本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種從枇杷葉中提取熊果酸的方法。

背景技術(shù)：

中國(guó)是世界上最主要的枇杷生產(chǎn)國(guó)，枇杷栽培面積和產(chǎn)量約占全球的2/3以上，枇杷全身皆寶，枇杷葉、花、果、核等部位富含三萜酸(可高達(dá)1.5％)、揮發(fā)油、苦杏仁苷、皂苷、黃酮、水溶性多糖和有機(jī)酸等活性成分。目前，枇杷是以鮮果供應(yīng)為主，尚未進(jìn)行其他部位的深度開發(fā)和綜合利用。

枇杷葉為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有化痰止咳、和胃降逆的功效，有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、清除自由基、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等藥理作用，其有效成分集中在三萜酸類、黃酮類及多糖類化學(xué)成分。這些成分療效確切，應(yīng)用廣泛，許多中成藥、復(fù)方制劑都取其入藥，同時(shí)國(guó)內(nèi)國(guó)際研究單位針對(duì)其特異功能(如熊果酸抗腫瘤、科羅索酸植物胰島素功能)進(jìn)行腫瘤治療藥物及大健康產(chǎn)品開發(fā)的熱情日益高漲。

枇杷葉中有效成分的提取分離，目前大多數(shù)采用有機(jī)溶劑提取、柱層析、薄層純化等技術(shù)，使用硅膠、氧化鋁、葡聚糖凝膠等材料，工藝復(fù)雜，成本高，效率低，收率低，過(guò)程中使用大量有機(jī)溶劑，污染大。另外一方面，由于結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，人工合成有一定難度，且也存在污染等問(wèn)題。因此探索工藝簡(jiǎn)單、低成本、高收率、污染小的提取純化工藝對(duì)枇杷葉有效成分的大規(guī)模應(yīng)用具有決定性的意義。

在對(duì)于熊果酸的研究中，前人多采用的方法如溶劑提取法、超聲波輔助提取法、以及超臨界萃取工藝，在對(duì)熊果酸的純化方面，相廷英等人則是通過(guò)用石油醚結(jié)合活性炭脫色工藝，經(jīng)過(guò)重結(jié)晶能得到熊果酸晶體，另外李麗等人通過(guò)堿性乙醇除雜、活性炭脫色以及大孔吸附樹脂富集結(jié)合乙醇重結(jié)晶作用得到熊果酸晶體。以上方法均存在提取時(shí)間較長(zhǎng)，熊果酸提取率較低等缺陷。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從枇杷葉中提取熊果酸的方法，所述的亞臨界水提取法提取方法具有綠色環(huán)保、方法簡(jiǎn)單、易于操作，原料利用率高以及降低成本等優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種從枇杷葉中提取熊果酸的方法，包括如下步驟：

(A)將枇杷葉清洗干凈，烘干，粉碎成40-80目；

(B)在枇杷葉粗粉中加入枇杷葉重量的8-12倍量的水，先浸泡0.5—1.0小時(shí)，滲濾，過(guò)濾以及蒸發(fā)濃縮操作步驟后，得到藥膏，測(cè)定其熊果酸的含量。

熊果酸較易溶于有機(jī)溶劑和水的混合體系。傳統(tǒng)溶劑提取法一般存在提取時(shí)間長(zhǎng)，純化過(guò)程復(fù)雜且易產(chǎn)生有機(jī)溶劑殘留等問(wèn)題。微波輔助提取和超聲輔助提取法等新型提取技術(shù)雖然一定程度上提高了有效成分的提取率，并縮短了提取時(shí)間，但在提取過(guò)程中依然要消耗大量的有機(jī)溶劑，仍存在嚴(yán)重環(huán)境污染和純化時(shí)有機(jī)物殘留問(wèn)題。超臨界提取技術(shù)雖結(jié)合了精餾和萃取的優(yōu)點(diǎn)，但其自身也存在很多問(wèn)題，首先對(duì)設(shè)備的要求高導(dǎo)致生產(chǎn)成本較大，其次對(duì)極性大，分子量較高的物質(zhì)萃取效果差，對(duì)于成分較復(fù)雜的原料，提取物純度較低。

本發(fā)明所提出的亞臨界水提取法為一種綠色環(huán)保的萃取技術(shù)；具有高效、節(jié)時(shí)、環(huán)保、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明改變傳統(tǒng)所用的有機(jī)溶劑，以水為溶劑在亞臨界條件下從枇杷葉中提取分離熊果酸的技術(shù)和工藝；利用水在高溫高壓下具有非極性的性質(zhì)，以水取代傳統(tǒng)的溶劑，其枇杷葉中不同功能因子在不同溫度-壓力的水中相平衡關(guān)系，通過(guò)控制溫度、壓力等影響因素來(lái)控制水的極性，以解決熊果酸的萃取率和純度這對(duì)矛盾，達(dá)到依次分級(jí)提取枇杷葉中功能因子的高效率提取效果，并得到純度較高的熊果酸初級(jí)產(chǎn)品。

本發(fā)明中，為了更好的提取、分離得到熊果酸，需通過(guò)提取溫度、提取時(shí)間、提取壓力及泵的流速對(duì)提取效果等影響因素來(lái)控制水的極性，當(dāng)溫度為200℃，壓力10MPa，水流速5L/h，提取時(shí)間60min，此時(shí)熊果酸的提取率達(dá)到70.0％以上，效果最佳。

本發(fā)明最大的優(yōu)點(diǎn)為：與傳統(tǒng)回流及超聲輔助提取工藝相比，亞臨界水提取技術(shù)具有提取時(shí)間短且提取效率高，同時(shí)有節(jié)省溶劑、低污染，有效成分損失少等優(yōu)點(diǎn)。

為證明上述條件為最佳效果，特做了以下試驗(yàn)：

一、亞臨界水動(dòng)態(tài)提取熊果酸的工藝研究

采用亞臨界水組裝設(shè)備實(shí)現(xiàn)枇杷葉連續(xù)提取過(guò)程，分級(jí)得到不同功能性成分，以下為采用動(dòng)態(tài)提取模式將亞臨界水提取的影響因素作為試驗(yàn)研究?jī)?nèi)容，采用控制變量法，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，研究各因素對(duì)枇杷葉中熊果酸提取效果的影響。

使用改進(jìn)后提取裝置(2L)，將枇杷葉粉末放入提取柱中，壓力泵將超純水輸送到預(yù)熱器中預(yù)熱，到達(dá)設(shè)定溫度后，水進(jìn)入到提取柱中；系統(tǒng)壓力到達(dá)設(shè)定值后，提取柱注滿水時(shí)開始計(jì)時(shí)(此時(shí)提取時(shí)間為0)，萃取一定時(shí)間后提取液經(jīng)冷卻器流至收集釜收集。

A.原料粒徑對(duì)熊果酸提取率的影響

實(shí)驗(yàn)分別采用粒徑為20、40、60、80目的枇杷葉原料，在溫度為200℃時(shí)，以流速為3L/h萃取60min，壓強(qiáng)控制在10MPa，加料量為160g。

枇杷葉破碎度對(duì)提取效果的影響如附圖1所示，隨著原料粒徑的不斷減小，提取率逐漸增大，在粒徑為60目時(shí)達(dá)到最大，而后提取率降低。枇杷葉破碎度高，粒徑變小，細(xì)胞壁受損程度較大，溶劑易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，可加快溶劑的擴(kuò)散，同時(shí)增大原料和溶劑間的接觸面積，利于提高提取率。當(dāng)原料粒徑繼續(xù)變小，原料過(guò)細(xì)時(shí)，易造成原料的堆積，不僅造成管路堵塞，使萃取釜內(nèi)壓強(qiáng)過(guò)高，同時(shí)易使物料壓實(shí)或結(jié)塊，使溶劑出現(xiàn)溝流現(xiàn)象，造成傳質(zhì)速率降低。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇60目粒徑的枇杷葉粉末。

B.加料量對(duì)熊果酸提取率的影響

以60目枇杷葉為原料，在萃取溫度200℃，溶劑流速為3L/h，壓強(qiáng)10MPa的條件下提取60min，加料量比分別為40、80、120、160、200g。結(jié)果如附圖2所示，當(dāng)加料量不斷增加，熊果酸的提取率不斷減小，在加料量小于160g時(shí)，熊果酸的提取率下降趨勢(shì)較緩，當(dāng)加料量繼續(xù)增加，提取率下降明顯。當(dāng)釜內(nèi)原料含量過(guò)低時(shí)，物料中有效成分含量較少，溶質(zhì)在固液兩相中濃度差較小，故隨著物料的增加，提取率下降較緩。

當(dāng)萃取釜內(nèi)原料含量過(guò)多時(shí)，傳質(zhì)阻力變大，原料堆積密度變大，此時(shí)釜體中央的原料較難與溶劑充分接觸，導(dǎo)致原料萃取不完全，提取率會(huì)明顯降低。同時(shí)考慮到成本問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)選擇160g為最佳加料量。

C.提取時(shí)間對(duì)熊果酸提取率的影響

在提取壓力10MPa、提取溫度200℃，溶劑流速為3L/h的條件下，分別提取15、30、45、60、75、90min，提取率的變化如附圖3所示，表明，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)時(shí)間未超過(guò)75min時(shí)，提取率不斷增加，物料提取的更加充分。在75min后，隨著提取時(shí)間的增加提取率變化甚微。由于亞臨界水萃取物料中有效成分的傳質(zhì)過(guò)程是一個(gè)活性成分在溶劑的作用下，通過(guò)分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)達(dá)到固液平衡的過(guò)程，在平衡前適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)萃取時(shí)間有利于成分的溶出，但平衡后，溶劑溶質(zhì)處于飽和狀態(tài)，活性物質(zhì)在此極性下已基本提取完全，且長(zhǎng)時(shí)間的高溫高壓處理，易導(dǎo)致活性物質(zhì)發(fā)生降解，考慮到成本問(wèn)題，因此提取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，選60min為最佳提取時(shí)間。

D.提取溫度對(duì)熊果酸提取率的影響

在提取壓力10MPa、提取時(shí)間75min，溶劑流速為3L/h的條件下，分別在100、150、200、250℃的條件下提取枇杷葉中的熊果酸，提取率的變化如附圖4所示，結(jié)果表明200℃之前，隨提取溫度的升高，提取率增加，當(dāng)溫度超過(guò)200℃后，隨著溫度的提高，提取率略有減少。溫度低于150℃時(shí)，僅有少量熊果酸提出，提取率僅為20％。溫度為200℃時(shí)提取率達(dá)到70.28％，同時(shí)隨著溫度的繼續(xù)升高，提取率下降并伴有葉子的焦糊味產(chǎn)生。萃取溫度是影響亞臨界水萃取技術(shù)的主要因素，對(duì)萃取的速度、效果及選擇性有很大影響。隨著溫度的升高，水的極性不斷下降，因此可以利用水溫控制提取液的極性，進(jìn)而選擇性提取物料中的目標(biāo)物；在200℃時(shí)，其介電常數(shù)接近甲醇，可以有效提取三萜類化合物。當(dāng)溫度為250℃時(shí)，提取率降低為56.37％，同時(shí)提取液中有黑色焦?fàn)钗锍霈F(xiàn)，故提取溫度選200℃。

E.壓力對(duì)熊果酸提取率的影響

在提取溫度200℃、提取時(shí)間60min和溶劑流速3L/h的條件下分別進(jìn)行了不同提取壓力(6、8、10、12MPa)的提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)附圖5，結(jié)果表明，壓力的變化對(duì)熊果酸的提取率影響較小。隨著壓力的升高，雖然提取率有小幅度上升，當(dāng)壓力達(dá)到10MPa后，提取率略降。這是因?yàn)樵趤喤R界水提取過(guò)程中，壓力的主要作用為維持溶劑保持液體狀態(tài)。當(dāng)壓力增大，有利于物料中內(nèi)含物的釋放，水的密度增大，溶解能力略有增強(qiáng)，有效成分傳質(zhì)速率會(huì)相應(yīng)加快。但當(dāng)壓力達(dá)到一定程度，可能會(huì)造成物料壓實(shí)，枇杷葉在高溫下不再保持原有的性狀，易結(jié)塊不利于原料與溶劑間的接觸，同時(shí)對(duì)設(shè)備要求增高，故選擇10Mpa為最佳提取壓力。

F.溶劑流速對(duì)提取率的影響

在提取壓力10MPa、提取溫度200℃，調(diào)節(jié)泵的流速分別為1、3、5L/h，結(jié)果如圖6所示，溶劑流速越快，提取效率越高。當(dāng)溶劑流速為5L/h，10MPa、200℃條件下，60min時(shí)熊果酸提取率為70.62％，此時(shí)與3L/h提取75min提取率相近，隨著時(shí)間的增加，提取率沒(méi)有較大變化。從流體力學(xué)角度分析，亞臨界水處于流動(dòng)狀態(tài)，與物料之間發(fā)生摩擦、碰撞等作用，溶劑不斷沖擊物料有效增大了溶劑與物料間的接觸面積。從傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)角度分析，水在流動(dòng)狀態(tài)下會(huì)加速熊果酸向溶劑的擴(kuò)散，利于固液兩相間快速形成新的濃度梯度，為殘留在物料內(nèi)部的熊果酸提供傳質(zhì)動(dòng)力?？紤]到生產(chǎn)成本和時(shí)間等因素，選擇5L/h提取時(shí)間為60min為最佳提取條件，并測(cè)得此時(shí)提取液中熊果酸純度為15.13％。

二、不同提取工藝方法的比較

A.有機(jī)溶劑加熱回流提取

在乙醇濃度85％、提取溫度為85℃、料液比1:12的條件下，提取時(shí)間對(duì)熊果酸的的提取效果的影響如附圖7所示。在0～2h，隨著時(shí)間的增加，熊果酸的提取率逐步增加，當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)至3小時(shí)提取率沒(méi)有明顯變化，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)在熊果酸不斷溶出的同時(shí)也會(huì)發(fā)生部分降解。因此考慮到成本問(wèn)題，選擇回流時(shí)間為2h。

B.超聲輔助提取

在乙醇濃度85％、提取溫度為25℃、料液比1:12的條件下，超聲提取時(shí)間對(duì)熊果酸的的提取效果的影響如附圖8所示。可以看出，超聲波處理可在一定程度上增大提取率，同時(shí)縮短提取時(shí)間。因?yàn)槌曁幚硎怪参锛?xì)胞最大程度的破碎，使熊果酸能最大程度的和提取劑接觸，降低了熊果酸溶出的阻力。隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，提取率不斷增大，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60min后增長(zhǎng)趨于緩慢，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到90min時(shí)，提取率降低，原因?yàn)樾芄嵩谔崛∵^(guò)程中發(fā)生降解，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間超聲易產(chǎn)生熱量導(dǎo)致部分乙醇溶劑揮發(fā)，乙醇濃度降低導(dǎo)致提取率下降。

C.亞臨界水提取與其他方法的比較

與傳統(tǒng)提取方法相比，亞臨界水提取最大的優(yōu)勢(shì)就是不使用有機(jī)溶劑的同時(shí)提高了提取速度和提取率。如表9所示，亞臨界水的提取率，是乙醇回流法的1.5倍，傳統(tǒng)回流法在提取時(shí)間為120min時(shí)提取效果最好，提取率為57.38％；亞臨界水最佳提取時(shí)間為75min。與傳統(tǒng)提取法相比，在縮短了提取時(shí)間的前提下，提高了提取率。超聲提取法對(duì)傳統(tǒng)工藝方法有較大改進(jìn)，具有較好的經(jīng)濟(jì)性和廣泛的適應(yīng)性，但只是一種輔助手段，雖然縮短了提取時(shí)間，但提取率沒(méi)有明顯的提高。亞臨界水提取法與其他兩種方法相比較，具有無(wú)溶劑、低污染，且提取時(shí)間短，有效成分損失少的優(yōu)勢(shì)。

表9不同提取方法對(duì)熊果酸提取率的比較

本試驗(yàn)以亞臨界水萃取技術(shù)為核心，以枇杷葉為原料，使用自制設(shè)備提取枇杷葉中的熊果酸，確定了亞臨界水動(dòng)態(tài)提取熊果酸的最佳參數(shù)條件，并與傳統(tǒng)溶劑回流法、超聲輔助提取法等對(duì)比。該設(shè)備具有操作方便、自動(dòng)化程度高、安全有效的特點(diǎn)。

亞臨界水動(dòng)態(tài)提取枇杷葉中熊果酸的工藝研究表明，原料破碎度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取壓力及泵的流速對(duì)提取效果具有顯著影響。確定了熊果酸提取的最優(yōu)工藝條件：取60目枇杷葉粉末，加料量160g，溫度為200℃，壓力10MPa，水流速5L/h，提取時(shí)間60min，此時(shí)熊果酸的提取率達(dá)到70.62％。

綜上試驗(yàn)說(shuō)明，本發(fā)明采用亞臨界水提取法從枇杷葉中提取熊果酸的方法，與傳統(tǒng)回流及超聲輔助提取工藝相比，亞臨界水提取技術(shù)具有提取時(shí)間短且提取效率高，同時(shí)有節(jié)省溶劑、低污染，有效成分損失少等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1：原料粒徑對(duì)提取率的影響示意圖；

圖2：不同加料量對(duì)提取率的影響示意圖；

圖3：不同提取時(shí)間對(duì)提取率的影響示意圖；

圖4：不同提取溫度對(duì)提取率的影響示意圖；

圖5：不同提取壓力對(duì)提取率的影響示意圖；

圖6：溶劑流速對(duì)提取率的影響示意圖；

圖7：回流時(shí)間對(duì)提取效果的影響示意圖；

圖8：超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明從枇杷葉中提取熊果酸的方法作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不僅限于實(shí)施例。

實(shí)施例1

將枇杷葉1kg，清洗干凈，烘干，粉碎成40目；在枇杷葉粗粉中加入枇杷葉重量的8倍量的水，先浸泡0.5小時(shí)，溫度為200℃，滲濾水速度為5L/h，提取時(shí)間為45min，壓力為10MPa，收集滲濾液，濃縮至60℃時(shí)相對(duì)密度為1.10的藥膏，測(cè)定其熊果酸的提取率為64.24％。

實(shí)施例2

將枇杷葉1kg，清洗干凈，烘干，粉碎成60目；在枇杷葉粗粉中加入枇杷葉重量的10倍量的水，先浸泡1小時(shí)，溫度為200℃，滲濾水速度為5L/h，提取時(shí)間為60min，壓力為10MPa，收集滲濾液，濃縮至60℃時(shí)相對(duì)密度為1.10的藥膏，測(cè)定其熊果酸的提取率為70.62％。

實(shí)施例3

將枇杷葉1kg，清洗干凈，烘干，粉碎成80目；在枇杷葉粗粉中加入枇杷葉重量的12倍量的水，先浸泡1小時(shí)，溫度為200℃，滲濾水速度為5L/h，提取時(shí)間為75min，壓力為10MPa，收集滲濾液，濃縮至60℃時(shí)相對(duì)密度為1.20的藥膏，測(cè)定其熊果酸的提取率為71.18％。