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一種鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法與流程

文檔序號:11809436閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:將來源于厚垣普奇尼亞菌的不含內含子的黃素氯代酶基因導入大腸桿菌中;誘導大腸桿菌表達黃素氯代酶;向已表達黃素氯代酶的大腸桿菌培養(yǎng)體系中加入羥基苯并吡啶;黃素氯代酶催化羥基苯并吡啶形成鄰位氯代羥基苯并吡啶。

2.根據(jù)權利要求1所述的鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:包括以下步驟:

(1)克隆來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶基因:提取厚垣普奇尼亞菌的總RNA,合成所述總RNA對應的cDNA,以cDNA為模板通過聚合酶鏈式反應擴增得到不含有內含子的黃素氯代酶基因片段;將所獲黃素氯代酶基因片段連接到質粒載體中獲得重組表達質粒;

(2)構建重組表達來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶的工程菌P:將步驟(1)所獲得的重組表達質粒導入大腸桿菌中,即得所需的重組表達來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶的工程菌P;

(3)轉化重組表達質粒的工程菌P對羥基苯并吡啶的催化轉化:將步驟(2)獲得的工程菌P培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中,當工程菌P生長至對數(shù)生長期時加入誘導劑誘導表達黃素氯代酶1~5小時,加入羥基苯并吡啶甲醇溶液使羥基苯并吡啶在培養(yǎng)基中的濃度為0.01~0.05g/L;繼續(xù)培養(yǎng)24~72小時,獲得鄰位氯代羥基苯并吡啶。

3.根據(jù)權利要求2所述的鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:所述步驟(1)中聚合酶鏈式反應所用的F引物為5'-aaCATATGTCGGTACCCAAGTCTTG-3'和R引物為5'-aaAAGCTTAACTTTGTTGAGGCCAA-3'。

4.根據(jù)權利要求2所述的鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:步驟(1)中所述質粒載體為pET28a,將黃素氯代酶基因片段連接到質粒載體中所用的限制性內切酶為NdeI和HindIII;步驟(3)中所述誘導劑為IPTG。

5.根據(jù)權利要求4所述的鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:培養(yǎng)工程菌P所用培養(yǎng)基中含有濃度為20~80ug/mL的卡那霉素。

6.根據(jù)權利要求2所述的鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:步驟(2)中所述大腸桿菌為大腸桿菌工程菌BL21(DE3)。

7.根據(jù)權利要求2所述的鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:步驟(3)中所述羥基苯并吡啶為3-羥基苯并吡啶、5-羥基苯并吡啶、6-羥基苯并吡啶和7-羥基苯并吡啶中的其中一種。

8.根據(jù)權利要求2所述的鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:步驟(3)中加入誘導劑后,工程菌P的培養(yǎng)溫度為28℃。

9.根據(jù)權利要求2所述的鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:所述方法還包括步驟(4)純化鄰位氯代羥基苯并吡啶:將步驟(3)中所得的培養(yǎng)基固液分離獲得菌體細胞和發(fā)酵液;向發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯進行萃??;向菌體細胞中加入0.2倍發(fā)酵液體積的甲醇進行萃??;合并來源于發(fā)酵液和菌體細胞的萃取液,并且進行減壓蒸餾濃縮,濃縮后的產物溶解于甲醇中;在液相色譜上用C18色譜柱對濃縮后產物的甲醇溶液進行分離,獲得鄰位氯代羥基苯并吡啶。

10.根據(jù)權利要求9所述的鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法,其特征在于:所述液相色譜分離中,用流速為1mL/min的包含0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫,在30分鐘內,乙腈-水的體積比由5:95逐漸提高到50:50,收集產物的流出液。

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