本發(fā)明涉及一種生物技術領域，特別是涉及鄰位氯代羥基苯并吡啶的合成方法。

背景技術：

羥基苯并吡啶是多種藥物及農藥的通用前體化合物，如8-羥基苯并吡啶的多個衍生物都具有治療老年癡呆癥的功效。氯代作用是一種非常常見的藥物化合物修飾作用，上千種的氯代修飾化合物已經被廣泛地應用于臨床，或正在被開發(fā)為臨床藥物，如金雞納堿(抗瘧疾)、孟魯司特(治療哮喘)等。傳統的氯代修飾化合物的獲得通常采用化學合成的方法，這些方法一般需要消耗有毒化學試劑，并且需要高溫、高壓等極端條件，對環(huán)境的危害很大，產生了安全隱患，同時，由于化學加氯方法對位點的選擇性較差，給后續(xù)的產物純化過程帶來較大困難，增加了生產成本。生物加氯方法由于其位點選擇性較好，不需有毒化學試劑，可在常溫、常壓下完成反應，正成為研究的熱點，在不久的將來，將逐步取代傳統的化學加氯方法。

技術實現要素：

為了克服現有技術的不足，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法，該方法具有取代位點特異性高，產物產率高，不受原料來源限制，操作過程易控制，生產成本低等優(yōu)點。

實現本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術方案達到：

一種鄰位氯代羥基苯并吡啶的生物轉化合成方法，包括：將來源于厚垣普奇尼亞菌的不含內含子的黃素氯代酶基因導入大腸桿菌中；誘導大腸桿菌表達黃素氯代酶；向已表達黃素氯代酶的大腸桿菌培養(yǎng)體系中加入羥基苯并吡啶；黃素氯代酶催化羥基苯并吡啶形成鄰位氯代羥基苯并吡啶。

優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

(1)克隆來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶基因：提取厚垣普奇尼亞菌的總RNA，合成所述總RNA對應的cDNA，以cDNA為模板通過聚合酶鏈式反應擴增得到不含有內含子的黃素氯代酶基因片段；將所獲黃素氯代酶基因片段連接到質粒載體中獲得重組表達質粒；

(2)構建重組表達來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶的工程菌P：將步驟(1)所獲得的重組表達質粒導入大腸桿菌中，即得所需的重組表達來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶的工程菌P；

(3)轉化重組表達質粒的工程菌P對羥基苯并吡啶的催化轉化：將步驟(2)獲得的工程菌P培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，當工程菌P生長至對數生長期時加入誘導劑誘導表達黃素氯代酶1～5小時，加入羥基苯并吡啶的甲醇溶液使羥基苯并吡啶在培養(yǎng)基中的濃度為0.01～0.05g/L；繼續(xù)培養(yǎng)24～72小時，獲得鄰位氯代羥基苯并吡啶。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中聚合酶鏈式反應所用的F引物為5'-aaCATATGTCGGTACCCAAGTCTTG-3'和R引物為5'-aaAAGCTTAACTTTGTTGAGGCCAA-3'。該引物用于黃素氯代酶具有特異性高的優(yōu)點。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述質粒載體為pET28a，將黃素氯代酶基因片段連接到質粒載體中所用的限制性內切酶為NdeI和HindIII；步驟(3)中所述誘導劑為IPTG。

優(yōu)選地，培養(yǎng)工程菌P所用培養(yǎng)基中含有濃度為20～80ug/mL的卡那霉素。加入卡那霉素能夠用于防止雜菌的生長，且用于篩選工程菌P的作用，使不帶有pET28a質粒載體的細菌無法生長。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述大腸桿菌為大腸桿菌工程菌BL21(DE3)。

優(yōu)選地，步驟(3)中所述羥基苯并吡啶為3-羥基苯并吡啶、5-羥基苯并吡啶、6-羥基苯并吡啶和7-羥基苯并吡啶中的其中一種。

優(yōu)選地，步驟(3)加入誘導劑后，工程菌P的培養(yǎng)溫度為28℃。

優(yōu)選地，所述方法還包括步驟(4)純化鄰位氯代羥基苯并吡啶：將步驟(3)中所得的培養(yǎng)基固液分離獲得菌體細胞和發(fā)酵液；向發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯進行萃?。幌蚓w細胞中加入0.2倍發(fā)酵液體積的甲醇進行萃??；合并來源于發(fā)酵液和菌體細胞的萃取液，并且進行減壓蒸餾濃縮，濃縮后的產物溶解于甲醇中；在液相色譜上用C18色譜柱對濃縮后產物的甲醇溶液進行分離，獲得鄰位氯代羥基苯并吡啶。

優(yōu)選地，包括以下步驟：所述液相色譜分離中，用流速為1mL/min的包含0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由5:95逐漸提高到50:50，收集產物的流出液。

相比現有技術，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的利用轉基因技術，將黃素氯代酶轉入到大腸桿菌中，利用生物合成方法生產鄰位氯代羥基苯并吡啶。該方法具有不需要極端反應條件，綠色環(huán)保，氯取代位點特異性高，產物產率高，不受原料來源限制，生產成本低等優(yōu)點。

2、本發(fā)明采用了大腸桿菌和pET28a質粒載體、限制性內切酶為NdeI和HindIII、以及IPTG誘導劑。該體系容易操作，而且體系成熟，穩(wěn)定性好，使本發(fā)明方案易于產業(yè)化。

3、本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中直接催化羥基苯并吡啶而獲得鄰位氯代羥基苯并吡啶，減少了提純酶的操作步驟，保證了酶的活力，有效提高了生產效率和降低了生產成本。

附圖說明

圖1：七種羥基苯并吡啶的結構。

圖2：四種鄰位氯代羥基苯并吡啶的結構。

圖3：使用液相色譜純化四種鄰位氯代羥基苯并吡啶過程的檢測結果。圖4：四種鄰位氯代羥基苯并吡啶的質譜檢測結果。

具體實施方式

下面，結合附圖以及具體實施方式，對本發(fā)明做進一步描述：

實施例1

克隆來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶基因

其步驟如下：將厚垣普奇尼亞菌菌種接種到PDB肉湯培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)4天，過濾收集菌絲體，用液氮預凍菌絲體后研磨，利用植物總RNA提取試劑盒提取菌絲體中的總RNA，以提取到的厚垣普奇尼亞菌總RNA作為模板，使用cDNA合成試劑盒合成上述總RNA對應的cDNA，之后，以合成的cDNA作為模板，使用F引物5'-aaCATATGTCGGTACCCAAGTCTTG-3'和R引物5'-aaAAGCTTAACTTTGTTGAGGCCAA-3'通過聚合酶鏈式反應擴增得到不含有內含子的黃素氯代酶基因片段，通過限制性核酸內切酶NdeI和HindIII將上述擴增反應得到的基因片段連接到質粒載體pET28a中，即得本發(fā)明所需的插入了來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶基因的重組表達質粒；上述聚合酶鏈式反應的體系包括：10×擴增緩沖液10uL，4種dNTP混合物各200μmol/L，2種引物各10pmol，模板cDNA0.5ug，高保真DNA聚合酶2.5酶活力單位，加雙蒸水至100uL；反應的條件為98℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，30個循環(huán)。

上述的厚垣普奇尼亞菌(Pochonia chlamydosporia)購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，編號為ATCC 16683；植物總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、大腸桿菌表達質粒pET28a、高保真DNA聚合酶、限制性核酸內切酶NdeI和HindIII及聚合酶鏈式反應所需生化試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；F引物和R引物訂購自生工生物工程(上海)股份有限公司；所述的PDB肉湯培養(yǎng)基及其它生化試劑購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

實施例2

重組表達來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶的工程菌P的構建

其步驟如下：參照《分子生物學實驗指導》(第2版)介紹的方法，將上述實施例1中插入了來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶基因的重組表達質粒，通過氯代鈣介導的化學轉化方法導入大腸桿菌工程菌BL21(DE3)中，即得本發(fā)明所需的重組表達來源于厚垣普奇尼亞菌的黃素氯代酶的工程菌P。

大腸桿菌工程菌BL21(DE3)及所需生化試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。

實施例3

轉化重組表達質粒的工程菌P對3-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：從保存有轉化重組表達質粒的工程菌P的LB固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落于3mL含50ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基之中，于37℃，200轉/分鐘培養(yǎng)12小時，即得工程菌P的種子培養(yǎng)基；然后取1mL工程菌P的種子培養(yǎng)基加入到1L含有50ug/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，200轉/分鐘培養(yǎng)，當該培養(yǎng)基在600納米處的吸光度值達0.5時，向培養(yǎng)基中加入終濃度為200uM的蛋白表達誘導劑IPTG，將該培養(yǎng)基在28℃，200轉/分鐘培養(yǎng)3小時，向培養(yǎng)基中加入溶解于400uL甲醇的30mg轉化反應的底物3-羥基苯并吡啶(3)，將該培養(yǎng)基在28℃，200轉/分鐘繼續(xù)培養(yǎng)48小時。

分離純化鄰位氯代羥基苯并吡啶

其步驟如下：離心分離上述的培養(yǎng)基得到發(fā)酵液和工程菌菌體細胞，發(fā)酵液用1000mL的乙酸乙酯萃取3次，菌體細胞用200mL的甲醇萃取1次，合并來源于發(fā)酵液和菌體細胞的萃取液，利用旋轉蒸發(fā)儀進行減壓蒸餾濃縮，濃縮后的產物溶解于甲醇，在液相色譜上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm,250mm×4.6mm)分離，用流速為1mL/min的包含0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在30分鐘內，乙腈-水的體積比由5:95逐漸提高到50:50，收集在24-24.6分鐘的流出液，最終從工程菌P的培養(yǎng)物中分離得到8mg(產量8mg/L)純的化合物；對這種化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明這種化合物是3-羥基苯并吡啶的氯代衍生物4-氯-3-羥基苯并吡啶(3a)；3-羥基苯并吡啶的結構如圖1所示，4-氯-3-羥基苯并吡啶的結構如圖2所示，4-氯-3-羥基苯并吡啶的核磁共振數據如表1、2所示；使用液相色譜純化目標化合物過程的檢測結果如圖3所示；4-氯-3-羥基苯并吡啶的質譜檢測結果如圖4所示。

所述LB固體培養(yǎng)基中各組分用量占固體培養(yǎng)基質量用量的百分比分別為：胰蛋白胨1％；酵母提取物0.5％；NaCl 1％；瓊脂2％；pH 7.0；滅菌后添加卡那霉素50ug/mL；所述LB液體培養(yǎng)基中各組分用量占LB培養(yǎng)基質量用量的百分比分別為：胰蛋白胨1％；酵母提取物0.5％；NaCl 1％；pH 7.0；

上述的轉化反應的底物3-羥基苯并吡啶購自Sigma-Aldrich生物科技有限公司(中國)，其它生化試劑購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，其它化學試劑購自杭州華東醫(yī)藥集團有限公司。

實施例4

轉化重組表達質粒的工程菌P對5-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：培養(yǎng)工程菌P所用培養(yǎng)基中含有濃度為80ug/mL的卡那霉素；IPTG誘導時間為1小時；向轉化重組表達質粒的工程菌P的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為5-羥基苯并吡啶(5)，所述培養(yǎng)基中5-羥基苯并吡啶(5)的濃度為0.01g/L，加入5-羥基苯并吡啶(5)后培養(yǎng)24小時，獲得鄰位氯代羥基苯并吡啶；用液相色譜對轉化產物進行純化，收集在12.4-14分鐘的流出液，最終從工程菌P的培養(yǎng)物中分離得到6.4mg(產量6.4mg/L)純的化合物，其它操作同實施例3；對這種化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明這種化合物是5-羥基苯并吡啶的氯代衍生物6-氯-5-羥基苯并吡啶(5a)；5-羥基苯并吡啶的結構如圖1所示，6-氯-5-羥基苯并吡啶的結構如圖2所示，6-氯-5-羥基苯并吡啶的核磁共振數據如表1、2所示；使用液相色譜純化目標化合物過程的檢測結果如圖3所示；6-氯-5-羥基苯并吡啶的的質譜檢測結果如圖4所示。

實施例5

轉化重組表達質粒的工程菌P對6-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：培養(yǎng)工程菌P所用培養(yǎng)基中含有濃度為20ug/mL的卡那霉素；IPTG誘導時間為5小時；向轉化重組表達質粒的工程菌P的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為6-羥基苯并吡啶(6)，所述培養(yǎng)基中6-羥基苯并吡啶(6)的濃度為0.05g/L，加入6-羥基苯并吡啶(6)后培養(yǎng)72小時，獲得鄰位氯代羥基苯并吡啶；用液相色譜對轉化產物進行純化，收集在12.2-12.8分鐘的流出液，最終從工程菌P的培養(yǎng)物中分離得到9mg(產量9mg/L)純的化合物，其它操作同實施例3；對這種化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明這種化合物是5-羥基苯并吡啶的氯代衍生物5-氯-6-羥基苯并吡啶(6a)；6-羥基苯并吡啶的結構如圖1所示，5-氯-6-羥基苯并吡啶的結構如圖2所示，5-氯-6-羥基苯并吡啶的核磁共振數據如表1、2所示；使用液相色譜純化目標化合物過程的檢測結果如圖3所示；5-氯-6-羥基苯并吡啶的的質譜檢測結果如圖4所示。

實施例6

轉化重組表達質粒的工程菌P對7-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：向轉化重組表達質粒的工程菌P的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為7-羥基苯并吡啶(7)，用液相色譜對轉化產物進行純化，收集在8.5-9.1分鐘的流出液，最終從工程菌P的培養(yǎng)物中分離得到8.6mg(產量8.6mg/L)純的化合物，其它操作同實施例3；對這種化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明這種化合物是7-羥基苯并吡啶的氯代衍生物8-氯-7-羥基苯并吡啶(7a),這是一種新型化合物；7-羥基苯并吡啶的結構如圖1所示，8-氯-7-羥基苯并吡啶的結構如圖2所示，8-氯-7-羥基苯并吡啶的核磁共振數據如表1、2所示；使用液相色譜純化目標化合物過程的檢測結果如圖3所示；8-氯-7-羥基苯并吡啶的的質譜檢測結果如圖4所示。

實施例7

其步驟如下：轉化重組表達質粒的工程菌P對2-羥基苯并吡啶的催化轉化

向轉化重組表達質粒的工程菌P的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為2-羥基苯并吡啶(2)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得2-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

實施例8

轉化重組表達質粒的工程菌P對4-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：向轉化重組表達質粒的工程菌P的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為4-羥基苯并吡啶(4)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得4-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

實施例9

轉化重組表達質粒的工程菌P對8-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：向轉化重組表達質粒的工程菌P的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為8-羥基苯并吡啶(8)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得8-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

實施例10

轉化pET28a空質粒載體的工程菌的構建

其步驟如下：參照《分子生物學實驗指導》(第2版)介紹的方法，將pET28a空質粒載體通過氯代鈣介導的化學轉化方法導入大腸桿菌工程菌BL21(DE3)中，即得轉化了pET28a空質粒載體的工程菌K。

大腸桿菌表達質粒pET28a、大腸桿菌工程菌BL21(DE3)及所需生化試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。

實施例11

轉化pET28a空質粒載體的工程菌K對3-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：轉化pET28a空質粒載體的工程菌P的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為3-羥基苯并吡啶(3)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得3-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

實施例12

轉化pET28a空質粒載體的工程菌K對5-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：轉化pET28a空質粒載體的工程菌K的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為5-羥基苯并吡啶(5)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得5-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

實施例13

轉化pET28a空質粒載體的工程菌K對6-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：轉化pET28a空質粒載體的工程菌K的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為6-羥基苯并吡啶(6)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得6-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

實施例14

轉化pET28a空質粒載體的工程菌K對7-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：轉化pET28a空質粒載體的工程菌K的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為7-羥基苯并吡啶(7)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得7-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

實施例15

轉化pET28a空質粒載體的工程菌K對2-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：轉化pET28a空質粒載體的工程菌K的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為2-羥基苯并吡啶(2)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得2-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

實施例16

轉化pET28a空質粒載體的工程菌K對4-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：轉化pET28a空質粒載體的工程菌K的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為4-羥基苯并吡啶(4)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得4-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

實施例17

轉化pET28a空質粒載體的工程菌K對8-羥基苯并吡啶的催化轉化

其步驟如下：轉化pET28a空質粒載體的工程菌K的培養(yǎng)基中加入的轉化反應的底物為8-羥基苯并吡啶(8)，用液相色譜對轉化產物進行純化，未獲得8-羥基苯并吡啶的轉化產物，其它操作同實施例3。

表1：四種鄰位氯代羥基苯并吡啶在CD₃OD中的¹H NMR數據(500MHz)

表2：四種鄰位氯代羥基苯并吡啶在CD₃OD中的¹³C NMR數據(125MHz)

對于本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。