與相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2011年12月5日提出的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，為了所有目的其整體內(nèi)容通過引用并入本文。對作為ASCII文本文件提交的”序列表，”表，或計算機程序表附錄的引用2012年12月28日創(chuàng)建的，寫于file-939-1PC.TXT中的序列表(12,288字節(jié)，機器格式IBM-PC，MS-Windows操作系統(tǒng))，為了所有目的，在此以其整體通過引用并入。發(fā)明背景乳糜瀉(celiacdisease，CD)是嚴(yán)重的胃腸疾病，其具有強烈的遺傳組分。CD表征為對來自小麥，大麥，黑麥，和燕麥的蛋白的永久性不耐受。盡管不完全了解CD的病理生理學(xué)，但明顯患者的飲食中的毒性蛋白的存在引起腸粘膜的完全或部分損傷(Brandtzaeg，P.1997.Mechanismsofgastrointestinalreactionstofood.EnvironmentalToxicologyandPharmacology4；9-24)導(dǎo)致嚴(yán)重的吸收不良綜合征(malabsorptionsyndromes)并且引起乳糜瀉，嘔吐，腹痛，厭食癥，生長阻滯，營養(yǎng)不良和貧血。CD已與在未診斷和未治療的患者中腸癌(intestinalcancer)的更高風(fēng)險關(guān)聯(lián)(HolmesGKT，1989.Malignancyincoeliacdisease-effectofagluten-freediet，Gut30；333-338)。CD主要影響三歲以下兒童，但其在成人中也常見，并且有時是臨床非典型的或無臨床癥狀的(FergusonA，等人1992.Definitionsanddiagnosticcriteriaoflatentandpotentialcoeliacdisease.由AurricchioS，VisakorpiJK，在EpidemiologyofCD中編輯.DynNutrRes，Basel，Karger2；119-127)。CD在具有其它遺傳或自身免疫病(比如胰島素依賴性糖尿病(insulindependentdiabetesmellitus)，唐氏綜合征(Downsyndrome)，選擇性IgA缺陷(selectiveIgAdeficiency)，和皰疹樣皮炎(dermatitisherpetiformis))的患者中更常見(SirgusN等人1993.PrevalenceofcoeliacdiseaseindiabeticchildrenandadolescentsinSweden.ActaPediatr66；491-494；ZubillagaP等人1993.Downsyndromeandcoeliacdisease.JPediatrGastroenterolNutr16：168-171；BoyceN1997)。CD的臨床癥狀可能與由其它腸胃疾病產(chǎn)生的那些混淆。在這些情況中，CD被誤診并且患者未接受特異的治療，即，在其飲食中完全排除谷蛋白。在另一方面，如果非乳糜瀉患者被錯誤地診斷為乳糜瀉，他將在其一生承受不必要的無谷蛋白飲食。因此，CD的精確診斷至關(guān)重要。當(dāng)前CD診斷的標(biāo)準(zhǔn)為腸道活檢，重復(fù)三次：在臨床癥狀的開始，無谷蛋白飲食之后幾個月，和用谷蛋白激發(fā)后。因為腸道活檢是侵入性方法并且已經(jīng)開發(fā)了精確的血清學(xué)測試，因此以上標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)被修訂(Walker-Smith等人1990.Revisedcriteriafordiagnosisofcoeliacdisease.ReportofWorkinggroupofEuropeanSocietyofPediatricGastroenterologyandNutrition.ArchDisChild65：909-911)。目前，可以在臨床癥狀的開始進行血清學(xué)測試并且當(dāng)它們是陽性時，將指示驗證性腸道活檢。對用無谷蛋白飲食治療的反應(yīng)也可以繼之以血清學(xué)測試。如果在對治療的臨床反應(yīng)和血清學(xué)測試的結(jié)果差異發(fā)生，將指示第二次腸道活檢。對于乳糜瀉診斷，已經(jīng)開發(fā)一些血清學(xué)測試，比如檢測針對對細胞抗原的抗體，或針對食物抗原(比如麥醇溶蛋白)的抗體。存在用于檢測抗肌內(nèi)膜抗體，抗網(wǎng)硬蛋白抗體，抗麥醇溶蛋白抗體，和抗組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體的診斷試劑盒?？果湸既艿鞍卓贵w(AGA)已廣泛被用于CD的血清學(xué)診斷(SternM等人1996.Validationandstandardizationofserologicalscreeningtestsforcoeliacdiseasein1996.第三次EMRC/ESPGAN研討會，12月5日-8日，1996，Molsheim，F(xiàn)rance，pp：9-24；CatassiC等人1999.Quantitativeantigliadinantibodymeasurementinclinicalpractice：anItalianmulticenterstudy.ItalJGastroenterolHapatol31；366-370)。主要通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)(比IFA(間接免疫熒光抗體分析)更簡單，更客觀的方法)檢測AGA，并且AGA可以用于分析大量的樣品。盡管如此，對CD，AGA比肌內(nèi)膜抗體(EMA)更不特異并且針對IgA或IgG同種型之一的抗體的檢測需要兩個獨立的測定。近來，已經(jīng)報道用于檢測AGA的可見免疫測定，其解決這些問題中的一些(GarroteJA，SorellL，AlfonsoP等人1999.Asimplevisualimmunoassayforthescreeningofcoeliacdisease.Eur.JClinInvest29；697-699；西班牙專利和商標(biāo)局No.9801067)。在1997年，Dietrich等人鑒別了組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)(85kDa蛋白)為由抗肌內(nèi)膜抗體檢測的主要的自身抗原(DietrichW等人1997.Identificationoftissuetransglutaminzseastheautoantigenofceliadisease.NatMed.3：797-801)。近來已經(jīng)報到以ELISA或放射配體(RLA)形式基于源自豚鼠肝提取物tTG或從不同組織克隆的重組人tTG檢測抗tTG抗體(SulkanenS等人1998.Tissuetransglutaminzseautoantibodyenzyme-linkedimmunosorbentassayindetectingceliacdisease.Gastroenterology115：1322-1328；SiesslerJ等人1999.Antibodiestohumanrecombinanttissuetransglutaminzsemeasuredbyradioligandassay：Evidenceforhighdiagnosticsensitivityforceliacdisease.HormMetabRes31；375-379)。檢測乳糜瀉的現(xiàn)有技術(shù)方法在測定中使用特定的麥醇溶蛋白表位或所述麥醇溶蛋白的部分，其導(dǎo)致假陰性和假陽性。需要的是這樣的測定法：提供包含一組更具包容性的，提供對于乳糜瀉更精確測定的表位的新抗原。另人驚訝的是，本發(fā)明滿足了這個和其它需求。發(fā)明概述在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測乳糜瀉的抗原。所述抗原包括含有肽六聚體的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白，每個所述肽具有SEQIDNO：1，其中所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白共價連接于標(biāo)簽以形成麥醇溶蛋白融合蛋白，其中所述麥醇溶蛋白融合蛋白固定在固體支持物上，并且其中所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白能夠結(jié)合抗脫酰胺化麥醇溶蛋白抗體。在其它實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測乳糜瀉的抗原，所述抗原通過包括以下步驟的方法制備：將固體支持物與麥醇溶蛋白融合蛋白接觸，其中所述麥醇溶蛋白融合蛋白包含肽六聚體的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白，每個所述肽具有SEQIDNO：1并且其中所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白共價連接于標(biāo)簽，這樣以致所述麥醇溶蛋白融合蛋白固定在固體支持物上。這樣制備了用于檢測乳糜瀉的抗原。在一些其它實施方案中，本發(fā)明提供診斷受試者中乳糜瀉的方法。所述方法包括將來自受試者的體液樣品與本發(fā)明的抗原接觸，所述抗原包括含有SEQIDNO：3的六聚體的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白。所述方法還包括檢測特異結(jié)合抗原的任何抗體，由此指示所述受試者中乳糜瀉的存在。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的抗原，其中重組脫酰胺化麥醇溶蛋白包含SEQIDNO：3的六聚體，檢測試劑，和任選地緩沖劑，鹽，穩(wěn)定劑和說明書中的至少一種。附圖簡述圖1顯示D2-六聚體的純化。圖2顯示DGP六聚體的包被滴定：校正截止值信號相對熒光強度(RFI)。圖3顯示在位置14賴氨酸替代谷氨酸殘基的DGP六聚體的包被滴定：校正截止值信號RFI。圖4顯示與rDGP三聚體相比，rDGP六聚體已改善靈敏度。發(fā)明詳述I.定義如在本文使用的，術(shù)語“接觸”指將至少兩個不同的個體相接觸的過程，這樣以致它們可以反應(yīng)。產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物直接從添加的試劑之間的反應(yīng)產(chǎn)生或從可以在反應(yīng)混和物中產(chǎn)生的來自一種或更多添加的試劑的中間產(chǎn)物產(chǎn)生。如在本文使用的，術(shù)語“體液”指哺乳動物的液體，包括，但不限于，水質(zhì)的體液，膽汁，血液和血漿，母乳，間質(zhì)液，淋巴液，粘液，胸膜液，膿液，唾液，血清，汗液，淚液，尿液，腦脊液，滑液或胞內(nèi)液。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它體液用于本發(fā)明。如在本文使用的，術(shù)語“交聯(lián)劑”指能夠?qū)蓚€分開的部分連接在一起的雙功能或多功能化學(xué)或生物學(xué)部分。用于本發(fā)明的交聯(lián)劑實例在下文描述。如在本文使用的，“抗體”包括涉及在免疫學(xué)上與特定抗原反應(yīng)的免疫球蛋白分子，并且包括單克隆和多克隆抗體二者。如在本文使用的，術(shù)語“受試者”指動物(比如哺乳動物)，包括，但不限于，靈長類(例如，人)，牛，綿羊，山羊，馬，狗，貓，兔，大鼠，小鼠等。如在本文使用的，術(shù)語“固定的”指所述tTG，所述麥醇溶蛋白融合蛋白或所述tTG-麥醇溶蛋白融合蛋白復(fù)合物與固體支持物物質(zhì)通過共價鍵形成，離子鍵形成，氫鍵，偶極-偶極相互作用或通過范德華相互作用關(guān)聯(lián)。所述固定可以是暫時的或永久的。如在本文使用的，術(shù)語“抗原”指能夠比如通過抗體的產(chǎn)生刺激免疫應(yīng)答的分子。本發(fā)明的抗原包括固定于固體支持物的麥醇溶蛋白融合蛋白和固定于固體支持物的tTG-麥醇溶蛋白融合蛋白復(fù)合物。本發(fā)明的麥醇溶蛋白融合蛋白可以包括重組脫酰胺化麥醇溶蛋白和標(biāo)簽(比如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白)二者。如在本文使用的，術(shù)語“緩沖劑”指抵抗pH的改變和維持pH在所需的點左右的任何無機或有機酸或堿。用于本發(fā)明的緩沖劑包括，但不限于，氫氧化鈉，無水磷酸氫二鈉，和其混和物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它緩沖劑用于本發(fā)明。如在本文使用的，術(shù)語“組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)”指在賴氨酸殘基的氨基基團和谷氨酰胺殘基的甲酰胺基團之間交聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族的酶。這產(chǎn)生分子間或分子內(nèi)鍵。tTG可以用于檢測乳糜瀉。如在本文使用的，術(shù)語“麥醇溶蛋白融合蛋白”指連接于標(biāo)簽，比如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或His標(biāo)簽的麥醇溶蛋白。所述麥醇溶蛋白包括重組麥醇溶蛋白或合成的麥醇溶蛋白，等等。在一些實施方案中，所述麥醇溶蛋白是脫酰胺的。標(biāo)簽典型地是其它可以用作用于純化，用于增溶，層析的親和標(biāo)簽，用作表位標(biāo)簽，熒光標(biāo)簽等蛋白或化合物。用于本發(fā)明的標(biāo)簽包括，但不限于，BCCP，c-myc-標(biāo)簽，鈣調(diào)蛋白-標(biāo)簽，F(xiàn)LAG-標(biāo)簽，HA-標(biāo)簽，His-標(biāo)簽，麥芽糖結(jié)合蛋白-標(biāo)簽，Nus-標(biāo)簽，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽，綠色熒光蛋白-標(biāo)簽，硫氧還蛋白-標(biāo)簽，S-標(biāo)簽，StreptagII，Softag1，Softag3，T7-標(biāo)簽，類彈性蛋白肽，殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和木聚糖酶10A。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它蛋白用于本發(fā)明的融合蛋白。如在本文使用的，術(shù)語“tTG-麥醇溶蛋白融合蛋白復(fù)合物”指當(dāng)所述tTG和所述麥醇溶蛋白融合蛋白連接在一起時形成的復(fù)合物。所述tTG和所述麥醇溶蛋白融合蛋白可以在多種反應(yīng)下以多種方式連接。所述tTG可以連接于所述標(biāo)簽和所述麥醇溶蛋白融合蛋白的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白之一或二者。如在本文使用的，術(shù)語“重組脫酰胺化麥醇溶蛋白”指通過遺傳工程制備的脫酰胺化麥醇溶蛋白。脫酰胺化蛋白是使游離酰胺功能基團的一些或全部水解為羧酸，比如轉(zhuǎn)變谷氨酰胺為谷氨酸。在一些實施方案中，用于本發(fā)明的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白包括含有與SEQIDNO：1至少75％序列同一性的肽或包括含有與SEQIDNO：3至少75％序列同一性的六聚體。如在本文使用的，術(shù)語“交聯(lián)的”指兩個不同的化學(xué)部分之間形成多于一個鍵。在本發(fā)明中，所述化學(xué)部分可以是生物學(xué)種類，比如蛋白，酶，抗體，等，或固體支持物物質(zhì)。連接交聯(lián)的個體化學(xué)部分的化學(xué)功能性被稱為“交聯(lián)劑”。交聯(lián)劑典型地是雙功能化合物，所述雙功能化合物與一個化學(xué)部分上的一個反應(yīng)性功能基團和另一個化學(xué)部分上的一個反應(yīng)性功能基團反應(yīng)，從而將兩個化學(xué)部分彼此連接的。所述交聯(lián)劑可以是同型雙功能交聯(lián)劑或異型雙功能交聯(lián)劑。同型雙功能交聯(lián)劑是其中同型雙功能交聯(lián)劑的與各個化學(xué)部分反應(yīng)的功能基團相同的那些。異型雙功能交聯(lián)劑是其中異型雙功能交聯(lián)劑的與各個化學(xué)部分反應(yīng)的功能基團不同的那些。本發(fā)明的優(yōu)選的同型雙功能和異型雙功能交聯(lián)劑在下文更詳細地描述。如在本文使用的，在兩條或更多條核酸或多肽序列的情況下的術(shù)語“同一的”或“同一性”百分?jǐn)?shù)，指，當(dāng)比較和比對比較窗口或如使用以下序列比較算法或通過手動比對和肉眼檢查測量的指定區(qū)域的最大對應(yīng)時，相同或具有相同的指定的氨基酸殘基或核苷酸百分?jǐn)?shù)的兩條或更多條序列或子序列(即，對指定區(qū)域有60％同一性，優(yōu)選65％，70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性)。該定義還指測試序列的互補序列。在兩條核酸或多肽的情況下，措辭“基本上同一的”，指與參考序列具有至少40％序列同一性的序列或子序列。備選地，同一性百分?jǐn)?shù)可以是從40％至100％的任何整數(shù)。更優(yōu)選的實施方案包括使用本文描述的程序與參考序列相比至少：40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％；優(yōu)選如下文描述的使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST。為了序列比較，典型地一條序列用作參考序列，測試序列與其比較。當(dāng)使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機，如果需要，指定子序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。可以使用缺省程序參數(shù)，或可以指定備選的參數(shù)。序列比較算法隨后基于程序參數(shù)計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。為了核酸和蛋白的序列比較，使用下文討論的BLAST和BLAST2.0算法和缺省參數(shù)。適于確定序列同一性百分?jǐn)?shù)和序列相似性的優(yōu)選的算法實例是BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述于Altschul等人，Nuc.AcidsRes.25：3389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。與本文描述的參數(shù)一起使用BLAST和BLAST2.0以確定本發(fā)明的核酸和蛋白的序列同一性百分?jǐn)?shù)。通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公眾可獲得用于進行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過在查詢序列中鑒別長度W的短詞鑒別高得分序列對(HSPs)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的詞比對時，其匹配或滿足一些正值的閾值評分T。T被稱為鄰域詞得分閾值(Altschul等人，同前)。這些起始鄰域詞的命中用作用于起始找到包含它們的更長的HSPs搜索的種子。詞命中在延各個序列的兩個方向延伸直到累積的比對得分可以增加。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(對一對匹配殘基的獎勵得分；始終＞0)和N(對錯配殘基的罰分；始終＜0)計算累積得分。對于氨基酸序列，使用得分矩陣以計算累積得分。當(dāng)累積比對得分從最大獲得值以量X減少；由于一個或更多個負得分殘基比對，累積得分到0或更低；或到達兩條序列中任一個的末端時，在各個方向上詞命中的延伸終止。BLAST算法參數(shù)W，T，和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用詞長(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩條鏈的比較作為缺省值。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用詞長為3，和期望值(E)為10，和BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))比對(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，和兩條鏈的比較作為缺省值。BLAST算法還對兩條序列間的相似性進行統(tǒng)計分析(參見，例如，Karlin&Altschul，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993)).由BLAST算法提供的一種相似性測量是最小和概率(smallestsumprobability)(P(N))，其提供兩條核苷酸或氨基酸序列堿的匹配將偶然發(fā)生的可能性的指示。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中，最小和概率小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，和最優(yōu)選小于約0.001，核酸被認(rèn)為與參考序列相似。如在下文描述的，兩條核酸序列或多肽基本上相同的指征是，由第一核酸編碼的多肽與針對由第二核酸編碼的多肽引起的抗體在免疫學(xué)上交叉反應(yīng)。因此，多肽典型地與第二多肽相同基本上相同，例如，其中所述兩個肽僅相差保守的置換。兩條核酸序列基本上相同的另一個指征是兩個分子或其互補序列在嚴(yán)格條件下彼此雜交。兩條核酸序列基本上相同的又一個指征是同樣的引物可以用于擴增所述序列。如在本文使用的，術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”同義地使用并指從5’到3’末端讀的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。本發(fā)明的核酸將通常包含磷酸二酯鍵，盡管在一些情況下，可以使用核酸模擬物，所述核酸模擬物可以具有備選的主鏈，包括，例如，氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，或O-甲基磷酰胺連接(參見Eckstein，OligonucleotidesandAnalogues：APracticalApproach，OxfordUniversityPress)；和肽核酸主鏈和連接。其它模擬物核酸包括具有正電主鏈，非離子主鏈和非核糖主鏈的那些。因此，核酸或多核苷酸還可以包括允許由聚合酶正確讀通的修飾的核苷酸?！岸嗪塑账嵝蛄小被颉昂怂嵝蛄小卑ê怂岬淖鳛閭€體單鏈或在雙鏈體中的正義和反義鏈二者。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，單鏈的描述限定了互補鏈的序列；因此本文描述的序列也提供序列的互補序列。除非另有指示，特定核酸序列還隱含包括其變體(例如，簡并密碼子置換)和互補序列，以及明確指示的序列。所述核酸可以是DNA(基因組的和cDNA二者)，RNA或雜合物，其中所述核酸可以包含脫氧核糖-和核糖-核苷酸的組合，和包括尿嘧啶，腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，鳥嘌呤，肌苷，黃嘌呤次黃嘌呤，異胞嘧啶，異鳥嘌呤等的堿基的組合。如在本文使用的，措辭“編碼…的核酸序列”指包含對于結(jié)構(gòu)RNA(比如rRNA，tRNA)，或特定蛋白或肽的主要氨基酸序列，或反式作用調(diào)控劑的結(jié)合位點的序列信息的核酸。該措辭具體包括天然序列或可以引入以與特定宿主細胞中的密碼子偏愛一致的序列的簡并密碼子(即，編碼單個氨基酸的不同密碼子)。如在本文使用的，術(shù)語“特異結(jié)合”指通過指示乳糜瀉存在的抗體捕獲或誘捕本發(fā)明的抗原。因此，在指定的免疫測定條件下，抗體(例如，抗脫酰胺化麥醇溶蛋白抗體)以至少兩倍于背景水平和更典型地已至少5，10，20，30，40，或50倍于背景水平結(jié)合本發(fā)明的抗原?？梢允褂枚喾N免疫測定形式以確定抗體是否特異結(jié)合本發(fā)明的抗原。例如，固相ELISA免疫測定常規(guī)用于確定抗體是否與蛋白特異免疫反應(yīng)(參見，例如，Harlow和Lane，UsingAntibodies，ALaboratoryManual(1998)foradescriptionofimmunoassayformatsandconditionsthatcanbeusedtodeterminespecificimmunoreactivity)。II.抗原本發(fā)明提供用于檢測乳糜瀉的抗原和方法。所述抗原包括固定在固體支持物物質(zhì)上的麥醇溶蛋白融合蛋白。所述麥醇溶蛋白融合蛋白包括重組脫酰胺化麥醇溶蛋白和標(biāo)簽二者。所述抗原可以任選地包括組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)。當(dāng)存在時，在固定于固體支持物上之前，所述麥醇溶蛋白融合蛋白和tTG可以比如通過轉(zhuǎn)酰胺基作用共價連接，以形成tTG-麥醇溶蛋白融合蛋白復(fù)合物。將tTG-麥醇溶蛋白融合蛋白復(fù)合物固定在固體支持物上之后，可用使用交聯(lián)劑交聯(lián)所述麥醇溶蛋白融合蛋白和所述tTG。在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測乳糜瀉的抗原。本發(fā)明的抗原包括下文描述的結(jié)合固體支持物的麥醇溶蛋白融合蛋白。在其它實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測乳糜瀉的抗原。所述抗原包括具有肽六聚體的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白，所述肽各自具有SEQIDNO：1的序列，其中所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白共價連接于標(biāo)簽以形成麥醇溶蛋白融合蛋白，其中所述麥醇溶蛋白融合蛋白固定在固體支持物上，并且其中所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白能夠結(jié)合抗脫酰胺化麥醇溶蛋白抗體。A.麥醇溶蛋白融合蛋白用于本發(fā)明的麥醇溶蛋白融合蛋白包括表達為帶標(biāo)簽的蛋白的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)可很多重組麥醇溶蛋白用于本發(fā)明的方法。在一些實施方案中，所述重組麥醇溶蛋白可以包括D2(Aleanzi等人，ClinChem2001，47(11)，2023)，肽序列：QPEQPQQSFPEQERPF(SEQIDNO：1)。所述重組麥醇溶蛋白還可以包括由下式表示的D2變體：X1PX2X3PX4X5SFPX6X7X8RPF(SEQIDNO：12)其中每個X是谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)，這樣以致至少一個X是谷氨酰胺并且至少一個X是谷氨酸。本發(fā)明的重組麥醇溶蛋白還可以是D2或其變體的六聚體。在一些實施方案中，所述重組麥醇溶蛋白是由任何合適的間隔區(qū)，比如GGGGS(SEQIDNO：2)分開的D2或其變體的六聚體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它間隔區(qū)用于本發(fā)明。任何合適的間隔區(qū)用于本發(fā)明，并且與接頭可互換。典型的肽間隔區(qū)序列包含Gly，Ser，Ala和Thr殘基。有用的間隔區(qū)包括甘氨酸-絲氨酸聚合物，所述聚合物包括，例如，(GGGGS)n(SEQIDNO：13)，(GS)n，(GSGGS)n(SEQIDNO：14)，和(GGGS)n(SEQIDNO：15)，其中n是至少為一的整數(shù)；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-絲氨酸聚合物；和其它柔性接頭。在一些實施方案中，所述六聚體包括將各個肽分開的間隔區(qū)，所述間隔區(qū)具有SEQIDNO：1的序列。在其它實施方案中，每個間隔區(qū)可以具有SEQIDNO：2的序列。在一些實施方案中，所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白是D2六聚體(SEQIDNO：3)。在一些其它的實施方案中，本發(fā)明提供編碼SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的序列中的多肽的任何核苷酸序列。本發(fā)明的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白結(jié)合抗脫酰胺化麥醇溶蛋白抗體，并且因此能夠診斷具有谷蛋白相關(guān)疾病(比如乳糜瀉)的受試者。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它重組脫酰胺化麥醇溶蛋白用于本發(fā)明。所述麥醇溶蛋白融合蛋白還包括標(biāo)簽。任何本領(lǐng)域已知的標(biāo)簽用于本發(fā)明麥醇溶蛋白融合蛋白。本發(fā)明抗原中合適的標(biāo)簽包括，但不限于，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，His-標(biāo)簽，F(xiàn)LAG，StreptagII，HA-標(biāo)簽，Softag1，Softag3，c-myc，T7-標(biāo)簽，S-標(biāo)簽，類彈性蛋白肽，殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，硫氧還蛋白，木聚糖酶10A，麥芽糖結(jié)合蛋白和NusA。在一些實施方案中，所述標(biāo)簽是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或His-標(biāo)簽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它標(biāo)簽用于本發(fā)明。所述標(biāo)簽典型地通過共價連接與重組麥醇溶蛋白連接。用于本發(fā)明的His-標(biāo)簽可以是任何合適的His-標(biāo)簽。適于本發(fā)明的His-標(biāo)簽包括，但不限于，SEQIDNO：4，SEQIDNO：5，或SEQIDNO：6的序列。在一些實施方案中，所述His-標(biāo)簽可以是SEQIDNO：5或SEQIDNO：6的序列。在其它實施方案中，所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白可以是SEQIDNO：7或SEQIDNO：8的序列。在另一個實施方案中，所述標(biāo)簽是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白。所述GST蛋白(SEQIDNO：10)行使很多功能，包括使重組麥醇溶蛋白的純化和在重組麥醇溶蛋白中表示的表位的呈現(xiàn)可行。當(dāng)包括GST和重組脫酰胺化麥醇溶蛋白的麥醇溶蛋白融合蛋白為D2六聚體時，麥醇溶蛋白融合蛋白由SEQIDNO：11的序列表示。在一些實施方案中，本發(fā)明提供編碼SEQIDNO：11的序列中多肽的任何核苷酸序列?？梢酝ㄟ^多種方法制備本發(fā)明的麥醇溶蛋白融合蛋白，包括通過重組方法(比如描述的那些)。麥醇溶蛋白融合蛋白在固體支持物上的固定可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。可以通過共價或離子鍵形成，氫鍵，范德華力，以及通過抗體-抗原相互作用將麥醇溶蛋白融合蛋白固定于固體支持物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它固定方法用于本發(fā)明。在一些實施方案中，所述抗原還包括組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)。當(dāng)tTG存在時，所述tTG和麥醇溶蛋白融合蛋白形成tTG-麥醇溶蛋白融合蛋白復(fù)合物。所述tTG和所述麥醇溶蛋白融合蛋白可以以多種方式連接，比如通過共價鍵，離子鍵，氫鍵的形成，或通過范德華相互作用。當(dāng)所述tTG和所述麥醇溶蛋白融合蛋白共價連接時，所述共價鍵可以通過多種反應(yīng)，比如轉(zhuǎn)酰胺基作用形成。所述轉(zhuǎn)酰胺基作用可以在多種條件下，比如在Ca2+存在下發(fā)生。所述tTG可以連接于所述標(biāo)簽和麥醇溶蛋白融合蛋白的所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白之一或二者。所述tTG在如固定所述麥醇溶蛋白融合蛋白相同的條件下和相同的時間固定于固體支持物。組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在前已描述，參見NCBIRefSeqNP_004604和NP_945189(2008年4月13日)。在其它實施方案中，所述tTG和所述麥醇溶蛋白融合蛋白通過交聯(lián)劑共價連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解比如通過離子鍵，氫鍵或通過范德華力的其它交聯(lián)方法是可用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)可在本發(fā)明中合適的任何交聯(lián)劑。在一些實施方案中，所述交聯(lián)劑是選自由異型雙功能交聯(lián)劑和同型雙功能交聯(lián)劑組成的組的成員。在進一步其它實施方案中，所述交聯(lián)劑是同型雙功能交聯(lián)劑。在更進一步的其它實施方案中，所述交聯(lián)劑是選自由以下各項組成的組的成員：二(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸酯(BS3)，乙二醇二[琥珀酰業(yè)胺琥珀酸酯](EGS)，乙二醇二[磺基琥珀酰蛇胺琥珀酸酯](磺基-EGS)，二[2-(琥珀酰亞氨基氧羰基氧)乙基]砜(BSOCOES)，二硫二(琥珀酰亞胺)丙酸酯(DSP)，3，3′-二硫二(磺基琥珀酰亞胺丙酸酯)(DTSSP)，二琥珀酰亞胺辛二酸酯(DSS)，二琥珀酰亞胺戊二酸酯(DSG)，甲基N-琥珀酰亞胺己二酸酯(MSA)，二琥珀酰亞胺酒石酸酯(DST)，1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)，1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC或EDAC)，磺基琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)，N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)，羥胺和磺基-LC-SPDP(N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯)和磺基琥珀酰亞胺6-(3′-[2-吡啶基二硫]-丙酰氨基)己酸酯(磺基-LC-SPDP)。在另一個實施方案中，所述交聯(lián)劑是二(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸酯(BS3)。在一個進一步的實施方案中，所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白具有與SEQIDNO：395％的同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，當(dāng)比較和比對與表窗口或指定區(qū)域的最大的對應(yīng)時，其它同一性百分?jǐn)?shù)是可能的，比如60％同一性，優(yōu)選相對指定區(qū)域65％，70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。此種序列隨后被稱為“基本上相同”。與SEQIDNO：3的序列具有一些同一性百分?jǐn)?shù)的本發(fā)明的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白可以結(jié)合樣品中的抗麥醇溶蛋白抗體，以檢測乳糜瀉。在一些其它的實施方案中，所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白具有SEQIDNO：3的序列。B.固體支持物用于本發(fā)明的固體支持物物質(zhì)通過以下性質(zhì)表征：(1)不溶于用于篩選的液相；(2)能夠不依賴于其它所有支持物在三個維度移動；(3)包含很多拷貝的麥醇溶蛋白融合蛋白或tTG-麥醇溶蛋白融合蛋白復(fù)合物；(4)與篩選測定條件的相容性；和(5)對測定條件是惰性的。優(yōu)選的支持物還具有反應(yīng)性功能基團，包括，但不限于，羥基，羧基，氨基，巰基，醛，鹵素，硝基，氰基，酰胺基，脲，碳酸酯，氨基甲酸酯，異氰酸酯，砜，磺酸酯，磺胺，亞砜等，用于連接麥醇溶蛋白融合蛋白和tTG。如在本文使用的，固體支持物物質(zhì)不限于支持物的特定類型。而是大量支持物是可用的并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。固相支持物包括硅膠，樹脂，衍生的塑料薄膜，珠(比如玻璃珠，塑料珠或磁珠)，棉，氧化鋁凝膠，多糖(比如瓊脂糖等)，等。其它固體支持物可以是ELISA微量滴定板。合適的固相支持物可以根據(jù)所需的最終用途和各種合成方案的適用性選擇。例如，在聚酰胺合成中，有用的固相支持物可以是樹脂比如聚苯乙烯(例如，獲自BachemInc.，PeninsulaLaboratories的PAM-樹脂，等)，POLYHIPETM樹脂(獲自Aminotech，Canada)，聚酰胺樹脂(獲自PeninsulaLaboratories)，接枝有聚乙二醇的聚苯乙烯樹脂(TentaGelTM，RappPolymere，Tubingen，Germany)，聚二甲基-丙烯酰胺樹脂(獲自Milligen/Biosearch，California)，或PEGA珠(獲自PolymerLaboratories)。優(yōu)選的用于特定合成的固相合成支持物在下文描述。在一些實施方案中，所述固體支持物是珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)可很多類型的固體支持物用于本發(fā)明.C.制備重組脫酰胺化麥醇溶蛋白抗原的方法在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測乳糜瀉的通過以下方法制備的抗原，所述方法包括將固體支持物與麥醇溶蛋白融合蛋白接觸，其中所述麥醇溶蛋白融合蛋白包括具有肽六聚體的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白，所述肽各自具有SEQIDNO：1的序列并且其中所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白共價連接于標(biāo)簽，以致麥醇溶蛋白融合蛋白固定在固體支持物上。從而，制備用于檢測乳糜瀉的抗原。制備重組脫酰胺化麥醇溶蛋白抗原的方法可以制備上文描述的任何重組脫酰胺化麥醇溶蛋白抗原。所述標(biāo)簽在上文描述。在一些實施方案中，所述標(biāo)簽是GST或His-標(biāo)簽。在另一個實施方案中，所述標(biāo)簽是GST。在一些實施方案中，所述麥醇溶蛋白融合蛋白通過所述標(biāo)簽固定在固體支持物上。固體支持物為如以上描述的。在一些實施方案中，所述固體支持物是珠，比如磁珠。在一些實施方案中，所述固體支持物具有功能反應(yīng)性基團。當(dāng)tTG存在時，所述方法還可以包括在接觸步驟之前，在麥醇溶蛋白融合蛋白和tTG之間形成共價鍵以形成tTG-麥醇溶蛋白融合蛋白復(fù)合物。在接觸步驟過程中和/或接觸步驟之后，在麥醇溶蛋白融合蛋白tTG間形成共價鍵的過程還可以發(fā)生。麥醇溶蛋白融合蛋白和tTG的復(fù)合可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法發(fā)生。在一些實施方案中，所述復(fù)合通過轉(zhuǎn)酰胺基作用發(fā)生以形成共價鍵。在其它實施方案中，所述方法進一步包含將固體支持物與交聯(lián)劑接觸以交聯(lián)麥醇溶蛋白融合蛋白和tTG。在一些其它的實施方案中，所述交聯(lián)劑將GST蛋白交聯(lián)于tTG。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解任何交聯(lián)劑在本發(fā)明的方法中是有用的，比如上文描述的那些。交聯(lián)可以通過氫鍵，共價或離子鍵形成發(fā)生。1.一般重組方法本發(fā)明可以使用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)制備重組脫酰胺化麥醇溶蛋白多肽。公開在本發(fā)明中使用的一般方法的基礎(chǔ)文字材料包括Sambrook&Russell，MolecularCloning，ALaboratoryManual(第三版，2001)；Kriegler，GeneTransferandExpression：ALaboratoryManual(1990)；和CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等人，編輯，1994-1999).可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)表達例如，包括重組脫酰胺化麥醇溶蛋白和標(biāo)簽(比如GST標(biāo)簽或His標(biāo)簽)的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白，或融合蛋白?？梢允褂谜婧撕驮怂拗骷毎?，比如動物細胞，昆蟲細胞，細菌，真菌和酵母。技術(shù)人員公知在表達分離的核酸中使用宿主細胞的方法，并可以例如，在同前的一般參考文獻中找到該方法。因此，本發(fā)明還提供包括本文描述的核酸序列的宿主細胞和表達載體。可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組或合成技術(shù)制備編碼例如包括重組脫酰胺化麥醇溶蛋白和標(biāo)簽(比如GST標(biāo)簽或His標(biāo)簽)的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白，或融合蛋白的核酸。核酸可以是RNA，DNA，或其雜合物。技術(shù)人員可以構(gòu)建多種包含功能上相當(dāng)?shù)暮怂?比如編碼相同多肽的核酸)的克隆。完成這些目的的克隆方法，和驗證核酸序列的測序方法是本領(lǐng)域公知的。在一些實施方案中，體外合成所述核酸?？梢愿鶕?jù)由Beaucage&Caruthers，TetrahedronLetts.22(20)：1859-1862(1981)描述的固相亞磷酰胺三酯方法，使用，例如，如在Needham-VanDevanter，等人，NucleicAcidRes.12：6159-6168(1984)描述的自動合成儀化學(xué)合成脫氧核苷酸。在其它實施方案中，編碼所需蛋白的核酸可以通過擴增反應(yīng)，例如，PCR獲得。技術(shù)人員將認(rèn)可很多其它產(chǎn)生給定多肽序列的改變或變體的方式。最常見的，通過改變相應(yīng)核酸序列和表達多肽改變多肽序列。技術(shù)人員可以基于本文涉及的序列和本領(lǐng)域容易獲得的關(guān)于重組脫酰胺化麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)和功能的知識，選擇本發(fā)明所需的核酸或多肽。對于熟練的從業(yè)者，這些蛋白的物理特性和一般性質(zhì)是已知的。為了獲得包括重組脫酰胺化麥醇溶蛋白和標(biāo)簽(比如GST標(biāo)簽或His標(biāo)簽)的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白，或融合蛋白的高水平表達，構(gòu)建表達載體，所述表達載體包括元件如啟動子以引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子，用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點等。合適的細菌啟動子是本領(lǐng)域公知的并描述于，例如，上文引用的提供表達克隆方法和方案的參考文獻中。用于表達核糖核酸酶的細菌表達系統(tǒng)在，例如，大腸桿菌(E.coli)，芽胞桿菌(Bacillussp.)，沙門氏菌(Salmonella)中可獲得(還參見Palva，等人，Gene22：229-235(1983)；Mosbach，等人，Nature302：543-545(1983)。用于此種表達系統(tǒng)的試劑盒是可市購的。用于哺乳動物細胞，酵母和昆蟲的真核表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的并且也是可市購的。除了啟動子之外，表達載體典型地包括含有對于核酸在宿主細胞中表達所需的所有其它元件的轉(zhuǎn)錄單元或表達盒。典型的表達盒因此包含可操作連接于編碼重組脫酰胺化麥醇溶蛋白或融合蛋白(例如，重組脫酰胺化麥醇溶蛋白-GST融合蛋白)的核酸序列的啟動子，和轉(zhuǎn)錄本的有效多腺苷酸化所需的信號，核糖體結(jié)合位點，和翻譯終止。依賴于所述表達系統(tǒng)，編碼重組脫酰胺化麥醇溶蛋白或融合蛋白(例如，重組脫酰胺化麥醇溶蛋白-GST融合蛋白)的核酸序列可以連接于可切割信號肽序列以促進由轉(zhuǎn)化的細胞分泌編碼的蛋白。如上文指出的，所述表達盒還應(yīng)該在結(jié)構(gòu)基因的下游包含轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域以提供有效的終止。終止區(qū)域可以獲自與啟動子序列相同的基因或可以獲自不同的基因。用于轉(zhuǎn)運遺傳信息到細胞中的特定表達載體不是特別至關(guān)重要的?？梢允褂糜糜谠谡婧嘶蛟思毎磉_的任何常規(guī)載體。標(biāo)準(zhǔn)的細菌表達載體包含質(zhì)粒，比如基于pBR322的質(zhì)粒，pSKF，pET15b，pET23D，pET-22b(+)，和融合表達系統(tǒng)，比如GST和LacZ。還可以向重組蛋白添加表位標(biāo)簽(例如，6-his)以提供分離的方便方法。除了包含編碼序列，T7啟動子，轉(zhuǎn)錄起始子和終止子的表達盒之外，這些載體還包含，pBR322復(fù)制起始位點，bla編碼序列和lac1操縱子?？梢栽诙喾N宿主細胞中表達包括編碼RNase分子或融合蛋白的核酸序列的載體，所述宿主細胞包括大腸桿菌，其它細菌宿主，酵母，和各種高等真核細胞，比如COS，CHO和HeLa細胞系和骨髓瘤細胞系。除了細胞之外，可以通過轉(zhuǎn)基因動物，優(yōu)選綿羊，山羊和牛表達載體。典型地，在該表達系統(tǒng)中，在轉(zhuǎn)基因動物的乳液中表達重組蛋白。通過公知的方法，比如對于大腸桿菌的氯化鈣轉(zhuǎn)化和對于哺乳動物細胞的磷酸鈣處理，脂質(zhì)體融合或電穿孔將本發(fā)明的表達載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至選擇的宿主細胞中?？梢酝ㄟ^由質(zhì)粒上包含的基因(比如amp，gpt，neo和hyg基因)提供的對抗生素的抗性選擇被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細胞。一經(jīng)表達，可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)工序(包括硫酸銨沉淀，柱層析(包括親和層析)，凝膠電泳等)純化表達的蛋白(通常參見，R.Scopes，ProteinPurification，Springer--Verlag，N.Y.(1982)，Deutscher，MethodsinEnzymologyVol.182：GuidetoProteinPurification.，AcademicPress，Inc.N.Y.(1990)；Sambrook和Ausubel，二者都同前。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包括SEQIDNO：9的序列的分離的核酸，其編碼重組麥醇溶蛋白蛋白D2六聚體序列。在其它實施方案中，所述分離的核酸在表達載體中。在一些其它的實施方案中，所述表達載體在宿主細胞中。2.在固體支持物上的固定本發(fā)明的麥醇溶蛋白融合蛋白可以通過本領(lǐng)域已知的有用的固定方法固定于任何有用的固體支持物物質(zhì)?？梢酝ㄟ^共價或離子鍵形成，氫鍵，范德華力，以及通過抗體-抗原相互作用將麥醇溶蛋白融合蛋白固定于固體支持物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它固定方法用于本發(fā)明。已經(jīng)開發(fā)了使能夠以類似于抗體的方式固定的其它化合物。某些這些“抗體模擬物”使用非免疫球蛋白的蛋白骨架作為用于抗體可變區(qū)的備選蛋白框架區(qū)。例如，Ladner等人(美國專利5,260,203)描述了具有類似于聚集的，但分子狀態(tài)上分離的，抗體輕和重鏈可變區(qū)的結(jié)合特異性的單多肽鏈結(jié)合分子。所述單鏈結(jié)合分子包含通過肽接頭連接的抗體的重和輕鏈可變區(qū)二者的抗原結(jié)合位點并且將折疊為類似兩個肽抗體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)。所述單鏈結(jié)合分子相對常規(guī)抗體顯示一些優(yōu)勢，包括，更小的尺寸，更好的穩(wěn)定性并且更易于修飾。Ku等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(14)：6552-6556(1995))公開了基于細胞色素b562的抗體的備選方案。Ku等人(1995)建立了細胞色素b562的兩個環(huán)隨機化的文庫，并選擇針對牛血清白蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)個體突變體選擇性結(jié)合BSA，類似于抗BSA抗體。Lipovsek等人(美國專利6,818,418和7,115,396)公開了抗體模擬物，其以纖連蛋白或類纖連蛋白的蛋白骨架和至少一個可變環(huán)為特征。被稱為Adnectins，這些基于纖連蛋白的抗體模擬物展現(xiàn)很多與天然或工程抗體相同的特性，包括對任何靶配體的高親和力和特異性?？梢允褂眠@些抗體模擬物用于進化新的或改善的結(jié)合蛋白的任何技術(shù)。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)類似于IgG重鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu)。因此，這些模擬物顯示在性質(zhì)上類似的抗原結(jié)合性質(zhì)和類似于天然抗體的親和力。進一步地，這些基于纖連蛋白的抗體模擬物展現(xiàn)某些相對抗體和抗體片段的益處。例如，這些抗體模擬物對于天然折疊穩(wěn)定性不依賴于二硫鍵，并且因此在通常破壞抗體的條件下穩(wěn)定。此外，因為這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)類似于IgG重鏈的結(jié)構(gòu)，因此可以體外使用環(huán)的隨機化和改組(shuffling)過程，其類似于抗體的體內(nèi)親和力成熟過程。Beste等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(5)：1898-1903(1999))公開了基于脂鈣蛋白骨架的抗體模擬物脂鈣蛋白由具有在蛋白末端的四個高變環(huán)的β-桶構(gòu)成。Beste(1999)，將所述環(huán)隨機突變并且選擇與例如，熒光素的結(jié)合。三個變體展示與熒光素的特異結(jié)合，其中一個變體顯示類似于抗熒光素抗體的結(jié)合。進一步分析揭示所有隨機化的位置是可變的，表明將適于用作抗體的備選物。是小的，單鏈肽，典型地有介于160和180之間的殘基，其提供一些相對抗體的優(yōu)勢，包括減少的生產(chǎn)成本，增加的儲藏穩(wěn)定性和減少的免疫反應(yīng)。Hamilton等人(美國專利5,770,380)公開了使用剛性的環(huán)芳烴的非肽有機骨架的合成的抗體模擬物，所述骨架與多個用作結(jié)合位點的可變肽環(huán)連接。所述肽環(huán)全都幾何學(xué)上從環(huán)芳烴的同側(cè)伸出，彼此互不干擾。由于該幾何學(xué)確認(rèn)，所有環(huán)可用于結(jié)合，增加對于配體的結(jié)合親和力。然而，在與其它抗體模擬物的比較中，所述基于環(huán)芳烴的抗體模擬物不僅由肽構(gòu)成，并且因此其不易于被蛋白酶攻擊。骨架不完全由肽，DNA或RNA構(gòu)成，意味著該抗體模擬物在極端環(huán)境條件下相對穩(wěn)定并且具有長的壽命。進一步地，因為基于環(huán)芳烴的抗體模擬物相對小，其不太可能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Murali等人(CellMolBiol49(2)：209-216(2003))討論了將抗體簡化為更小的模擬肽的方法，他們稱其為“類抗體結(jié)合模擬肽”(ABiP)，其也可以用作抗體的備選物。除了非免疫球蛋白的蛋白框架區(qū)之外，已經(jīng)以包含RNA分子和非天然寡聚物的化合物(例如，蛋白酶抑制劑，苯二氮，嘌呤衍生物和β-轉(zhuǎn)角模擬物)模擬抗體性質(zhì)。備選地，已知的，例如，鏈霉親和素和生物素之間的結(jié)合相互作用，可以用于將麥醇溶蛋白融合蛋白結(jié)合于固體支持物。用于將麥醇溶蛋白融合蛋白連接于固體支持物的其它方法包括使用同型雙功能和異型雙功能接頭。零長度交聯(lián)試劑誘導(dǎo)兩個配體的直接綴合而不引入任何外來物質(zhì)。催化二硫鍵形成的試劑屬于該目錄。另一個實例是誘導(dǎo)羧基和主要氨基基團縮合以形成酰胺鍵的試劑，比如碳二亞胺，氯甲酸乙酯，Woodward’s試劑K1，羰二咪唑，等。同型雙功能試劑攜帶兩個相同的功能基團，而異型雙功能試劑包含兩個不相似的功能基團。大多數(shù)異型雙功能交聯(lián)劑包含主要的酰胺反應(yīng)基團和巰基反應(yīng)基團。由Heindel，N.D.等人，BioconjugateChem.2，427-430(1991)公開了對于甲酰與巰基偶聯(lián)的新穎的異型雙功能接頭。在一個優(yōu)選的實施方案中，共價交聯(lián)劑選自能夠形成二硫橋(-S-S-)，乙二醇橋(-CH(OH)-CH(OH)-)，偶氮橋(-N＝N-)，砜橋(-S(＝O2)-)，或酯橋(-C(＝O)-O-)的試劑。用Luminex染料內(nèi)部染色的，存在于順磁乳膠珠表面上的羧酸基團，可以通過N-環(huán)己基-N′-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺甲基-p-甲苯磺酸酯(CMC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的作用轉(zhuǎn)變?yōu)镹-羥基琥珀酰亞胺酯。磁性分離和洗滌后，將麥醇溶蛋白融合蛋白和tTG的混合物加入去污劑和包含10mMCaCl2的pH7.4的緩沖鹽水。懸液在室溫震蕩孵育1小時。洗滌后，封閉珠以減少非特異結(jié)合并隨后儲存于粒子稀釋劑。III診斷具有乳糜瀉的受試者的方法在一些實施方案中，本發(fā)明提供診斷具有乳糜瀉的受試者的方法。所述方法包括將來自受試者的體液樣品與本發(fā)明的抗原接觸，所述抗原包括含有六聚體的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白，所述六聚體具有SEQIDNO：3的序列。所述方法還包括檢測任何特異結(jié)合抗原的抗體，從而表明受試者中乳糜瀉的存在。本發(fā)明的樣品可以是任何體液。在一些實施方案中，所述樣品可以是水質(zhì)的體液，膽汁，血液和血漿，母乳，間質(zhì)液，淋巴液，粘液，胸膜液，膿液，唾液，血清，汗液，淚液，尿液，腦脊液，滑液或胞內(nèi)液。在一些實施方案中，所述樣品是血液樣品。本發(fā)明的受試者可以是任何哺乳動物。在一些實施方案中，所述受試者可以是靈長類(例如，人)，牛，綿羊，山羊，馬，狗，貓，兔，大鼠，小鼠，等。在其它實施方案中，所述受試者是人?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法檢測結(jié)合于固體支持物固定的麥醇溶蛋白融合蛋白或tTG-麥醇溶蛋白融合蛋白復(fù)合物的抗體的存在。在一些實施方案中，檢測步驟可以使用測定(比如ELISA，RIA或免疫熒光測定)進行。在其它實施方案中，檢測步驟可以使用酶促方法進行?？梢栽跈z測步驟使用的免疫測定包括，例如，競爭和非競爭測定系統(tǒng)，比如蛋白質(zhì)印跡，放射免疫測定，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)，“夾心”免疫測定，免疫沉淀測定，沉淀素反應(yīng)，凝膠擴散沉淀素反應(yīng)，免疫擴散測定，凝集試驗，補體結(jié)合試驗，免疫放射測定試驗，熒光免疫測定，蛋白A免疫測定，等。參見，例如，Harlow和Lane，UsingAntibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork(1999)。特異于抗原的抗體可以是任何合適的抗體。在一些實施方案中，所述抗體可以是IgA，IgD，IgE，IgG或IgM。在其它實施方案中，所述抗體可以是IgG或IgA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它抗體用于本發(fā)明。IV試劑盒在一些實施方案中，本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒包括如上文描述的抗原，其中所述重組脫酰胺化麥醇溶蛋白包括與SEQIDNO：3序列基本上相同的或具有SEQIDNO：3序列的六聚體，檢測試劑，和任選地緩沖劑，鹽，穩(wěn)定劑和說明書中的至少一種。用于本發(fā)明的緩沖劑，鹽和穩(wěn)定劑包括技術(shù)人員已知的那些，并可以在Gennaro，編輯，Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版，MackPublishingCo.(Easton，Pa.)1990中找到。V實施例實施例1.帶有His標(biāo)簽的D2-六聚體的純化可以使用天然或變性條件純化帶有His標(biāo)簽的D2-六聚體。在本實施例中，在用8M脲的變性條件純化D2-六聚體。制備了“典型的”帶有His標(biāo)簽的D2-六聚體，其中所述蛋白具有SEQIDNO：7的序列。此外，制備了“包含賴氨酸的”帶有His標(biāo)簽的D2-六聚體，其中所述蛋白具有SEQIDNO：8的序列。典型的重組六聚體的純化。將來自6升過表達六聚體的大腸桿菌培養(yǎng)物的溶解的細胞以約5ml/g濕重懸于平衡緩沖液(100mMNaH2PO4，8M脲，500mMNaCl，10mM咪唑，pH8.0)。室溫攪拌30分鐘之后，通過離心除去細胞碎片。將約200ml上清加入25ml用平衡緩沖液預(yù)洗滌的Ni-NTA樹脂，并在室溫混合60分鐘。從未結(jié)合的細胞溶菌液分離結(jié)合于樹脂的六聚體蛋白，然后用100ml洗滌緩沖液(100mMNaH2PO4，8M脲，500mMNaCl，20mM咪唑，0.5％TritonX100，pH8.0)洗滌四次。在從樹脂移除洗滌緩沖液之后，用四體積的20ml洗脫緩沖液(100mMNaH2PO4，8M脲，200mMNaCl，250mM咪唑，pH7.5)洗脫結(jié)合的六聚體蛋白。匯集洗脫的蛋白級分，濃縮，并用10mMMOPS，150mMNaCl(pH7.4)透析。通過在15kxg離心移除觀察到的任何沉淀?？梢赃M一步用尺寸排阻柱，用10mMMOPS，150mMNaCl(pH7.4)純化親和純化的蛋白，用UV在230nm監(jiān)控。匯集并濃縮包含第一主峰的級分。包含賴氨酸的D2-六聚體重組蛋白的純化方法與典型的重組六聚體的純化方法相同。純化的典型或包含賴氨酸的六聚體蛋白的表征。通過SDS-PAGE凝膠電泳分析親和純化的蛋白(圖1)。通過SDS-PAGE分析在如上文描述的尺寸排阻柱上進一步純化的D2-六聚體(圖1)。出乎意料的，兩種六聚體(典型的和包含賴氨酸的)顯示大約45kd的主帶，與六聚體蛋白的三聚體的大小相應(yīng)。六聚體的該聚集這么強，以至于在用于SDS-PAGE的變性條件下不分離。此外，在尺寸排阻色譜中，兩種六聚體蛋白在約45kd的位置的遷移。不限制于特定理論，六聚體的另人驚訝的聚集以形成六聚體的三聚體的傾向可以促進D2六聚體的改善的免疫反應(yīng)性。實施例2.重組脫酰胺化麥醇溶蛋白抗原的制備本實施例提供用于制備“典型的”His-標(biāo)簽標(biāo)記的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白(SEQIDNO：7)的方案。重組脫酰胺化麥醇溶蛋白肽(DGP)抗原在磁珠上的固定將10mg羧基修飾的磁珠置于微量離心管中。向管中加入1000μL于70％乙醇(EtOH)中50mM2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)pH6.1。渦旋管并且磁性分離珠。吸出上清并棄去。再重復(fù)一次該洗滌步驟。將500μL的溶于含有50mMMES，pH6.1的70％EtOH中的120mMN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入含有珠的管并混合。將500μL溶于含有50mMMES，pH6.1的70％EtOH的N-環(huán)己基-N′-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺甲基-p-甲苯磺酸酯(CMC)加入具有珠的相同的管并混合。在室溫孵育管30分鐘，同時不斷混合。將珠從上清中分離并且加入1000μL溶于10％EtOH的5mMMESpH6.1?；旌现?，磁性分離并且吸出上清并棄去。再重復(fù)一次該洗滌步驟。通過加入250μL的5mMMESpH6.1重懸洗滌的珠并混合。將重組DGP抗原(如之前描述制備的)在珠偶聯(lián)緩沖液(包含去污劑的緩沖鹽水)中混合以獲得加入珠的5μg/mg的包被濃度。將該混合物在室溫孵育60分鐘，伴之以連續(xù)混合。將1000μL的包被后洗滌緩沖液(包含去污劑，氯化鈣和防腐劑的緩沖鹽水)加入管并混合。磁性分離珠并吸出上清并棄去。再重復(fù)該過程3次。珠封閉將1000μL封閉緩沖液(包含去污劑，氯化鈣，防腐劑和封閉劑的緩沖鹽水)加入管。在2-8℃孵育管并混合。在孵育的最后磁性分離珠并且吸出上清并棄去。通過向管中加入1000μL粒子稀釋劑用粒子稀釋劑(包含去污劑，氯化鈣，防腐劑和封閉劑的緩沖鹽水)洗滌珠?；旌现椴⑶掖判苑蛛x珠并且吸出上清并棄去。重復(fù)該過程3次以上。將1000μL粒子稀釋劑(100μL/mg粒子)加入管并在該緩沖液中儲藏于2-8℃。實施例3.使用重組DGP抗原檢測乳糜瀉本實施例提供用于使用典型His-標(biāo)簽標(biāo)記的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白(SEQIDNO：7)作為抗原檢測乳糜瀉的方法。乳糜瀉病IgA和IgG免疫測定方案的概要：儀器，BioPlex2200(由Bio-RadLaboratories制造)從樣品管中吸取5μL樣品并分配入追加有45μL洗滌緩沖液(包含去污劑和防腐劑的磷酸緩沖鹽水)反應(yīng)容器(RV)。將100μL樣品稀釋液(包含去污劑，防腐劑和封閉劑的緩沖鹽水)加入RV，隨后加入150μL洗滌緩沖液。在37℃孵育RV130秒。將100μL粒子試劑(于粒子稀釋液中的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白包被的珠的溶液)加入RV。最終樣品稀釋度為1/80。將該混合物在37℃孵育1180秒，伴之以間斷混合。用600μL，隨后300μL，隨后600μL的洗滌緩沖液洗滌珠三次，每次洗滌之后磁性分離。將50μL綴合試劑(于綴合稀釋液(包含去污劑，防腐劑和封閉劑的緩沖鹽水)中的抗人IgA/IgG-藻紅蛋白混合物)加入RV。將混合物在37℃孵育600秒，同時間斷混合。用600μL，隨后300μL，隨后600μL的洗滌緩沖液洗滌珠三次，每次洗滌之后磁性分離。將50μL洗滌緩沖液加入RV以重懸珠。將珠重懸液吸入LuminexDetectormodule(LDM)并且測量每個指定的珠區(qū)域的粒子的熒光中值。圖2顯示DGP典型六聚體的包被滴定。乳糜瀉病測試中的靈敏度表1顯示對于正常和乳糜瀉陽性樣品在不同DGP六聚體濃度下檢測的信號量(相對熒光強度，RFI)。表1.對于“典型”DGP的RFI和DGP包被濃度乳糜瀉樣品的分析以下一致性研究由62個乳糜瀉病樣品組成。表2顯示DGP六聚體和判定(Predicate)方法的比較結(jié)果。表2.使用“典型”DGP的62個乳糜瀉病樣品的一致性研究對正常和乳糜瀉患者樣品使用DGP六聚體測量相對熒光強度(RFI)(表3)。通過抗體指數(shù)(AI)評估患者免疫反應(yīng)性，其中陽性反應(yīng)性為＞1.0。表3.對于正常和乳糜瀉患者樣品使用“典型”DGP的RFI和AI數(shù)據(jù)實施例4.使用具有額外賴氨酸的重組DGP抗原檢測乳糜瀉在本實施例中，測試“包含賴氨酸的”D2六聚體蛋白(具有在接近N端區(qū)域的位置14用賴氨酸置換谷氨酸殘基的His-標(biāo)簽標(biāo)記的重組脫酰胺化麥醇溶蛋白肽)(SEQIDNO：8)對于乳糜瀉的靈敏度。以如在實施例2中描述的相同方式完成該抗原在磁珠上的固定。圖3顯示包含賴氨酸的DGP六聚體的包被滴定。使用該抗原通過免疫測定檢測乳糜瀉以如在實施例3中對于“典型”六聚體蛋白描述的相同的方式進行。乳糜瀉病測試中的靈敏度表4顯示在不同DGP六聚體濃度下對于正常和乳糜瀉陽性樣品的RFI。表4.對于“包含賴氨酸的”DGP的RFI和DGP包被濃度乳糜瀉樣品的分析表5顯示對于正常和乳糜瀉患者樣品如由DGP六聚體測量的相對熒光強度(RFI)。通過抗體指數(shù)(AI)評估患者免疫反應(yīng)性，其中陽性反應(yīng)性為＞1.0。表5.對于正常和乳糜瀉患者樣品使用“包含賴氨酸的”DGP的RFI和AI數(shù)據(jù)實施例5.DGP三聚體相對DGP六聚體的比較研究以下一致性研究由比較了DGP六聚體相對于之前描述的麥醇溶蛋白抗原(D2三聚體重組融合蛋白(之前在US2009/0311727中描述，本文通過引用并入))的預(yù)測值的62個乳糜瀉病樣品組成。DGP六聚體相對DGP三聚體顯示改善的陽性一致和總一致(表6)。這些結(jié)果證明與DGP三聚體比較時，DGP六聚體改善的靈敏度。表6.比較一致性研究與DGP三聚體比較(其產(chǎn)生很多假陽性結(jié)果)，DGP六聚體還另人驚訝地顯示改善的特異性。通過使用DGP六聚體排除該問題。。表7顯示來自407個正常樣品的篩選的數(shù)據(jù)。DGP三聚體給出25％的假陽性，而DGP六聚體僅給出0.5％假陽性。對于假陽性檢測的特異性≤1％。表7.正常樣品的篩選DGP三聚體DGP六聚體總樣品407407假陽性1022圖4a和4b顯示與DGP三聚體相比改善的DGP六聚體的性能。在這些研究中，DGP六聚體的珠包被濃度比DGP三倍體小5倍，而截止值RFI信號相同。與重組DGP三聚體相比，在IgA(圖4a)和IgG(圖4b)兩種測定中，重組DGP六聚體都具有改善的靈敏度。盡管為了理解清楚的目的已通過說明和實施例比較詳細得描述了在前的發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)實施某些改變和修飾。此外，本文提供的各個參考文獻以如每個參考文獻單獨通過引用并入相同的程度以其整體通過引用并入本文。當(dāng)前第1頁1 2 3