本發(fā)明涉及一種使用軟刻芯片技術改造蛋白質結晶基底的方法，特別是通過軟刻技術改變結晶界面粗糙度來提高蛋白質結晶成功率的方法。
背景技術：
蛋白質是生命活動的執(zhí)行者，其結構是功能研究的前提和基礎，因此，蛋白質結構的解析對闡明其生物學功能具有非常重要的意義。目前，蛋白質結構數(shù)據(jù)庫中，有88％以上的結構都是通過X-射線衍射技術獲得的，而高質量的蛋白質晶體是通過X-射線衍射技術獲得結構的前提和基礎。目前，蛋白質結晶條件篩選成功率低是制約X-射線衍射技術發(fā)展的重要瓶頸，因此，如何提高蛋白質結晶成功率是亟待解決的重要問題。
形核是蛋白質結晶的第一步，也是最重要的一步。通常只有蛋白質溶液濃度達到過飽和才能逾越形核勢壘，晶核才能形成，繼而晶體才能生長。而對于一些比較珍貴的蛋白質樣品，濃度很難達到過飽和，晶核不能形成，直接導致了結晶成功率低的問題。通過在結晶體系中直接引入異相核是一種提高結晶成功率的有效手段，蛋白質溶液不需要跨越形核勢壘，就可以直接在異相核表面堆積，進而進行晶體生長。對結晶板表面進行改性處理是一種最為方便和快捷的提高蛋白質結晶成功率的方法，研究表明直接改變結晶界面的粗糙度會顯著影響蛋白質結晶成功率。文獻“Guo Y Z,Yin D C,Lu Q Q,et al.Enhancement of nucleation during hanging drop protein crystallization using HF Treatment of cover glasses[J].Cryst.Res.Technol,2010,45(2):158-166.”中報道，使用氫氟酸蝕刻蓋玻片以改變其界面的粗糙度，在懸滴法中使用經(jīng)過處理的蓋玻片可以有效提高蛋白質結晶成功率。結晶界面表面粗糙度的大小對蛋白質結晶成功率影響十分顯著，只有在結晶界面粗糙度合適的條件下，蛋白質結晶成功率才能顯著提高。結晶界面表面粗糙度的改變都是在實驗室通過化學反應的方法得到，如氫氟酸腐蝕等，在該結晶界面的表面粗糙度很難控制到均一的程度，結晶是蛋白質分子有序堆積的過程，粗糙度均一的結晶界面會更加有利于蛋白質結晶，因此，制備具有均一可控表面粗糙度的結晶板能顯著促進蛋白質結晶。
微流控技術由于其具有高通量、集成化、低消耗等優(yōu)點，在蛋白質微型化結晶中的應用具有重要地位。目前，已應用于微量蛋白質結晶與篩選的技術包括基于聚二甲基硅氧烷(Polydimethyl iloxane，PDMS)材料的微泵微閥技術等。在微流控芯片制作工藝中，通常采用模塑法中的軟刻技術，利用PDMS材料制備出微米級的結構。
技術實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種使用軟刻芯片改變結晶基底粗糙度用于蛋白質結晶的方法，基于表面粗糙度對蛋白質結晶的影響，及軟刻技術可以在PDMS材料表面制作粗糙度可控和均一的基底，以此將該基底應用于蛋白質結晶條件的篩選，能夠提高結晶成功率。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案包括以下步驟：
第一步，制作PDMS芯片，包括以下步驟：
(1)在PDMS芯片界面上設計緊密排列的微柱陣列，每根微柱的直徑為5～300μm，微柱的高度為5～300μm，微柱的間距為5～300μm；或者設計一系列有間隔的微柱陣列，陣列中每根微柱的直徑在5～300μm之間，微柱的高度在5～300μm之間，微柱的間距為5～300μm之間，每組陣列中微柱在長1mm～1cm、寬1mm～1cm的區(qū)域內緊密排列，每組陣列間的間距為1mm～1cm；
(2)芯片制備，包括以下內容：
a)用98％濃硫酸和雙氧水按照3：1的體積比配成洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，用無水乙醇和丙酮分別浸泡1min后再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到基片；
b)將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層；
c)將制備好的基片置于65～95℃烘干；
d)將烘干的基片在光刻機上曝光45s；
e)用顯影劑對光刻處理的基片顯影3min，吹干，得到制作PDMS芯片的模板；
(3)芯片制備，包括以下內容：
a)用三甲基氯硅烷蒸汽熏模板3min；
b)按照10：1的體積比量取PDMS預聚物和固化劑，混合均勻；
c)將混合均勻的PDMS預聚物和固化劑傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；
d)將模板置于80℃環(huán)境中固化，得到刻有微柱陣列的PDMS；
e)將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質結晶板表面，備用；
第二步，配置濃度為0.001～1M、pH值在3～10的緩沖液，所述的緩沖液包括所有可以減少溶液體系內pH改變，維持體系酸堿度的溶液，用緩沖液來溶解蛋白質，使蛋白質在溶液中的終濃度達到1～100mg/ml，得到蛋白質溶液；
第三步，將結晶試劑與蛋白質溶液按照(0.01～50)：1的體積比混合，得到蛋白質結晶溶液體系；
第四步，將蛋白質結晶溶液滴加在PDMS表面，在0～60℃下靜置1～720h結晶。
所述的緩沖液包括但不限于Tris系統(tǒng)、磷酸、碳酸、醋酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸、巴比妥酸、硼酸鹽。
本發(fā)明的有益效果是：通過設計PDMS芯片實現(xiàn)可控和均一粗糙度的結晶界面，來提高基底表面蛋白質形核幾率，從而達到提高蛋白質結晶成功率的目的。通過本發(fā)明，可使蛋白質結晶條件篩選成功率提高1～5倍。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明進一步說明，本發(fā)明包括但不僅限于下述實施例。
本發(fā)明的技術方案提供一種通過使用軟刻技術在PDMS表面構建可控和均一粗糙度的結晶表面來篩選蛋白質晶體的方法，具體的技術方案步驟如下：
第一步：PDMS芯片設計和制作：(1)PDMS芯片的設計：基于一般蛋白質分子及其聚合物的直徑，我們在PDMS芯片界面上設計緊密排列的微柱陣列，其中每根微柱的直徑在5～300μm之間，微柱的高度在5～300μm之間，微柱的間距為5～300μm之間；或者設計一系列有間隔的微柱陣列，陣列中每根微柱的直徑在5～300μm之間，微柱的高度在5～300μm之間，微柱的間距為5～300μm之間，每組陣列中微柱在長1mm～1cm之間，寬度為1mm～1cm之間的區(qū)域內緊密排列，每組陣列間的間距為1mm～1cm；(2)芯片及模板制備：a)準備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10：1稱取PDMS預聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化，得到刻有微柱陣列的PDMS；e)制備覆蓋PDMS的結晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質結晶板表面，備用；
第二步：蛋白質溶液的配置：配置濃度為0.001～1M，pH值在3～10的緩沖液(指所有可以減少溶液體系內pH改變，維持體系酸堿度的溶液)，用緩沖液來溶解蛋白質，使蛋白質在溶液中的終濃度達到1～100mg/ml，得到蛋白質溶液；
第三步：加入結晶試劑，制備蛋白質結晶體系：將結晶試劑(指所有用于蛋白質結晶的試劑)與蛋白質溶液按照(0.01～50)：1體積比混合，得到蛋白質結晶溶液體系；
第四步：結晶：將蛋白質結晶溶液滴加在PDMS芯片表面，在0～60℃下靜置1～720h結晶。在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出現(xiàn)蛋白質晶體的條件數(shù)目。
所述的緩沖液指可以在一定程度上抵消、減輕外界環(huán)境變化例如外加強酸或強堿等對溶液酸堿度的影響，從而使溶液的pH值能夠維持相對穩(wěn)定的溶液。包括但不限于Tris系統(tǒng)、磷酸、碳酸、醋酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸、巴比妥酸、硼酸鹽。
實施例1：蛋白酶K結晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設計和制作：(1)PDMS芯片的設計：在PDMS芯片界面上設計一系列緊密排列的微柱陣列，微柱的直徑在5μm，微柱的高度在10μm，微柱的間距為100μm；(2)芯片及模板制備：a)準備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質結晶板表面，備用；
第二步：將美國Sigma公司的蛋白酶K，按照終濃度為30mg/ml溶于pH為5，0.025M HEPES-Na緩沖液中，得到蛋白質溶液；
第三步：本實施例用Hampton公司的IndexTM試劑盒的96種結晶試劑篩選蛋白酶K晶體，將結晶試劑與蛋白質溶液按照體積比為0.01：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質結晶板，得到蛋白質結晶體系；
第四步：將整個結晶體系置于50℃條件下靜置2h結晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)蛋白酶K晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計得到如下結果：有56種結晶條件出現(xiàn)了蛋白酶K晶體，結晶成功率為58.33％。與現(xiàn)有的商業(yè)結晶板篩選結晶條件的結果相比，成功率提高了1.3倍。
實施例2：溶菌酶蛋白結晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設計和制作：(1)PDMS芯片的設計：在PDMS芯片界面上設計微柱陣列在長度為1mm和寬度為0.5mm的區(qū)域內緊密排列，陣列間的間距為1mm，其中微柱的直徑為50μm，微柱的高度為10μm，微柱的間距為100μm；(2)芯片及模板制備：a)準備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質結晶板表面，備用；
第二步：將日本Seikagaku公司的溶菌酶按照終濃度為10mg/ml溶于pH為4.6，0.1M的醋酸鈉緩沖液中，得到蛋白質溶液；
第三步：將氯化鈉溶液與蛋白質溶液按照體積比為0.1：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質結晶板，得到蛋白質結晶體系；
第四步：將整個結晶體系置于4℃條件下靜置336h結晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)溶菌酶蛋白晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計得到如下結果：有64種結晶條件出現(xiàn)了溶菌酶蛋白晶體，結晶成功率為66.67％。與現(xiàn)有的商業(yè)結晶板篩選結晶條件的結果相比，成功率提高了1.7倍。
實施例3：核糖核酸酶A結晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設計和制作：(1)PDMS芯片的設計：在PDMS芯片界面上設計一系列微柱陣列，每組微柱陣列在長度為1cm和寬度為1mm的區(qū)域內緊密排列，陣列間的間距為1mm，微柱的直徑為30μm，微柱的高度為100μm，微柱的間距為20μm；(2)芯片及模板制備：a)準備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質結晶板表面，備用；
第二步：將美國Sigma公司的核糖核酸酶A，按照終濃度為70mg/ml溶于pH為7，0.05M HEPES-Na緩沖液中，得到蛋白質溶液；
第三步：本實施例用Hampton公司的Crystal Screen和Crystal Screen 2試劑盒的98種結晶試劑篩選核糖核酸酶A晶體，將結晶試劑與蛋白質溶液按照體積比為1：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質結晶板，得到蛋白質結晶體系；
第四步：將整個結晶體系置于20℃條件下靜置72h結晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)核糖核酸酶A晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計得到如下結果：有42種結晶體系出現(xiàn)了核糖核酸酶A晶體，結晶成功率為43.75％。與現(xiàn)有的商業(yè)結晶板篩選結晶條件的結果相比，成功率提高了4.7倍。
實施例4：纖維素酶結晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設計和制作：(1)PDMS芯片的設計：在PDMS芯片界面上設計緊密排列的微柱陣列，微柱的直徑為100μm，微柱的高度為20μm，微柱的間距為50μm；(2)芯片及模板制備：a)準備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質結晶板表面，備用；
第三步：本實施例用Hampton公司IndexTM試劑盒的96種結晶試劑篩選纖維素酶晶體，將結晶試劑與纖維素酶蛋白溶液按照體積比為10：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質結晶板，得到蛋白質結晶體系；
第四步：將整個結晶體系置于15℃條件下靜置480h結晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)纖維素酶晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計得到如下結果：有18種結晶體系中出現(xiàn)了纖維素酶晶體，結晶成功率為18.75％。與現(xiàn)有的商業(yè)結晶板篩選結晶條件的結果相比，成功率提高了1.8倍。
實施例5：刀豆球蛋白結晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設計和制作：(1)PDMS芯片的設計：在PDMS芯片界面上設計一系列微柱陣列，每組陣列中，微柱在長度為5mm和寬度為5mm的區(qū)域內緊密排列，陣列間距為1cm；微柱的直徑為35μm，微柱的高度為205μm，微柱的間距為100μm，(2)芯片及模板制備：a)準備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質結晶板表面，備用；
第二步：將美國Sigma公司的刀豆球蛋白按照終濃度為2mg/ml溶于pH為6，0.005M HEPES-Na緩沖液中，得到蛋白質溶液；
第三步：本實施例用Hampton公司Crystal Screen和Crystal Screen 2試劑盒的98種結晶試劑篩選刀豆球蛋白晶體，將結晶試劑與刀豆球蛋白溶液按照體積比為40：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質結晶板，得到蛋白質結晶體系；
第四步：將整個結晶體系置于30℃條件下靜置168h結晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)刀豆球蛋白晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計得到如下結果：有23種結晶體系中出現(xiàn)了刀豆球蛋白晶體，結晶成功率為23.96％。與現(xiàn)有的商業(yè)結晶板篩選結晶條件的結果相比，成功率提高了1.77倍。