本發(fā)明涉及一種脂肽類生物表面活性劑及其制備方法，具體地指一種Surfactin變異體。

背景技術：

糖尿病是繼心血管、癌癥之后致殘率、致死率最高的第三大嚴重威害人類健康的疾病。是一種主要由胰島素分泌缺陷或胰島素生物作用障礙引起，以慢性高血糖為特征的全身代謝性疾病。治療不當將會引發(fā)許多嚴重的并發(fā)癥如失明、心腦血管疾病、腎病綜合癥等。胰島素是治療胰島素依賴型糖尿病的首選藥物，也常用于II型糖尿病的輔助治療。作為治療糖尿病最有效和持久的的降糖藥，糖尿病患者需要長期注射胰島素，通常每天4次，帶來了諸多的不便和巨大的痛苦，因此人們一直致力于研制非注射型的胰島素制劑。非注射給藥的途徑有鼻腔給藥、直腸給藥、肺部給藥、眼部給藥、口服給藥等，其中口服給藥方便并易于被患者接受，給藥方式在藥動學上模仿生理性胰島素的分泌，有可能成為注射劑的替代劑型。

盡管口服是胰島素理想的給藥方式，但自從人類發(fā)現(xiàn)胰島素，這種給藥途徑一直未獲成功，主要問題在于：第一，胰島素為蛋白質(zhì)多肽類藥物，會受到胃酸環(huán)境和胃腸道蛋白酶的降解破壞作用，到小腸中又受到糜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白酶的降解；第二，胰島素分子量大，約為6000Da，且分子間很容易聚合成多聚體，導致其在胃腸道黏膜通透性低，難以通過擴散被胃腸壁的上皮細胞層吸收；第三，肝臟具有首過效應，使口服胰島素有一定的損失。以上原因?qū)е乱葝u素口服給藥的生物利用度很低，只有0.1～2％，無臨床價值。

為提高其生物利用度，口服胰島素的研發(fā)焦點集中在脂質(zhì)體、納米粒、乳劑、油相溶液及分子修飾、使用酶抑制劑和吸收促進劑等方面，具體來說：

(1)應用吸收促進劑，以促進藥物的吸收。吸收促進劑是能夠促進藥物尤其是大分子或吸收差的藥物通過生物屏障而被吸收的低分子量的化合物，可以調(diào)節(jié)小腸上皮細胞的緊密連接程度或者造成腸壁損傷以增加腸壁通透性、增加胰島素在腸道中的轉(zhuǎn)運效率。吸收促進劑可以分為四種類型：①鰲合劑，如EDTA、構(gòu)椽酸、水楊酸、膠原的N-乙酞衍生物、烯胺；②合成的表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯十六烷基醚；③天然的和半合成的表面活性劑，如膽酸鹽、去氧膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c；④脂肪酸及其衍生物，如辛酸鈉、癸酸鈉、月桂酸鈉、油酸等。

(2)應用酶抑制劑，保護其不被胃腸道中的酶破壞。在服用多肽和蛋白質(zhì)類藥物時，同時或預先服用酶抑制劑，或是將酶抑制劑與蛋白類藥物共同形成聚合物，可增加藥物的生物利用度。常用的酶抑制劑有：胰蛋白酶抑制劑、凝乳蛋白酶抑制劑和抑肽酶等。

(3)設計合理的給藥系統(tǒng)，如脂質(zhì)體、微粒和毫微粒等，以借助于這些載體或保護藥物免于酶類降解，或增加藥物的吸收。

有研究發(fā)現(xiàn)應用天然Surfactin能夠保護胰島素口服后在胃腸道中不被胃酸和蛋白酶降解，并且促進了胰島素的吸收，具有明顯的降血糖效果。但是，天然Surfactin促進胰島素口服后的吸收作用較慢，一般需2小時后才能表現(xiàn)出降糖效果，且控制餐后血糖的效果需要進一步提高，即需要進一步提高胰島素口服后的生物利用度和糖耐量水平。

口服劑型的研制成功，將是胰島素非注射劑型研究的革命性突破，并會產(chǎn)生進一步探討的理論價值和良好的商業(yè)價值。

隨著現(xiàn)代基因工程等高技術的發(fā)展，基因工程人胰島素將逐步取代動物胰島素，胰島素的研究會越來越深入，特別是口服胰島素等新的給藥方式的研究，是醫(yī)藥工作者面臨的迫切而又艱巨的任務。今后胰島素的新劑型、新給藥方法還將陸續(xù)出現(xiàn)，為糖尿病治療帶來更大的方便，糖尿病治療的前景廣闊而光明。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是要克服現(xiàn)有天然Surfactin在促進藥物(如胰島素)吸收時作用較慢的缺陷，提供一種經(jīng)化學合成的方法得到的Surfactin變異體，適用于制備胰島素口服制劑，具有高效性、良好的安全性、性質(zhì)穩(wěn)定、使用方便，能起到較迅速且較好的降血糖作用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設計的Surfactin變異體，其特征在于：所述Surfactin變異體是將天然Surfactin的氨基酸序列中原亮氨酸部分或全部替換為異亮氨酸；

或?qū)⒃涟彼岵糠只蛉刻鎿Q為纈氨酸；

或?qū)⒃i氨酸部分或全部替換為異亮氨酸；

或上述三種替換方式的組合。

經(jīng)過發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，通過將Surfactin變異體中非極性氨基酸替換為非極性更強的類別可以提高Surfactin變異體在細胞膜上的通透性?？赡苡捎诩毎橹|(zhì)結(jié)構(gòu)，變異體的非極性增加有利于其肽環(huán)插入細胞膜。

優(yōu)選地，所述天然Surfactin的氨基酸序列中氨基酸的替換數(shù)量為2個及以上。

進一步實驗中，發(fā)現(xiàn)Surfactin變異體的改造進行時替換的氨基酸數(shù)量為2個以上時的效果更好。

優(yōu)選地，所述Surfactin變異體包含的脂肪酸鏈長度為12～16個碳原子。

優(yōu)選地，上述Surfactin變異體包含的脂肪酸鏈長度為13個碳原子。

本發(fā)明還提供了多個具體Surfactin變異體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1～8中任一項所示。

本發(fā)明還提供了上述Surfactin變異體在制備腸溶性要物制劑中的應用。需要說明的是，雖然本發(fā)明只公開了Surfactin變異體與胰島素在制備口服制劑方面的具體實施方式，但是Surfactin變異體是可以應用于其他同類型具有首過效應的藥物。

本發(fā)明還提供了上述Surfactin變異體在制備口服胰島素制劑或其他給藥方式的胰島素制劑中的應用。

本發(fā)明的有益效果：

(1)Surfactin變異體可直接利用60％乙醇作為溶劑，無需其他防腐劑，穩(wěn)定性高，便于長期保存和攜帶。

(2)Surfactin變異體能顯著增加胰島素的腸道吸收，使胰島素的生物利用度達到26.32％，超過了天然Surfactin對胰島素的腸道促吸收作用。

(3)Surfactin變異體與胰島素混合后，降糖效果迅速，在腸內(nèi)給藥最快0.5h后就能起到明顯的降血糖效果，明顯快于天然Surfactin與胰島素混合液的降糖作用。

(4)Surfactin變異體與胰島素混合后腸內(nèi)給藥，經(jīng)糖耐量測定，發(fā)現(xiàn)可將餐后血糖控制在正常水平，因此，Surfactin變異體有望與胰島素按比例混合后制成腸溶軟膠囊，口服后能有效降低糖尿病患者的餐后血糖水平。

綜上所述，本發(fā)明生產(chǎn)口服胰島素制劑抗酶降解效果好，易于攜帶，使用方便，解決現(xiàn)有天然胰島素(豬、牛、人)和速效胰島素類似物在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，每日需早、晚注射兩次的問題，使制劑安全性更高，患者的順應性更好。

附圖說明

圖1為60％乙醇對胰島素活性影響的小鼠降糖率數(shù)據(jù)對比圖。

圖2為Surfactin變異體與胰島素混合后腸內(nèi)給藥相對于天然Surfactin與胰島素混合液降血糖效果的小鼠降糖率數(shù)據(jù)對比圖。

圖3為同等劑量的兩種Surfactin變異體1和6分別與胰島素混合后腸內(nèi)給藥四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠，測定血糖得到的降糖率數(shù)據(jù)對比圖。

圖4為同等劑量的兩種Surfactin變異體1和6分別與胰島素混合后腸內(nèi)給藥四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠，測定小鼠血清胰島素水平數(shù)據(jù)對比圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

以下實施例中的Surfactin變異體均通過如下方法合成。

所需原料：2-氯三苯基氯樹脂，L-Leu，D-Leu，L-Asp，L-Val，D-Val，L-Glu，L-Ile，D-Ile，DIEA(N,N-二異丙基乙胺)，3-羥基十四烷酸，DMF(二甲基甲酰胺)，DCM(二氯甲烷)，甲醇，1-羥基苯并三唑(HOBT)，N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)，哌啶，茚三酮檢測試劑，TFA(三氟乙酸)，TFE(三氟乙醇)，無水乙醚。

合成步驟：

(1)稱取1g樹脂放入反應器中，加入DCM溶脹半小時，然后抽掉DCM，加入序列中第一個氨基酸L-Leu(L型亮氨酸)(1mmol當量)，1mmol的DIEA，適量的DCM溶液(適量是指以可使樹脂充分鼓動起來為宜)，用氮氣鼓泡反應60min。然后加入10ml甲醇，反應半小時，抽掉反應液，用DMF、甲醇洗凈。

(2)加入適量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保護基，洗凈，茚三酮檢測。

(3)往反應器中加入序列中第二個氨基酸(3mmol)，3mmolHOBT及DIC，氮氣鼓泡反應一小時，抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測。

(4)依步驟(2)、(3)的方式依次加入序列中氨基酸，直至最后3-羥基十四烷酸反應結(jié)束。

(5)將樹脂用氮氣吹干后，從反應柱中取下并稱取重量，倒入燒瓶中，然后往燒瓶加一定量的30％TFE(三氟乙醇)切割液，震蕩反應2h，將多肽從樹脂載體上裂解下來，進行懸蒸儀懸蒸三次，然后進行液相成酯反應，反應兩天，再次進行懸蒸三次，得到固體產(chǎn)品。

(6)加一定量的95％TFA(三氟乙酸)切割液，震蕩反應2h，將氨基酸的側(cè)鏈保護基團裂解下來，得到粗肽產(chǎn)物。

(7)分析提純和質(zhì)譜檢測：用MDLDI-TOF質(zhì)譜儀檢測該序列分子量的正確性，用高效液相色譜將粗肽提純至90％純以上，收集純化好的目標多肽溶液放入凍干機中進行濃縮凍干，凍干成白色粉末。

實施例1

Surfactin變異體1，其脂肪酸鏈長度均為13個碳原子，與脂肪酸鏈相連的肽環(huán)的氨基酸序列為：

Glu-Ile-Ile-Val-Asp-Ile-Ile

實施例2

Surfactin變異體2，其脂肪酸鏈長度均為13個碳原子，與脂肪酸鏈相連的肽環(huán)的氨基酸序列為：

Glu-Leu-Ile-Val-Asp-Leu-Ile

實施例3

Surfactin變異體3，其脂肪酸鏈長度均為16個碳原子，與脂肪酸鏈相連的肽環(huán)的氨基酸序列為：

Glu-Ile-Leu-Val-Asp-Ile-Ile

實施例4

Surfactin變異體4，其脂肪酸鏈長度均為13個碳原子，與脂肪酸鏈相連的肽環(huán)的氨基酸序列為：

Glu-Leu-Leu-Ile-Asp-Leu-Leu

實施例5

Surfactin變異體5，其脂肪酸鏈長度均為12個碳原子，與脂肪酸鏈相連的肽環(huán)的氨基酸序列為：

Glu-Leu-Ile-Ile-Asp-Ile-Leu

實施例6

Surfactin變異體6，其脂肪酸鏈長度均為13個碳原子，與脂肪酸鏈相連的肽環(huán)的氨基酸序列為：

Glu-Val-Val-Ile-Asp-Val-Val

實施例7

Surfactin變異體7，其脂肪酸鏈長度均為14個碳原子，與脂肪酸鏈相連的肽環(huán)的氨基酸序列為：

Glu-Leu-Val-Ile-Asp-Val-Leu

實施例8

Surfactin變異體8，其脂肪酸鏈長度均為15個碳原子，與脂肪酸鏈相連的肽環(huán)的氨基酸序列為：

Glu-Val-Leu-Ile-Asp-Leu-Val

試驗例部分

試驗例1

Surfactin變異體和胰島素混合液小鼠口服給藥的降血糖效果

1.1四氧嘧啶誘導小鼠糖尿病模型

體重約23g左右的昆明雄性小鼠購自湖北省疾病控制中心，在本實驗室飼養(yǎng)5天，禁食12h，飲水不限，腹腔一次性注射新鮮配制的2.5％(v/w)四氧嘧啶生理鹽水溶液250mg/kg體重。分別于給藥后1天、2天、3天、4天、5天、7天自尾尖取血測定血中葡萄糖濃度。血糖測定用ACCU-CHEK Active(羅康全活力型)血糖測定儀及其所配的血糖試紙測定。1周后禁食12h血糖大于16.7mmol/L的小鼠被認為是糖尿病小鼠。

1.2pH＝3.5的60％乙醇溶液對胰島素活性的影響

具有正常血糖值禁食12h的25g左右的雄性昆明小鼠隨機分為兩組，每組7只，測定其初始血糖值。兩組小鼠分別皮下注射1IU/kg劑量的胰島素，胰島素溶解于稀醋酸溶液(pH＝3.5)或60％的酸性(pH＝3.5)乙醇溶液。測定給藥后0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h各小鼠血糖值，以初始血糖為100％計算各時間點降糖率。用t檢驗分析各時間點兩組小鼠之間降糖率有無顯著差異。結(jié)果見圖1，圖中，INS(s.c)為胰島素，60％ethanol+INS(s.c)為乙醇和胰島素混合液。

結(jié)果顯示，60％乙醇溶液(pH＝3.5，醋酸調(diào)節(jié))作為溶劑對胰島素的活性無影響。

1.3小鼠腸內(nèi)給藥實驗方法的建立

1.3.1麻醉藥配制：將吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司生產(chǎn)的速眠新Ⅱ注射液用滅菌的生理鹽水20倍稀釋后常溫儲存?zhèn)溆茫?/p>

1.3.2手術流程：

(1)選取體重較為均一的高血糖小鼠，禁食12h，稱量體重，通過腹腔注射的方法，按照體重(10μL/g)注射稀釋好的速眠新溶液(1mg/mL)；

(2)待小鼠麻醉后，一實驗人員抓緊小鼠，使其腹部向上，并盡量保持腹部平坦；另一實驗人員進行手術：

①用碘酒擦拭小鼠腹部進行消毒，再用75％酒精擦拭，完成后用無菌剪刀和鑷子沿腹腔中線剪開小鼠表皮及腹膜，注意不要損壞腸道及內(nèi)臟，開口長度約1cm左右；

②用一把鑷子夾住剪開的腹膜，另一把鑷子緩慢將其小腸取出，注意不要損傷到血管，找到小腸空腸中部，利用1mL注射器吸取一定量配制好的天然Surfactin與胰島素的混合液，沿遠離胃的方向緩慢注射進入小腸中；

③注射完成后，用鑷子將其腸移回腹腔內(nèi)，利用手術針以及手術縫合線縫合傷口，并用碘酒進行傷口消毒，記錄此時的時間。

(3)手術完成后每半個小時測定一次小鼠血糖值，直到血糖值趨于較為穩(wěn)定的狀態(tài)后，可每隔1～2h測定一次血糖。

1.4將實施例中所有變異體與胰島素混合后腸內(nèi)給藥的降血糖效果

取禁食12h具有正常血糖值的雄性KM小鼠，隨機分為9組，每組7只，測定其初始血糖值，其中8組通過腸內(nèi)給藥，分別給以溶解于60％酸性乙醇(pH＝3.5)中的胰島素與Surfactin變異體1～8的混合溶液，另一組作為對照給予溶解于稀醋酸溶液(pH＝3.5)中的天然Surfactin與胰島素的混合物，劑量均為45IU/kg胰島素和1.8mg/kg的Surfactin或其變異體，完成后自尾尖取血測定0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h的空腹血糖，以初始血糖為100％，計算各時間點降糖率，用t檢驗分析各時間點兩組小鼠之間降糖率有無顯著差異。結(jié)果見圖2。

結(jié)果分析顯示，上述Surfactin變異體1～8和胰島素混合物與天然Surfactin與胰島素的混合物比較，前者較后者均在2小時內(nèi)有較快的降糖效果，其中效果較好的為Surfactin變異體1和Surfactin變異體6，可以更快促進腸內(nèi)給藥胰島素的吸收，表現(xiàn)為明顯的降糖效果，其結(jié)構(gòu)如下：

以下選擇這兩種化學合成的變異體進行后續(xù)實驗。

試驗例2

同等劑量的兩種Surfactin變異體1、6與胰島素混合后腸內(nèi)給藥糖尿病小鼠的降血糖效果以及胰島素生物利用度比較：

2.1降血糖效果的比較

取造模成功的糖尿病小鼠，禁食12h，隨機分為4組，每組11只，測定初始血糖值并采集空白血樣，每只約100μL。第一組與第二組分別腸內(nèi)給藥溶解于60％乙醇溶液(pH＝3.5)中的胰島素與Surfactin變異體1或Surfactin變異體6的混合液，劑量為45IU/kg胰島素與0.9mg/kg的變異體；第三組腸內(nèi)給藥同等體積的60％乙醇溶液(pH＝3.5)作為對照；第四組首先通過腸內(nèi)給藥60％乙醇溶液(pH＝3.5)，同時皮下注射溶解于稀醋酸(pH＝3.5)中的胰島素(1IU/kg)為對照。給藥后自尾尖取血測定0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h的空腹血糖值，以初始血糖為100％，計算各時間點降糖率，并采集1h、2h、3h、4h、5h血樣，用t檢驗分析各時間點兩組小鼠之間降糖率有無顯著差異。結(jié)果見圖3，圖中Ctr為對照，INS+S6為胰島素與Surfactin變異體6混合腸內(nèi)給藥，INS+S1為胰島素與Surfactin變異體1混合腸內(nèi)給藥，INS(S.C)為皮下注射胰島素。結(jié)果表明，Surfactin變異體6與胰島素混合后的降血糖效果優(yōu)于Surfactin變異體1與胰島素混合后的降血糖效果。

2.2胰島素生物利用度的比較

分離上述采集血樣中的血清，利用ELISA試劑盒檢測各組血清中胰島素的濃度。根據(jù)測得的胰島素濃度(μIU/L)按以下公式計算胰島素的相對生物利用度。結(jié)果見圖4。

胰島素的相對生物利用度Fr的計算見公式：

Fr％＝(AUC_(0-t)oral)×Dose_sc/[(AUC_(0-t)sc)×Dose_oral]×100％

其中AUC_(0-t)oral與AUC_(0-t)sc分別為通過口服以及皮下注射所吸收的胰島素的含量，Dose_oral與Dose_sc分別為口服以及皮下注射胰島素的劑量。

AUC的計算方法為：AUC＝SUM[(T_i+1-T_i)×(C_i+1+C_i)]/2，其中T_i，C_i分別為各取血點所對應的時間值和血藥濃度。

結(jié)果表明，Surfactin變異體6與胰島素混合后腸內(nèi)給藥高血糖小鼠的胰島素水平顯著高于Surfactin變異體1與胰島素混合后腸內(nèi)給藥的高血糖小鼠，二者胰島素相對生物利用度分別為26.32％和18.25％。