迫條件下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的觀察1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白能否在液氮反復(fù)凍融條件下防止LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。2.實(shí)驗(yàn)方法熒光的變化是由于結(jié)合了熒光探針1-anilinonaphatalene-8-sulphonate(ANS，Sigma)。LDH孵育在25mMTris-HCl，pH7.5，終濃度為500nM。LDH與蛋白的摩爾比為1：5。未加入待測(cè)樣品為對(duì)照組。樣品反復(fù)凍融3次，待融化后立即加入終濃度為5μM的熒光探針ANS。使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品在410nm到590nm之間的熒光發(fā)射光譜。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果單獨(dú)的ANS在溶液中不發(fā)熒光，當(dāng)ANS與蛋白表面的疏水基團(tuán)結(jié)合后發(fā)出熒光。在LDH酶液中分別加入HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白，經(jīng)反復(fù)凍融處理3次后，檢測(cè)LDH酶的熒光變化。如圖9和表6所示，未處理的LDH、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白熒光強(qiáng)度較低，而經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融處理3次后，LDH熒光顯著增強(qiáng)，而加入HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白后，熒光強(qiáng)度有所不同程度的降低，表明HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可減少反復(fù)凍融處理下LDH酶結(jié)構(gòu)改變。表6HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可防止液氮反復(fù)凍融條件下LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融條件下能夠阻止LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3