本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種高產(chǎn)乳酸菌素的嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：我國在飼料中添加抗生素已有近70年的時間，飼料中抗生素的添加對集約化畜牧業(yè)的生產(chǎn)和發(fā)展做出了巨大的貢獻。隨著社會生活水平的提高，人們對健康的重視程度越來越高，近年來人們逐漸發(fā)現(xiàn)抗生素飼料添加劑在帶來巨大經(jīng)濟效益的背后隱藏著日益突出的負(fù)面效應(yīng)，比如抗生素引起的內(nèi)源性感染和二重感染，致病性細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，腸道正常菌群的破壞，畜產(chǎn)品及環(huán)境中的大量的抗生素殘留等問題，這些將對養(yǎng)殖業(yè)、飼料工業(yè)和動物帶來了嚴(yán)重威脅，抗生素通過食物鏈直接危及人類的健康。1986年，瑞典全面禁止在畜禽飼料中使用抗生素，成為第一個不準(zhǔn)使用抗生素作為飼料添加劑的國家，隨后20年，全面禁用抗生素作為飼料添加劑。近年來我國禁止抗生素添加劑在畜牧業(yè)中使用的呼聲越來越高，2015年我國開始禁用部分抗生素。為此，研究和開發(fā)新的抗生素替代品的工作迫在眉睫。近年來，抗生素類替代品酸化劑、植物提取物、益生菌制劑、酶制劑、功能性多糖等的研究與開發(fā)成為近年來綠色飼料添加劑的熱點，其中益生菌制劑的研究成為當(dāng)前畜禽養(yǎng)殖的熱點。益生菌是動物腸道內(nèi)的正常菌群，對動物體沒有毒副作用。其附著在動物腸道內(nèi)，一方面產(chǎn)生一些抑制病原菌生長的物質(zhì)，另外在生長代謝過程中，可以分泌多種酶類，促進動物對飼料的消化吸收，提高料肉比，促進動物健康生長。因此益生菌制劑成為國內(nèi)外業(yè)界研究的熱點。乳酸菌素bacteriocinsoflacticacidbacteria是指乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抗菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)。它們通常可以抑制一些常見的腐敗菌和致病菌，如金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus，大腸桿菌Escherichiacoli，沙門氏菌salmonella，單核細(xì)胞增生李斯特菌Listeriamonocytogenes等。而且大部分乳酸菌乳酸菌素穩(wěn)定性較好，具有耐熱性，而且易于被動物體內(nèi)的蛋白酶降解，不會在體內(nèi)積聚引起不良反應(yīng)，能夠完全代替抗生素的使用，被認(rèn)為是具有廣闊前景的天然食品防腐劑和飼料添加劑。然而一般天然存在的乳酸菌其中乳酸菌素的含量都較低，其中嗜酸乳桿菌也是其中的一種，為此，迫切需要獲得能夠高產(chǎn)乳酸菌素的乳酸菌株。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種高產(chǎn)乳酸菌素的嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用。為達到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：本發(fā)明的一種嗜酸乳桿菌，所述嗜酸乳桿菌的16SrDNA基因序列為SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的一種嗜酸乳桿菌菌株，該菌株為嗜酸乳桿菌株；保藏名稱為嗜酸乳桿菌YY13002；分類名稱為：嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期：2013年8月16日；保藏編號:CGMCCNO.8043。進一步地，所述嗜酸乳桿菌菌株的單菌落接種到MRS培養(yǎng)基上37℃厭氧生長良好,菌落成圓形，直徑大小0.8-2.0mm，較光滑，乳白色或灰白色，革蘭氏染色、鏡檢，菌體較平直或稍長者稍彎，兩端鈍圓，成單或雙存在、無芽孢、革蘭氏染色呈陽性的桿狀。本發(fā)明所述的嗜酸乳桿菌菌株制備的嗜酸乳桿菌菌劑。進一步地，所述的嗜酸乳桿菌菌劑，其活性成分為如下(a)(b)(c)中的至少一種：(a)所述的嗜酸乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物；(b)所得嗜酸乳桿菌細(xì)胞的超聲裂解上清；(c)所得嗜酸乳桿菌細(xì)胞的超聲裂解沉淀。本發(fā)明所述的嗜酸乳桿菌菌劑的制備方法，包括如下步驟：(1)菌株活化：將嗜酸乳桿菌甘油管接種于120mL新鮮液體MRS培養(yǎng)基中，使用150mL三角燒瓶于37℃靜置培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)結(jié)束后菌濃為2*109-6*109cfu/mL之間，(2)發(fā)酵菌劑制備：將上述活化菌株嗜酸乳桿菌接種于液體培養(yǎng)基中，接種至溶液濃度中菌濃為105-106cfu/mL，靜置培養(yǎng)，溫度為37℃，培養(yǎng)24小時，收集含菌體的培養(yǎng)液，制得嗜酸乳桿菌菌劑。本發(fā)明所述的嗜酸乳桿菌在生產(chǎn)用于乳酸菌素中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的嗜酸乳桿菌菌劑在生產(chǎn)用于乳酸菌素中的應(yīng)用。有益效果：本發(fā)明乳酸菌素含量高，該菌株生產(chǎn)的乳酸菌素可以抑制多種條件致病菌株，包括G+菌株和G-菌株，對單核細(xì)胞增生李斯特菌有強烈的抑制性，并對金黃色葡萄菌、沙門氏菌和大腸桿菌具有較強的抑制性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：(1)嗜酸乳桿菌是以一些最常見的腐敗菌和病原菌為指示菌，篩選出產(chǎn)對單核細(xì)胞增生李斯特菌有強烈抑制性的嗜酸乳桿菌菌株，并且通過誘變手段提高其發(fā)酵液中的乳酸菌素活力。(2)本發(fā)明的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)可以產(chǎn)生對多種致病菌有抑制作用的乳酸菌素，并且對李斯特菌有強烈的抑制性。本發(fā)明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043在抑制李斯特氏菌，尤其是單核細(xì)胞增生李斯特菌中的應(yīng)用，以及嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043在抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的應(yīng)用，并且對嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043產(chǎn)生的乳酸菌素進行了測序。(3)該乳酸菌素對胃蛋白酶不敏感，對胰蛋白酶敏感，具有很好的熱穩(wěn)定性，在121℃作用30min，仍然保持較高的活性。該細(xì)菌素在pH2.0-8.0范圍處理30min，均保持很強的抑制指示菌單核細(xì)胞增生李斯特菌CICC21633的能力?？梢詰?yīng)用為具有廣闊前景的天然食品防腐劑及飼料添加劑。附圖說明圖1是本發(fā)明嗜酸乳桿菌的菌落圖；圖2是本發(fā)明嗜酸乳桿菌同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖3是本發(fā)明不同NTG濃度對嗜酸乳桿菌致死曲線圖；圖4是本發(fā)明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043生長曲線圖；圖5是本發(fā)明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043生長中pH變化圖；圖6是嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043不同生長時間上清液對單核細(xì)胞增生李斯特菌抑菌活力變化圖。具體實施方式下面結(jié)合具體的實施方式來進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的一種嗜酸乳桿菌，所述嗜酸乳桿菌的16SrDNA基因序列為SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的一種嗜酸乳桿菌菌株，該菌株為嗜酸乳桿菌株；保藏名稱為嗜酸乳桿菌YY13002；分類名稱為：嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期：2013年8月16日；保藏編號:CGMCCNO.8043。圖1是本發(fā)明嗜酸乳桿菌的菌落圖；所述嗜酸乳桿菌菌株的單菌落接種到MRS培養(yǎng)基上37℃厭氧生長良好,菌落成圓形，直徑大小0.8-2.0mm，較光滑，乳白色或灰白色，革蘭氏染色、鏡檢，菌體較平直或稍長者稍彎，兩端鈍圓，成單或雙存在、無芽孢、革蘭氏染色呈陽性的桿狀。圖2是本發(fā)明嗜酸乳桿菌同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；由此圖可以看出，嗜酸乳桿菌獨樹一支，確定為嗜酸乳桿菌。本發(fā)明所述的嗜酸乳桿菌菌株制備的嗜酸乳桿菌菌劑。所述的嗜酸乳桿菌菌劑，其活性成分為如下(a)(b)(c)中的至少一種：(a)所述的嗜酸乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物；(b)所得嗜酸乳桿菌細(xì)胞的超聲裂解上清；(c)所得嗜酸乳桿菌細(xì)胞的超聲裂解沉淀。本發(fā)明所述的嗜酸乳桿菌菌劑的制備方法，包括如下步驟：(1)菌株活化：將嗜酸乳桿菌甘油管接種于120mL新鮮液體MRS培養(yǎng)基中，使用150mL三角燒瓶于37℃靜置培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)結(jié)束后菌濃為2*109-6*109cfu/mL之間，(2)發(fā)酵菌劑制備：將上述活化菌株嗜酸乳桿菌接種于液體培養(yǎng)基中，接種至溶液濃度中菌濃為105-106cfu/mL，靜置培養(yǎng)，溫度為37℃，培養(yǎng)24小時，收集含菌體的培養(yǎng)液，制得嗜酸乳桿菌菌劑。本發(fā)明所述的嗜酸乳桿菌在生產(chǎn)用于乳酸菌素中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的嗜酸乳桿菌菌劑在生產(chǎn)用于乳酸菌素中的應(yīng)用。實施例1嗜酸乳桿菌野生菌的獲得1.糞樣采集采集上海市航頭鎮(zhèn)某豬場斷奶仔豬新鮮糞樣，放入冷藏盒中，帶回分離篩選備用。2.菌株的分離純化稱取糞樣5g加入45mL滅菌生理鹽水中，充分混勻，取1mL混懸液加入9mL的無菌生理鹽水中，十倍稀釋至10-5、10-6、10-7，取0.1mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基(葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，無水乙酸鈉5g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸二銨2g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.19g，吐溫801mL，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH為6.5)，每個稀釋度三個重復(fù)，37℃厭氧培養(yǎng)48h，挑取單個菌落劃線厭氧純化培養(yǎng)。48h后，將純化后的菌落進行過氧化氫試驗和革蘭氏染色鏡檢，其中過氧化氫試驗陰性、革蘭氏染色陽性的菌株，可以初步判定為乳酸菌，此時將對應(yīng)的單個菌落接入滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)24h，取菌液加入離心管，按照1：1的比例加入30％的甘油，混勻，-70℃冷凍保存?zhèn)溆?。將保存的乳酸菌用接種環(huán)接種在MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48h后，利用點種法，點種5ul，對各種G-，G+病原菌做抑菌試驗，并選取抑菌圈比較明顯的乳酸菌株進行復(fù)篩試驗。初篩后具有抑菌效果的菌株培養(yǎng)于MRS液體培養(yǎng)基中，24h后離心取上清，將上清用過氧化氫酶處理后調(diào)節(jié)PH為6.0，過濾除菌。利用牛津杯雙層瓊脂擴散法，對指示菌進行抑菌試驗。含1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基(蛋白陳10g，酵母提取物5g，氯化納10g，蒸餾水1.0L，pH7.0)按每平皿10mL傾倒在無菌培養(yǎng)皿中，超凈工作臺中冷卻，然后用無菌攝子將牛津杯輕輕放置于培養(yǎng)基上；制備含0.8％瓊脂的LB培養(yǎng)基，冷卻至50℃，按1％的接種量加入單核細(xì)胞增生李斯特菌菌懸液作為上層培養(yǎng)基，傾倒20mL上層培養(yǎng)基于放置好牛津杯的的平板中冷卻，冷卻后將牛津杯取出，將上清液加入小孔中于4℃冰箱中擴散30min，然后取出37℃過夜培養(yǎng)。用游標(biāo)卡尺比較抑菌圈大小。獲得一種對單核細(xì)胞增生李斯特菌有強烈抑制的乳酸菌，命名為YY12-7。實施例2嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)YY12-7的鑒定1.YY12-7菌株形態(tài)學(xué)特性YY12-7菌株接種到MRS培養(yǎng)基上37℃厭氧生長良好,菌落成圓形，直徑大小0.8～2.0mm，較光滑，乳白色或灰白色。革蘭氏染色、鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌體較平直或稍長者稍彎，兩端鈍圓，成單或雙存在、無芽孢、革蘭氏染色呈陽性的桿狀。2.分離菌株YY12-7的種、屬鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》，并對菌株YY12-7進行16sRNA測序。其中菌株生理生化實驗結(jié)果如表1所示，碳源選擇發(fā)酵試驗結(jié)果如表2所示，結(jié)合生理生化和碳源選擇發(fā)酵實驗結(jié)果，并將16S信息進行比對，菌株YY12-7應(yīng)為嗜酸乳桿菌。根據(jù)細(xì)胞顯微形態(tài)、生理生化數(shù)據(jù)和16SrRNA基因序列數(shù)據(jù)，將菌株鑒定為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)。菌株YY12-7的理化試驗結(jié)果如表1所示。菌株YY12-7碳源選擇發(fā)酵試驗結(jié)果如表2所示。表1生化項目YY12-7試驗結(jié)果過氧化氫酶-氧化酶-吲哚-硫化氫試驗-明膠液化-硝酸鹽還原-七葉苷+苦杏仁苷-葡萄糖鹽-Arg水解酶-Arg脫羧酶+表2注：“-”代表不發(fā)酵，“+”代表發(fā)酵設(shè)計特異性引物，用PCR擴增后對該菌的16SrRNA基因序列測定序，與基因庫的標(biāo)準(zhǔn)菌比對，結(jié)果顯示該株菌為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)。實施例3嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)YY12-7誘變篩選獲得高產(chǎn)菌株1.嗜酸乳桿菌菌懸液的制備挑取嗜酸乳桿菌單個菌落接種于120ml/瓶的液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h。然后以5％的接種量，接種于120ml/瓶的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8h至對數(shù)生長期，計數(shù)。2.亞硝基胍(nitroso-guanidin，NTG)誘變適宜菌液濃度的選擇將處于對數(shù)生長期的嗜酸乳桿菌YY12-7懸液進行10倍梯度稀釋，分別制成108，107，106，105cfu/ml的菌懸液；各濃度的20ml菌液中加入NTG溶液，使NTG的終濃度分別為300ug/mL，600ug/mL，900ug/mL，1200ug/mL，1500ug/mL；37℃水浴處理45min，間歇振蕩。到達預(yù)定時間后，用生理鹽水稀釋至100ml，6000min/rpm離心10min，去上清液后再加入100ml生理鹽水離心10min，再重復(fù)一次。然后用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，稀釋梯至104，105，106，然后各取100ul涂布MRS培養(yǎng)基平皿上，每個梯度平行3個，37℃培養(yǎng)36h，計算個濃度的菌落數(shù)及適宜菌液濃度的致死率。致死曲線如圖1所示，結(jié)果表明，以107cfu/ml的菌懸液，加入900ug/mL的NTG誘變效果為佳。圖1為不同NTG濃度致死曲線。圖3是為了說明在不同NTG濃度下對嗜酸乳桿菌的致死情況，本發(fā)明要求NTG對嗜酸乳桿菌的致死率在60％-70％，所以選擇900ug/mL的NTG作為誘導(dǎo)條件。3.紫外(ultraviolet，UV)誘變處理離心30min(6000min/rpm)，用等體積的生理鹽水制作菌懸液，并稀釋至107cfu/ml作為誘變菌懸液。采用功率20W的紫外燈，照射距離調(diào)整為30cm，預(yù)熱30min，取20ml菌懸液置于平皿內(nèi)并攪拌，使用紫外照射50sec，使致死率控制在50％～60％，將處理的樣品作為亞硝基胍(NTG)誘變處理的材料。4.亞硝基胍(nitroso-guanidin，NTG)誘變處理取上述經(jīng)過UV誘變的20ml細(xì)菌懸液加入2.5ml900ug/mL的NTG母液，使致死率控制在60％～80％，置于滅菌的三角瓶中培養(yǎng)40min，分別裝入100ml的離心管內(nèi)5ml，在用生理鹽水補滿100ml，離心20min，去上清夜在加入100ml生理鹽水離心20min，再重復(fù)一次。進行10倍梯度稀釋，取105稀釋梯度涂布100ul于MRS培養(yǎng)基的平皿上，共涂平皿60個。37℃培養(yǎng)48小時。將誘變后的植物乳桿菌用接種環(huán)接于液體MRS中，37℃培養(yǎng)24h。以單核細(xì)胞增生李斯特菌為指示菌，菌濃度為107cfu/ml接于瓊脂含量為0.8％的LB培養(yǎng)基中，分別以點種法初篩，牛津杯法復(fù)篩。獲得一種抑菌圈明顯增大的誘變菌株，將此菌株每隔三天傳代一次，共傳十代，分別比較每代菌株的上清液的抑菌活性，確定所獲得菌株的穩(wěn)定性，將此菌株命名為YY13002。并于2013年08月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCNo8043。實施例4嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043生長狀況的確定1.嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043生長曲線的測定。接1％嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043的24h培養(yǎng)物于新鮮MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，每小時測量OD600值變化。生長曲線如圖2所示，嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043于第3h開始進入對數(shù)期，第18小時起進入平穩(wěn)期。圖4為嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043生長曲線圖。圖4為嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043在新鮮MRS培養(yǎng)基中的24h實時生長曲線，該圖說明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043于第3h開始進入對數(shù)期，第18小時起進入平穩(wěn)期。2.嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043生長中pH變化的確定。接1％嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043的24h培養(yǎng)物于新鮮MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，每小時測量pH值變化。如圖3所示為本發(fā)明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043生長中pH變化圖。圖5為嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043在新鮮MRS培養(yǎng)基中的24h實時生長pH變化曲線。由此圖可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中pH逐步下降，在18h后穩(wěn)定，穩(wěn)定pH為3.6。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中pH逐步下降，在18h后穩(wěn)定，穩(wěn)定pH為3.6。如圖5所示，為本發(fā)明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043生長中pH變化圖。3.嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043生長中抑菌活力變化的確定。接1％嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043的24h培養(yǎng)物于新鮮MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，每小時取樣測量OD600值，離心取上清，將上清調(diào)pH至6.0后各點100ul于含1％單核細(xì)胞增生李斯特菌的效價檢測平板，于37℃過夜培養(yǎng)。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小的變化。如圖6所示，為本發(fā)明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043不同生長時間上清液對單核細(xì)胞增生李斯特菌抑菌活力變化圖。此圖為嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043不同時間發(fā)酵上清調(diào)pH至6.0后對單核細(xì)胞增生李斯特菌的效價檢測，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小的變化。由圖可以看出嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043抑菌活性隨OD600的變化曲線，從OD600為0.67起有抑菌圈，為10.1mm，其中牛津杯的外徑為8.0mm，至OD6005.98后趨于穩(wěn)定，最大為27mm。實施例5嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043抑菌效果及抑菌物質(zhì)鑒定1.嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043發(fā)酵液抑菌物質(zhì)的抑菌能力接1％嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043的24h培養(yǎng)物于新鮮MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)20h，培養(yǎng)后經(jīng)6000rpm/min離心5min后，取上清用過氧化氫酶處理后調(diào)節(jié)PH為6.0，過濾除菌。利用牛津杯雙層瓊脂擴散法，對指示菌進行抑菌試驗。含1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基按每平皿10mL傾倒在無菌培養(yǎng)皿中，超凈工作臺中冷卻，然后用無菌攝子將牛津杯輕輕放置于培養(yǎng)基上；制備含0.8％瓊脂的LB培養(yǎng)基，冷卻至50℃，按1％的接種量加入單核細(xì)胞增生李斯特菌(CICC21633)菌懸液、大腸桿菌(ATCC25922)菌懸液、沙門氏菌(ATCC14028)菌懸液和金黃色葡萄球菌(ATCC6538)作為上層培養(yǎng)基，傾倒20mL上層培養(yǎng)基于放置好牛津杯的的平板中冷卻，冷卻后將牛津杯取出，將上清液加入小孔中于4℃冰箱中擴散30min，然后取出37℃過夜培養(yǎng)，觀察抑菌圈。結(jié)果表明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043發(fā)酵液除對單核細(xì)胞增生李斯特菌(CICC21633)有較強的抑制作用外，對大腸桿菌(ATCC25922)、沙門氏菌(ATCC14028)和金黃色葡萄球菌(ATCC6538)均有不同程度的抑制。抑菌結(jié)果見下表3。嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043發(fā)酵液對不同菌株的抑菌能力如表3所示，表32.嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043發(fā)酵液抑菌物質(zhì)的鑒定本發(fā)明的嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043對單核細(xì)胞增生李斯特菌有強烈的抑制作用，對其它菌株也有相應(yīng)的抑菌能力。推測該菌株可以分泌乳酸菌素，在本發(fā)明中進行了酸、過氧化氫酶和蛋白酶處理等試驗，結(jié)果表明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043對單核細(xì)胞增生李斯特菌CICC21633的抑制作用不受pH和過氧化氫酶的影響；且發(fā)酵液中存在一種抑菌物質(zhì)，該物質(zhì)對胃蛋白酶不敏感，對胰蛋白酶敏感，推測該抑菌物質(zhì)是一種蛋白或多肽物質(zhì)。嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043發(fā)酵液經(jīng)離心后使用離子色譜柱進行分離，根據(jù)不同的出峰進行收集后進行抑菌實驗，取具有抑菌能力的物質(zhì)經(jīng)葡聚糖凝膠G50進行初分，最后經(jīng)制備液相色譜進行細(xì)分，分離后的物質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳確認(rèn)后送至測序公司進行測序，測序后獲得該抑菌物質(zhì)的序列，結(jié)果如下：HQKTLTDKELALISGGKTYYGTNGVHCTKKSLWGKVRLKNVIPGTLCRKQSLPIK為鑒定此序列的正確性，經(jīng)多肽合成公司合成了該肽，然后經(jīng)稀釋后進行抑菌實驗，結(jié)果抑菌圈為22mm，表明此序列測定正確。實施例6嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043分泌的乳酸菌素的生物學(xué)特性研究。1.乳酸菌素對熱的穩(wěn)定性。挑取活化的嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h，發(fā)酵液以6000rpm/min離心5min，收集上清液，過濾除去菌體及其它雜質(zhì)。將上清液分別放置在60℃、80℃、100℃和121℃處理30min，調(diào)節(jié)pH至6.0。按照步驟一所述的牛津杯雙層平板法，在37℃條件下做抑菌試驗，確定不同溫度處理后對乳酸菌素抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌CICC21633活性的影響。溫度對嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043乳酸菌素活性的影響如表4所示，表4結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043對121℃以下的溫度較為穩(wěn)定。2.嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043分泌的乳酸菌素對酸的穩(wěn)定性將嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043發(fā)酵上清液(按照步驟1的方法獲得)分別用lmol/LHCL和lmol/LNaOH調(diào)其pH為2.0-10.0，37℃下培養(yǎng)2h，調(diào)pH為6.0，然后按照步驟一所述的牛津杯雙層平板法做抑菌試驗，測定抑菌物質(zhì)對單核細(xì)胞增生李斯特菌CICC21633的抑菌活性。同等條件下，分別用lmol/LHCL和lmol/LNaOH調(diào)整滅菌后的液體MRS培養(yǎng)基pH為2.0-10.0，37℃下培養(yǎng)3h，調(diào)整pH值為6.0，同樣按照步驟一所述的牛津杯雙層平板法做對照。嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043乳酸菌素對酸的穩(wěn)定性如表5所示，表5結(jié)果如表5可見，嗜酸乳桿菌CGMCCNo8043分泌的乳酸菌素在pH2.0-10.0范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書.說明書及其等效物界定。當(dāng)前第1頁1 2 3