本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液的配制方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的器官型脊髓片培養(yǎng)液，采用傳統(tǒng)的Stoppini培養(yǎng)方法中的培養(yǎng)液組成成分，包括：50％MEM,25mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，25％滅活馬血清，25％Hanks平衡鹽溶液，含25.6g/L葡萄糖，2mmol/L谷氨酰胺。取材來(lái)源為出生1周到2周大鼠，這個(gè)時(shí)期脊髓組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本建立，脊髓組織的分化性能相對(duì)較好。

近年來(lái)，隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，臨床醫(yī)療技術(shù)的深入研究，器官型脊髓片在脊髓疾病的研究中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用，尤其是器官型脊髓片培養(yǎng)為許多脊髓生理、病理以及疾病的研究提供了有效的技術(shù)手段。傳統(tǒng)的器官型脊髓片培養(yǎng)液需要的試劑種類多，相關(guān)費(fèi)用很高。因此，建立一種配方簡(jiǎn)單，成本低廉，簡(jiǎn)便省時(shí)的培養(yǎng)液制作方法尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液具有配方簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

一種大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液的配制方法，包括下述步驟：

1)將15.6g DMEM/F12培養(yǎng)基干粉充分溶解在900ml的雙蒸水中，然后加入1.2g NaHCO₃，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溶液的pH為7.4，加入雙蒸水將培養(yǎng)基溶液定容至1000ml，然后過(guò)濾除菌，250ml/瓶分裝，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)將胎牛血清從冷凍箱中取出后，先置于4℃的冰箱中使其溶解，然后在室溫下使其全融，在溶解的過(guò)程中規(guī)則的搖晃使其混合均勻，將血清置于56℃的水浴鍋中滅活30分鐘，然后用10ml的無(wú)菌離心管分裝成10ml/支，在-20℃的條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

3)按照體積比取步驟1)配制的DMEM/F12培養(yǎng)基85-95ml，向培養(yǎng)基中加入5-15ml的步驟2)配制的胎牛血清，即得大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液；

4)在配制的大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液中加入NaOH或NaHCO₃溶液，調(diào)pH值至7.4，于4℃保存。

進(jìn)一步，所述DMEM/F12是采用DMEM與F12為(1:1)的質(zhì)量比的干粉，培養(yǎng)基干粉購(gòu)自美國(guó)的Thermo公司。

進(jìn)一步，所述胎牛血清購(gòu)自美國(guó)的Gibco公司。

進(jìn)一步，所述步驟1)培養(yǎng)基消毒滅菌采用0.22μm微孔濾器過(guò)濾除菌。

進(jìn)一步，所述步驟4)，NaOH溶液摩爾濃度為1mol/L，NaHCO₃溶液質(zhì)量濃度為5％。

本發(fā)明的大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液能夠在大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)中的應(yīng)用。

上述試劑均為本領(lǐng)域常用市售產(chǎn)品。

本發(fā)明所述大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液采用胎牛血清代替了傳統(tǒng)培養(yǎng)液中的組成成分。這種培養(yǎng)液是特別理想的，由于該種培養(yǎng)液較傳統(tǒng)培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠器官型脊髓片時(shí)，脊髓片更容易存活，而且生長(zhǎng)迅速；此外，該培養(yǎng)液也具有簡(jiǎn)化培養(yǎng)液組分，減低實(shí)驗(yàn)成本，簡(jiǎn)便省時(shí)、易操作等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是脊髓組織片在本發(fā)明培養(yǎng)液體外培養(yǎng)1天顯微鏡鏡像圖；

圖2是脊髓組織片在本發(fā)明培養(yǎng)液體外培養(yǎng)4天顯微鏡鏡像圖；

圖3是脊髓組織片在本發(fā)明培養(yǎng)液體外培養(yǎng)7天顯微鏡鏡像圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但并不作為對(duì)發(fā)明做任何限制的依據(jù)。

一種大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液的配制方法，包括下述步驟：

1)將15.6g DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基干粉充分溶解在900ml的雙蒸水中，然后加入1.2g NaHCO₃，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溶液的pH為7.4，加入雙蒸水將培養(yǎng)基溶液定容至1000ml，然后用0.22μm微孔濾器將其過(guò)濾除菌，然后用消毒滅菌后得250ml/瓶分裝，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)將胎牛血清從冷凍箱中取出后，先置于4℃的冰箱中使其溶解，然后在室溫下使其全融，在溶解的過(guò)程中規(guī)則的搖晃使其混合均勻，將血清置于56℃的水浴鍋中滅活30分鐘，然后用10ml的無(wú)菌離心管分裝成10ml/支，在-20℃的條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

3)按照體積比取步驟1)配制的DMEM/F12培養(yǎng)基85-95ml，向培養(yǎng)基中加入5-15ml的步驟2)配制的胎牛血清，即得大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液；

4)在配制的大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液加入摩爾濃度為1mol/L的NaOH或質(zhì)量濃度為5％的NaHCO₃，調(diào)pH值至7.4，于4℃保存。

原料來(lái)源

配制大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液各種試劑的來(lái)源：

DMEM/F12(1:1)購(gòu)自美國(guó)的Thermo公司。

胎牛血清購(gòu)自美國(guó)的Gibco公司。

其他相關(guān)試劑的來(lái)源：

瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)的Sigma公司。

實(shí)施例

在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，所使用的器皿及其他用具均系滅菌處理，而且所有操作均在無(wú)菌條件下實(shí)施。此外，所有的外科手術(shù)操作均在無(wú)菌的環(huán)境下進(jìn)行。滅菌方法和無(wú)菌操作均屬于本領(lǐng)域的公知技術(shù)。實(shí)施例配制見(jiàn)表1。

表1本發(fā)明的一種大鼠器官型脊髓片培養(yǎng)液實(shí)施例

試驗(yàn)例

需要說(shuō)明的是，下述手術(shù)介入方式獲取大鼠器官型脊髓片過(guò)程不在本發(fā)明培養(yǎng)液保護(hù)范圍內(nèi)，僅用于說(shuō)明本發(fā)明培養(yǎng)液的應(yīng)用。

將上述培養(yǎng)液按如下步驟實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)：

(1)取新鮮的大鼠腰段脊髓，將4％的瓊脂糖凝塊用手術(shù)刀刻出一個(gè)長(zhǎng)方形凹槽，將新鮮的腰段脊髓放入凹槽中，用膠水將腰段脊髓底部與瓊脂糖凹槽底部相粘連，用濾紙將多余的膠水吸盡；

(2)將預(yù)冷的人工腦脊液置于ZQP-86型振動(dòng)切片機(jī)的水槽中，將準(zhǔn)備好的帶有脊髓的瓊脂糖凝塊的底座用膠水粘在振動(dòng)切片機(jī)的載物臺(tái)上，用濾紙吸盡多余的膠水；

(3)用ZQP-86型振動(dòng)切片機(jī)將腰段脊髓切成350μm后的組織片；

(4)在Transwell小室底部加入1ml的脊髓片培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)CO₂培養(yǎng)箱中預(yù)存15分鐘；

(5)用3ml無(wú)菌吸管將完整的脊髓切片轉(zhuǎn)移到transwell小室的插入式培養(yǎng)皿中，每個(gè)插入式培養(yǎng)皿上放5個(gè)脊髓組織片，用移液器將微孔膜上多余的液體吸盡，使得組織片恰好處于氣液交換的平面上；

(6)將Transwell小室放入溫度為37℃的CO₂培養(yǎng)箱中(5％O₂+95％CO₂),每3天換液一次，在倒置顯微鏡下觀察脊髓組織片的生長(zhǎng)狀態(tài)；

(7)培養(yǎng)后的脊髓組織片用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察脊髓片的存活情況，用免疫組化方法鑒定脊髓片的神經(jīng)細(xì)胞。

結(jié)果分析：

(1)器官型脊髓片在倒置相差顯微鏡下觀察

在倒置相差顯微鏡下觀察脊髓組織片存活與生長(zhǎng)情況：體外培養(yǎng)1天時(shí)，可見(jiàn)脊髓片邊界清楚完整，周?chē)胁煌该鞴鈺?，折光性較強(qiáng)，脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)分界不清，見(jiàn)圖1所示；培養(yǎng)的脊髓片4天時(shí)可見(jiàn)脊髓組織片中有細(xì)胞呈放射狀向外遷移，在脊髓組織片外沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞，脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)有模糊的分界線，見(jiàn)圖2所示；體外培養(yǎng)7天時(shí)，脊髓片形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)分明，脊髓灰質(zhì)白質(zhì)分界較清楚，在組織片外可見(jiàn)從組織片向外爬出的大量細(xì)胞，脊髓組織中央管結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，見(jiàn)圖3所示。由于細(xì)胞持續(xù)向外遷移，組織片厚度逐漸變薄，折光性良好，在體外培養(yǎng)5周時(shí)脊髓切片厚度為100-150μm。組織片在體外培養(yǎng)7天后，用臺(tái)盼藍(lán)染色后，幾乎沒(méi)有細(xì)胞被染成藍(lán)色，提示組織片細(xì)胞活性良好。

(2)器官型脊髓組織片免疫組化染色

在脊髓片腹側(cè)可見(jiàn)被SMI-32染色的α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，直徑均大于25微米，細(xì)胞形態(tài)完整。脊髓片可見(jiàn)被NF200染色的軸突，軸突分布于整個(gè)脊髓片，數(shù)量較多，軸突和軸突之間廣泛連接。

本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，在本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所公開(kāi)的技術(shù)內(nèi)容，不需要?jiǎng)?chuàng)造性的勞動(dòng)就可以對(duì)其中的一些技術(shù)特征作出一些替換和變形，這些替換和變形均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。