一種棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,特別涉及一種棘腹蛙的金黃色葡萄球 菌的PCR檢測試劑及檢測方法,適用于感染金黃色葡萄球菌的棘腹蛙的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 棘腹蛙是一種營養(yǎng)豐富且具藥用價(jià)值的大型山區(qū)食用蛙,其鮮肉干樣中蛋白質(zhì)含 量為16. 25%、脂肪含量為1.26%,具有豐富的滋補(bǔ)功效和藥用價(jià)值,隨著人民生活水平的 不斷提高,棘腹蛙的食用價(jià)值也在逐漸上升,具有較好的開發(fā)前景。同時(shí)作為脊椎動(dòng)物進(jìn)化 中的過渡動(dòng)物,是進(jìn)行解剖學(xué)、遺傳學(xué)和胚胎發(fā)育學(xué)研究較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。由于環(huán)境 污染嚴(yán)重、野生棲息地遭受破壞、人類大肆捕殺等因素造成棘腹蛙野生種群數(shù)量大量減少; 為保護(hù)其野生資源,同時(shí)滿足市場需求,棘腹蛙的人工養(yǎng)殖逐漸受到重視。但是,隨著養(yǎng)殖 數(shù)量的不斷增多,隨之而來的多種病害對棘腹蛙養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。感染蛙類 的病原菌主要有溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、鏈球菌等,可見棘腹蛙細(xì)菌性疾病是人工養(yǎng) 殖過程中常見且危害極大的一類疾病,對細(xì)菌性疾病的研究也是棘腹蛙人工養(yǎng)殖的一個(gè)重 點(diǎn)。目前還沒有過棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的報(bào)道。
[0003] 葡萄球菌根據(jù)生化反應(yīng)和產(chǎn)生色素的不同可分為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 和腐生葡萄球菌三種,其中金黃色葡萄球菌致病力較強(qiáng),是動(dòng)物化膿感染中最常見的病原 菌,可引起局部化膿感染,也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等,甚至敗血癥、膿毒癥等全 身感染。從而給動(dòng)物水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了巨大傷害。近年來,雖然中國特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)得 到了迅猛發(fā)展,但由于養(yǎng)殖戶的管理水平、養(yǎng)殖場的硬件和軟件設(shè)施不能進(jìn)行規(guī)范化管理 等原因,已經(jīng)有多起由該菌引起的人畜感染的報(bào)道,且已日益被關(guān)注。為了及早發(fā)現(xiàn)棘腹蛙 是否被金黃色葡萄球菌感染,有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法。
[0004] 傳統(tǒng)病原菌的診斷需要進(jìn)行顯微鏡觀察,缺乏進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、敏感的檢測方法。
[0005] CN104726594A公開了一種檢測金黃色葡萄球菌的檢測試劑盒,采用的引物有:
[0006] 上游引物:5 ' -AACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGC-3 ' nuc
[0007] 下游引物:5' -CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTTTTCCACTA-3' hlyA
[0008] 上游引物:5' -AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3' hlyA
[0009] 下游引物:5' -TTACCGTTCTCCACCATTCCCAAG-3' invA
[0010] 上游引物:5' -CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3' invA
[0011] 下游引物:5 ' -GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3 ' tIh
[0012] 上游引物:5 ' -CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3 ' tIh
[0013] 下游引物:5' -CGGGTTAGGGAAGCGCCATT-3' ipaH
[0014] 上游引物:5' -GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3' ipaH 下游引物:5' -TTTACGGACTG GTTCTCCCTCTGG-3'。
[0015] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)采用上述引物的PCR試劑盒檢測棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌不敏感, 缺乏特異性。為此有必要尋找一種操作簡單、特異、快速、敏感等優(yōu)點(diǎn)的檢測棘腹蛙感染金 黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0016] 本發(fā)明提供了一種檢測棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒及其檢測 方法。該檢測試劑盒及檢測方法能快速、高效、特異性的用于棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的 檢測。
[0017] 本發(fā)明的一種檢測棘腹蛙的金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒,包含2倍反應(yīng)混 合緩沖液、上游引物、下游引物、Taq酶和滅菌的ddH20,其特征在于所述上游引物為S-F : 5 ' - AGGTAACGGCGTAAATAG - 3 ',所述下游引物 S-R : 5 ' - ACTTGCTTCAGGACCATA - 3 '。
[0018] 上述本發(fā)明的檢測試劑盒,所述2倍反應(yīng)混合緩沖液包含以下成份:
[0020] 所述2倍反應(yīng)混合緩沖液的量為1.0 ml。
[0021] 上述本發(fā)明的檢測試劑盒,所述上游引物和下游引物的濃度均為10 yM/L;所述 Taq酶為5U/ μ L Taq酶,其量為0· 5 μ L ;所述滅菌的CldH2O為1.0 mL。
[0022] 上述本發(fā)明的檢測試劑盒,還包含陽性對照液和陰性對照液,所述陽性對照液為 感染金黃色葡萄球菌的棘腹蛙的基因組DNA,所述陰性對照液為ddH20。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種采用本發(fā)明的檢測試劑盒檢棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的 方法,包含以下步驟:
[0024] (1)棘腹蛙DNA的提?。?br>[0025] ①取病蛙眼、口腔或胃部組織,剪碎后置于勻漿器中,加入勻漿液后冰浴研磨,研 磨碎裂后置離心管中;
[0026] ②加入1 % -3%的β -巰基乙醇溶液,混勻后60_70°C水浴0. 5-lh,每隔3-5分鐘 取出搖勻一次;
[0027] ③10000-15000rpm離心3_7min,離心后,移出上清液于另一無菌離心管中,棄沉 淀;
[0028] ④向上清液中加入等體積的按體積比20-30 :1的氯仿:異戊醇的混合溶劑,混勻 后,8000_12000rpm離心5_15min,取上清液至另一無菌離心管中;
[0029] ⑤加入等體積的氯仿,混勾后8000-12000rpm離心5-15min,再取上清液;
[0030] ⑥向上清液中加入0. 8-1. 2倍體積的2-4M NaAc溶液,混勻后再加入1. 5-2. 5倍 體積預(yù)冷的無水乙醇,充分混勻后于-18°C以下放置30min以上;
[0031] ⑦10000-15000rpm離心3_7min,棄上清液,所得DNA沉淀在室溫下瞭干;
[0032] ⑧用70-80 %的乙醇對DNA沉淀進(jìn)行洗滌,干燥后沉淀溶于TE中,加 RNase A,37°C 消化20-40min,得到棘腹蛙DNA之后于-20°C保存;
[0033] (2) PCR反應(yīng)體系:采用20 yL的PCR反應(yīng)體系,在0. 2mL PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入2 倍反應(yīng)混合緩沖液10 μ L,上游引物、下游引物各0. 5 μ L,5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ L, DNA模板I. 0 μ L,用滅菌超純水加至總體積20 μ L,同時(shí)分別用陽性對照液和陰性對照液作 為模板,設(shè)置陽性和陰性對照組,混合均勻后離心數(shù)秒,置于PCR反應(yīng)儀上反應(yīng);
[0034] (3) PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5分鐘;然后95°C變性30秒,56°C退火30秒,72°C 延伸30秒,共循環(huán)30次;72°C延伸7分鐘,最后4°C保存;
[0035] (4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測:PCR反應(yīng)結(jié)束后,取10 μ L反應(yīng)產(chǎn)物放在含溴化乙錠 0. 5 μ g/mL的1 %瓊脂糖凝膠上,使用0. 5 X TAE緩沖液進(jìn)行電泳,在紫外透射儀下觀察PCR 產(chǎn)物,檢查PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小;
[0036] (5)結(jié)果與判定:在紫外燈下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對照,若檢測樣品在226bp處 出現(xiàn)明亮的條帶,而陰性對照沒有目的條帶,則為金黃色葡萄球菌陽性;若陽性對照可見目 的條帶,而檢測樣品無目的條帶出現(xiàn),則為陰性,沒有或不是所要檢測的目的金黃色葡萄球 菌。
[0037] 在一具體實(shí)施方案中,一種檢測棘腹蛙的金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒,包 括:
[0038] (1)2倍反應(yīng)混合緩沖液1.0 mL,包含以下成分:
[0041] (2)檢測引物的設(shè)計(jì)合成:根據(jù)GenBank中發(fā)布的棘腹蛙的基因序列,設(shè)計(jì)一 對特異性檢測引物,上游引物S-F : 5 ' -AGGTAACGGCGTAAATAG - 3 ',下游引物S-R : 5 ' - ACTTGCTTCAGGACCATA - 3',濃度為 10 μ M ;
[0042] (3) Taq 酶 5U/ μ L ;
[0043] (4)滅菌的 ddH20 1.0 mT,;
[0044] (5)陽性對照液:感染金黃色葡萄球菌的棘腹蛙的基因組DNA ;
[0045] (6)陰性對照液:CldH2O。
[0046] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的檢測棘腹蛙的金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒及其 檢測方法具有以下特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn):
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